Recombinant farmaceuticals from microbial cells: a 2015 update

Cell factories

Since early recombinant DNA times, ever-increasing understanding of cell physiology and stress, and of factors involved in heterologous gene expression and protein production empowered the use of different living factories, namely prokaryotic and eukaryotic cells, plants or animals . Door gebruik te maken van deze systemen lost de recombinantproductie problemen op in verband met de beschikbaarheid van bronnen, wordt zij beschouwd als een bioveilig en groen proces en biedt zij de mogelijkheid de aminozuursequenties en derhalve de eiwitfunctie te wijzigen, zodat het product beter aan een gewenste functie kan worden aangepast . Er is een breed en groeiend spectrum van expressiesystemen beschikbaar gekomen voor de productie van recombinante eiwitten . Escherichia coli was het overheersende platform toen de biofarmaceutische sector in de jaren tachtig opkwam, en het werd gevolgd door de toepassing van de gist Saccharomyces cerevisiae. Beide systemen en de bijbehorende genetische methodologieën vertonen een ongewoon grote veelzijdigheid, waardoor zij aan verschillende productie-eisen kunnen worden aangepast. Ondanks de verkenning van insectencellen als aanvankelijk succesvol systeem, vooral voor vaccingeoriënteerde eiwitten, zijn zoogdiercellijnen (met name CHO-cellen) tegenwoordig het gangbare van dieren afgeleide celsysteem, omdat zij geschikt zijn om gemakkelijk geglycosyleerde eiwitten te produceren (fig. 1). De mogelijkheid om post translationele modificaties uit te voeren staat in contrast met complexe nutritionele vereisten, trage groei en fragiliteit, en relatief hoge productietijd en -kosten. Van de vele conventionele en opkomende celgebaseerde systemen voor eiwitproductie, zijn bacteriën, gist en zoogdiercellijnen de meest voorkomende in de biofarma, en zowel prokaryote als eukaryote systemen evolueren voortdurend en concurreren om hun eigenschappen te verbeteren en intensiever te worden als platforms bij uitstek voor de productie van eiwitgeneesmiddelen . Hoewel bacteriën hun leidende rol in het begin zijn kwijtgeraakt, wordt ongeveer 30% van de op de markt gebrachte biofarmaceutische producten nog steeds in dit systeem geproduceerd, wat wordt ondersteund door de ongebruikelijke fysiologische en genetische manipuleerbaarheid van prokaryote cellen.

In feite is het belangrijkste doel bij de ontwikkeling van nieuwe platforms voor eiwitproductie het verbeteren van de functionaliteit van geneesmiddelen door het bereiken van succesvolle eiwitvouwing en posttranslationele modificaties, met behoud van de lage complexiteit en hoge flexibiliteit die gepaard gaat met prokaryotische celcultuur. In deze context maken Gram-positieve bacteriën zoals Bacillus megaterium en Lactococcus lactis efficiënte eiwituitscheiding mogelijk bij afwezigheid van endotoxische celwandcomponenten, terwijl filamenteuze schimmels (zoals Trichoderma reesei, ), mos (Physcomitrella patens, ) en protozoa (Leishmania tarentolae, ) glycosyleringspatronen bevorderen die vergelijkbaar zijn met die in zoogdiereiwitten, maar nog steeds gekweekt worden met methoden die eenvoudiger zijn dan die welke vereist zijn voor zoogdiercellen. Uitvoerige beschrijvingen van nieuwe (bacteriële en niet-bacteriële) platforms die specifiek gericht zijn op de productie van hoogwaardige eiwitgeneesmiddelen zijn elders te vinden. De recente ontwikkeling van een endotoxinevrije stam van E. coli en de toepassing daarvan bij de vervaardiging van proteïnen en proteïnematerialen effent het pad voor een kostenefficiënte en veelzijdige productie van proteïnen voor biomedisch gebruik door endotoxineverwijderingsstappen over te slaan, waardoor de bioveiligheid toeneemt en de productiekosten dalen. Hopelijk zullen al deze nieuwe systemen binnenkort verbeterde producten bieden in nog steeds eenvoudige en volledig gecontroleerde biofabricage benaderingen.

Trends in eiwit biofarmaceutica

Bijna 400 recombinant eiwit-gebaseerde producten zijn met succes geproduceerd en goedgekeurd als biofarmaceutica , een term die verwijst naar therapeutische producten gegenereerd door technologieën die levende organismen betrekken . Nog eens 1300 kandidaat-eiwitten zijn in ontwikkeling, waarvan ongeveer 50% in preklinisch onderzoek en de overige 33% in klinische proeven (fig. 2). In deze context is een toename van het aantal goedkeuringen in de komende jaren voorspelbaar. Humuline, een recombinant humaan insuline dat in de jaren ’70 door Eli Lilly & Co werd ontwikkeld en in 1982 in de bacterie E. coli werd geproduceerd, was het eerste biofarmaceutisch product dat (door de FDA) werd goedgekeurd. Andere natuurlijke proteïnen zoals hormonen, cytokines en antilichamen (Orthoclone OKT3) behoorden tot de eerste negen in de jaren 80 goedgekeurde producten (tabel 1). Tegenwoordig zijn de therapeutische gebieden die het meest van recombinante biofarmaceutica hebben geprofiteerd stofwisselingsziekten (bijvoorbeeld diabetes type 1, type 2, zwaarlijvigheid of hypoglykemie), hematologische aandoeningen (bijvoorbeeld nieranemie, hemofilie A, bloedings- of stollingsstoornissen) en oncologie (bijvoorbeeld melanoom, borst- of colorectale kanker), met respectievelijk 24, 18 en 15 % van de goedkeuringen (fig. 3). In dit opzicht is oncologie een duidelijk groeiende markt. In de periode 2010-2014 waren 9 van de 54 goedgekeurde biofarmaceutica antitumorale geneesmiddelen, waarbij kanker de meest voorkomende indicatie was in deze periode. Als we graven in de moleculaire basis van biofarmaceutica, is er een duidelijke trend naar producten op basis van antilichamen. In dezelfde periode (2010-2014) waren 17 van de 54 goedgekeurde eiwitgeneesmiddelen monoklonale antilichamen (31,5%), vergeleken met 11% in 1980-1989. Bovendien zijn zes van de tien best verkopende eiwitbiofarmaceutica wereldwijd in 2014 (tabel 2) antilichamen of van antilichamen afgeleide eiwitten (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Voorheen, waren biofarmaceutica recombinante versies van natuurlijke eiwitten, met dezelfde aminozuursequentie als de respectieve natieve versies (met slechts kleine wijzigingen, vaak het gevolg van de kloneringsstrategie). Sinds de jaren negentig is een aanzienlijk deel van de goedkeuringen gebaseerd op sterk gemodificeerde vormen van recombinante eiwitten. Dit nieuwe alternatief, gebaseerd op fusie van eiwitten of domeinen en op afgeknotte versies, biedt een breed spectrum van mogelijke combinaties om nieuwe biofarmaceutica te verkrijgen met verschillende samengevoegde activiteiten die in de natuur niet samen voorkomen.

Proteïnegeneesmiddelen voor de behandeling van kanker

Oncologie is een van de therapeutische indicaties die de biofarmaceutische markt domineren, aangezien kanker wereldwijd een belangrijke oorzaak is van morbiditeit en mortaliteit. Chirurgie en radiotherapie zijn doeltreffend bij het genezen van kanker in een vroeg ziektestadium; zij kunnen echter geen metastatische ziekte uitroeien. De aanwezigheid van micrometastasen of klinisch duidelijke metastasen bij de diagnose vereist het gebruik ervan in combinatie met genotoxische chemotherapie om het genezingspercentage te verhogen. Het succes van chemotherapie wordt echter belemmerd door het gebrek aan selectiviteit en specificiteit, zodat de toxiciteit voor normale weefsels de dosis beperkt die aan patiënten kan worden toegediend. De ontwikkeling van biofarmaceutica die in staat zijn specifieke moleculaire doelwitten die kanker aandrijven te remmen (bijvoorbeeld monoklonale antilichamen anti-Her2-Trastuzumab- of anti-VEGF-Bevacizumab-) gaat in deze richting.

Van de biofarmaceutica op basis van proteïnen die op de markt zijn, wordt bijna 24 % (94 produkten) gebruikt voor antitumorale therapieën. De meeste van deze produkten worden gebruikt voor ondersteunende doeleinden, bedoeld om de bijwerkingen van chemotherapie, meestal neutropenie of anemie, tot een minimum te beperken (enkele representatieve voorbeelden zijn in tabel 3 opgenomen). Negentien van deze 94 producten zijn echte antitumorale geneesmiddelen, waarvan 69 % in E. coli worden geproduceerd (fig. 4) en zijn gebaseerd op gemanipuleerde aminozuursequenties, eiwitfusies en afzonderlijke eiwitdomeinen (tabel 4).

Het is duidelijk dat, zijn gemodificeerde eiwitversies de meest voorkomende bij kankertherapieën boven natuurlijke polypeptiden. Een relevant voorbeeld is Ziv aflibercept, een recombinant fusie-eiwit geproduceerd in CHO-cellen dat wordt gebruikt tegen colorectale kanker. Het bestaat uit gedeelten van elk van de Vascular Endothelial Growth Factor Receptors (VEGFR1 en VEGFR2) die zijn versmolten met de constante fractie (Fc) van een menselijk IgG1 immunoglobuline (Fig. 5). Dit construct werkt als een “decoy” door binding aan VEGF-A, VEGF-B en placentale groeifactor (PlGF), die VEGFR activeren. Deze val verhindert de interactie tussen de groeifactoren en de receptoren, waardoor de VEGF-route, die betrokken is bij het angiogene proces, wordt geremd. Denileukine diftitox is een recombinant eiwit dat is samengesteld uit twee difterietoxine-fragmenten (A en B) en een humaan interleukine-2 (Fig. 5). Difterietoxine is een krachtig exotoxine dat wordt afgescheiden door Corynebacterium diphteriae. Door zijn eigenaardige structuur is het gehele complex, geproduceerd in E. coli, in staat een cytotoxische stof rechtstreeks naar een specifiek doel af te voeren. Er zijn twee belangrijke actieve blokken die ten eerste het biofarmacon (IL-2) selectief afgeven en ten tweede cytotoxiciteit veroorzaken (toxine A en B). Het fusie-eiwit bindt zich aan de IL-2 receptor, die tot expressie komt in kankercellen (cutaan T cel lymfoom). Zodra het toxinegedeelte is geïnternaliseerd, bevordert het katalytische domein de celdood door remming van de eiwitsynthese .

Aangezien gerichte toediening van geneesmiddelen voor kanker een zeer recent en zich uitbreidend onderzoeksterrein is, zijn ook andere, nietrecombinante, op eiwitten gebaseerde biofarmaceutica sterk vertegenwoordigd. Deze omvatten hoofdzakelijk antilichaam-geneesmiddelconjugaten (ADC’s) zoals Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine, of nanodeeltjes-geneesmiddelconjugaten zoals nab-paclitaxel . In deze gevallen fungeert de eiwit-tegenhanger als een gericht voertuig voor conventionele chemische geneesmiddelen. Nogmaals, deze benadering streeft naar de selectieve toediening van geneesmiddelen aan specifieke doelcellen, met als doel de antitumorale activiteit te verhogen en tegelijkertijd de toxiciteit op normale cellen en de bijbehorende bijwerkingen te verminderen.

Producten tegen kanker die in 2013 de hoogste inkomsten opleverden, worden weergegeven in Fig. 6. Zestig procent van die producten zijn recombinante eiwitten, wat het idee ondersteunt dat de productie van recombinante eiwitten nog steeds een opkomend en veelbelovend platform is, dat ruimte biedt voor belangrijke vooruitgang in de biofarmaceutische sector.