Regulatie van acetaat- en acetyl-CoA omzettende enzymen tijdens groei op acetaat en/of glucose in het halofiele archaeon Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui vormde acetaat tijdens aërobe groei op glucose en gebruikte acetaat als groeisubstraat. Op glucose/acetaat mengsels werd diauxische groei waargenomen met glucose als het preferente substraat. De regulatie van enzymactiviteiten, gerelateerd aan het glucose- en acetaatmetabolisme, werd geanalyseerd. Zowel glucose dehydrogenase (GDH) als ADP-vormend acetyl-CoA synthetase (ACD) bleken te worden gestimuleerd tijdens perioden van glucoseverbruik en acetaatvorming, terwijl zowel AMP-vormend acetyl-CoA synthetase (ACS) als malaatsynthase (MS) werden gestimuleerd. Omgekeerd werd een upregulatie van ACS en MS en een downregulatie van ACD en GDH waargenomen tijdens perioden van acetaatverbruik. MS werd ook geüpreguleerd tijdens groei op peptiden in afwezigheid van acetaat. Uit de gegevens concluderen wij dat een glucose-induceerbaar ACD acetaatvorming katalyseert, terwijl acetaatactivering wordt gekatalyseerd door een acetaat-induceerbare ACS; zowel ACS als MS worden blijkbaar geïnduceerd door acetaat en onderdrukt door glucose.

1 Inleiding

Verschillende halofiele archaea, waaronder Haloarcula marismortui, groeien op glucose, dat wordt afgebroken via een gemodificeerde, half-gefosforyleerde Entner-Doudoroff (ED)-route. Er is aangetoond dat tijdens exponentiële groei op glucose aanzienlijke hoeveelheden acetaat werden gevormd . Recente studies tonen aan dat de vorming van acetaat uit acetyl-CoA in halofiele archaea gekatalyseerd wordt door een ADP-vormend acetyl-CoA synthetase (ACD) (acetyl-CoA + ADP + Pi⇆ acetaat + ATP + CoA). Dit ongewone synthetase werd aangetroffen in alle acetaatvormende archaea, met inbegrip van anaërobe hyperthermofielen, en vertegenwoordigt een nieuw mechanisme in prokaryoten van acetaatvorming en ATP-synthese. In anaërobe hyperthermofiele archaea, b.v. Pyrococcus furiosus, vertegenwoordigt ACD de voornaamste energiebesparende reactie tijdens het suiker-, pyruvaat- en peptidemetabolisme. In tegenstelling tot het één-enzymmetrisch mechanisme van archaea, gebruiken alle bacteriën het “klassieke” twee-enzymmetrisch mechanisme voor de omzetting van acetyl-CoA in acetaat, waarbij fosfaatacetyltransferase (PTA) en acetaatkinase (AK) betrokken zijn.

Verschillende haloarchaea, waaronder H. marismortui, Haloferax volcanii en Halorubrum saccharovorum zijn gerapporteerd te groeien op acetaat als substraat. Het metabolisme van acetaat wordt op gang gebracht door de activering ervan tot acetyl-CoA. Onlangs hebben we voor het eerst aangetoond dat de activering van acetaat tot acetyl-CoA in haloarchaea wordt gekatalyseerd door een AMP-vormend acetyl-CoA synthetase (ACS) (acetaat + ATP + CoA → acetyl-CoA + AMP + PPi) . ACS is het belangrijkste enzym voor de activering van acetaat voor de meeste acetaat-gebruikende organismen uit alle drie de levensdomeinen . Slechts enkele bacteriën, b.v. Corynebacterium glutamicum, en ook het acetoclastische methanogene archaeon Methanosarcina ssp. activeren acetaat tot acetyl-CoA via het AK/PTA koppel . De AK/PTA-route kan dus in vivo omkeerbaar werken, d.w.z. zowel in de richting van acetaatvorming als in de richting van acetaatactivering. Daarentegen suggereren eerste analyses dat in haloarchaea ACD, de archaeale tegenhanger van het AK/PTA-paar, in vivo werkt in de richting van acetaatvorming, hoewel het enzym in vitro een omkeerbare reactie katalyseert.

Om de fysiologische rol verder op te helderen en om een eerste inzicht te krijgen in de substraatafhankelijke regulatie van acetaat en acetyl-CoA omzettingsenzymen in haloarchaea hebben we substraatverschuivingsexperimenten uitgevoerd met H. marismortui, en de groei geanalyseerd op glucose, acetaat, glucose/acetaat mengsels en peptiden. Tijdens de groei werden activiteitsprofielen van acetaat en acetyl-CoA omzettende enzymen, ACD en ACS, en van glucose dehydrogenase, het eerste enzym in glucose afbraak via de gemodificeerde ED route, geanalyseerd. Bovendien werden de activiteiten van malaatsynthase, een sleutelenzym van de glyoxylaatcyclus, waarvan wordt verondersteld dat het werkzaam is in haloarchaea, bepaald.

2 Materialen en methoden

2.1 Groei van H. marismortui op glucose, acetaat, glucose/acetaat mengsels en op peptiden

Haloarcula marismortui werd aeroob gekweekt bij 37 °C op een complex medium dat gistextract, casaminozuren en aanvullend glucose en/of acetaat bevatte, zoals eerder beschreven. Voor groei op glucose/acetaat-mengsel werd dit medium aangevuld met 12,5 mM glucose en 30 mM acetaat. Groei op peptiden werd uitgevoerd op het complexe medium in afwezigheid van acetaat en glucose. Groei-experimenten werden uitgevoerd in fermentoren van 2 l (fairmen tec, Duitsland) met een roersnelheid van 500 omwentelingen per minuut en een persluchtdebiet van 600 ml per minuut. De groei werd gevolgd door de optische dichtheid bij 578 nm (ΔOD578) te meten. ΔOD578 van 1 kwam overeen met een eiwitgehalte van 0,5-0,6 mg/ml. Glucose en acetaat werden enzymatisch bepaald zoals beschreven in .

2.2 Bereiding van celextracten

Op verschillende groeifasen werden cellen van H. marismortui (100-200 ml van de cultuur) geoogst en celextracten werden bereid zoals beschreven in . Eiwit werd bepaald met de Bradford-methode met runderserumalbumine als standaard.

2.3 Bepaling van enzymactiviteit

Alle enzymatests werden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden bij 37 °C in cuvetten gevuld met 1 ml testmengsel. De hulpenzymen werden in het algemeen kort voor het begin van de reactie toegevoegd en er werd op toegezien dat deze enzymen niet snelheidsbeperkend waren. Eén eenheid (1 U) enzymactiviteit wordt gedefinieerd als 1 μmol verbruikt substraat of gevormd product per minuut.

• Acetyl-CoA synthetase (ADP-vormend) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) werd gemeten zoals beschreven in.

• Acetyl-CoA synthetase (AMP-vormend) (ACS) (E. C. 6.2.1.13).C. 6.2.1.1.) werd gecontroleerd als PPi en AMP-afhankelijk HSCoA vrijkomt uit acetyl-CoA volgens Srere et al. met Ellman’s thiolreagens, 5′5-dithiobis (2-nitrobenzoëzuur) (DTNB), door de vorming van thiofenolaatanion te meten bij 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). Het analysemengsel bevatte 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetyl-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi en extract.

• Malaatsynthase (E.C. 4.1.3.2.) werd gecontroleerd in een aangepaste test volgens Serrano et al. met DTNB. Het testmengsel bevatte 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetyl-CoA, 0,5 mM glyoxylaat en extract.

• Glucose dehydrogenase (E.C. 1.1.1.47) werd gemeten volgens Johnsen et al. .

• Acetaat kinase (E.C. 2.7.2.1.) werd gemeten zoals beschreven in .

• Phosphotransacetylase (E.C. 2.3.1.8.) werd gecontroleerd als Pi afhankelijke HSCoA-vrijgave uit acetyl-CoA met DTNB . Het testmengsel bevatte 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetyl-CoA, 5 mM KH2PO4 en extract.

3 Resultaten

Om de fysiologische functie en de regulering van enzymen in verband met het acetaat- en acetyl-CoA-metabolisme te onderzoeken, werden cellen van H. marismortui, voorgegroeid op verschillende substraten, overgebracht naar een medium dat respectievelijk acetaat en/of glucose en peptiden bevatte, en werden de activiteitsprofielen van ACD, ACS, GDH en MS geanalyseerd.

3.1 Groei van aan acetaat aangepaste cellen op glucose

Na een lagefase groeiden de cellen exponentieel en werd glucose volledig verbruikt. Parallel aan het glucoseverbruik werden aanzienlijke hoeveelheden acetaat gevormd. In deze periode namen de activiteiten van zowel GDH als ACD toe, terwijl de activiteiten van ACS en MS, die actief waren in aan acetaat aangepaste cellen, volledig werden teruggeschroefd. In de stationaire fase werd het uitgescheiden acetaat volledig hergebruikt en namen de activiteiten van zowel ACS als MS toe, terwijl de activiteiten van GDH en ACD afnamen (Fig. 1).

3.2 Groei van glucose-aangepaste cellen op acetaat

Glucose-aangepaste cellen groeiden aanvankelijk (ongeveer 30 uur) op acetaathoudend medium met een verdubbelingstijd van 10 uur tot een optische dichtheid (ΔOD578) van 1. In deze groeifase werd geen acetaatverbruik waargenomen en groeiden de cellen op peptiden die in het medium aanwezig waren. Na deze periode groeiden de cellen met een verminderde groeisnelheid tot een ΔOD578 van 1,8 en werd acetaat volledig verbruikt. Tijdens de acetaatconsumptie namen de ACD- en GDH-activiteiten af, terwijl de ACS- en MS-activiteiten, die niet konden worden gedetecteerd in cellen die aan glucose waren aangepast, toenamen. De toename van de MS-activiteit begon tijdens de groei op peptiden, terwijl de toename van de ACS-activiteit parallel verliep met het acetaatverbruik (Fig. 2).

3.3 Groei op glucose/acetaat mengsels

Cellen van H. marismortui aangepast aan gistextract en casaminozuren werden overgebracht naar medium dat zowel glucose als acetaat bevatte. De cellen vertoonden een diauxische groei met opeenvolgende benutting van eerst glucose en vervolgens acetaat. In de eerste groeifase groeiden de cellen tot een ΔOD578 van 4,0 en werd glucose verbruikt. Na glucoseverbruik en een korte lagfase kwamen de cellen in de tweede groeifase, waarin acetaat werd gemetaboliseerd en de cellen groeiden tot een uiteindelijke ΔOD578 van 5,2. In de eerste groeifase, parallel met de glucoseconsumptie, namen de ACD- en GDH-activiteiten toe, terwijl de ACS-activiteit niet kon worden gedetecteerd en de MS-activiteit volledig werd gedownreguleerd. In de tweede groeifase parallel aan het acetaatgebruik namen de ACS- en MS-activiteiten toe en namen de ACD- en GDH-activiteiten af (Fig. 3).

3.4 Glucose-aangepaste cellen op peptiden

Glucose-aangepaste cellen werden verschoven naar medium dat 0,25% gistextract en 0,5% casaminozuren bevatte in afwezigheid van zowel glucose als acetaat. De cellen groeiden met een verdubbelingstijd van 13 uur tot een ΔOD578 van 2,5. Acetaatvorming kon niet worden gedetecteerd. Tijdens de exponentiële groei daalden ACD (van 60 tot 20 mU/mg) en GDH (van 80 tot 40 mU/mg), terwijl de activiteit van MS, die aanvankelijk niet kon worden gedetecteerd, toenam tot 20 mU/mg. ACS-activiteit kon niet worden gedetecteerd tijdens de exponentiële groeifase, maar nam toe tijdens de stationaire fase (13 mU/mg).

4 Discussie

In dit artikel hebben we de fysiologische rol van acetaat- en acetyl-CoA-omzettingsenzymen (ACD, ACS) in H. marismortui geanalyseerd en geven we het eerste bewijs voor substraatspecifieke regulatie van deze enzymen, evenals voor GDH en MS. De gegevens worden besproken in vergelijking met bekende bacteriële systemen.

4.1 Acetaatvorming in H. marismortui wordt gekatalyseerd door ACD als onderdeel van “overflow” metabolisme

Tijdens groei op glucose en op glucose/acetaat mengsels namen zowel de ACD als GDH activiteiten toe parallel aan de fasen van glucoseverbruik en acetaatvorming (Figs. 1 en 3). Omgekeerd namen beide activiteiten af tijdens groei op acetaat of peptiden. Deze gegevens en de afwezigheid van AK/PTA geven aan dat de vorming van acetaat in Haloarcula gekatalyseerd wordt door ACD. De fysiologische rol van acetaatvorming in H. marismortui en de regulatie ervan tijdens aërobe groei op glucose is niet begrepen; acetaatvorming zou deel kunnen uitmaken van een “overflow” metabolisme, dat in enige mate van detail is bestudeerd in verschillende bacteriën, b.v. Escherichia coli en Bacillus subtilis. Net als bij H. marismortui scheiden beide bacteriën acetaat uit tijdens aërobe groei op een overmaat aan glucose en hergebruiken het in de stationaire fase. Er is gespeculeerd dat uitscheiding van acetaat optreedt onder omstandigheden waarin de snelheid van de glycolyse groter is dan die van de daaropvolgende routes, b.v. de citroenzuurcyclus en de ademhaling die nodig is voor de volledige oxidatie van glucose. Onder deze omstandigheden wordt acetyl-CoA omgezet in acetaat en uitgescheiden. In overeenstemming met deze zienswijze wijzen transcriptionele analyses met zowel E. coli als B. subtilis op glucose-specifieke inductie van glycolytische genen en repressie van genen van de citroenzuurcyclus en van de ademhaling. Een soortgelijke glucose-specifieke transcriptieregulatie, d.w.z. upregulatie van glycolytische genen van de gewijzigde Entner-Doudoroff-route, en downregulatie van sommige genen van de citroenzuurcyclus en van de ademhaling is onlangs gerapporteerd voor het halofiele archaeon H. volcanii. Het is dus waarschijnlijk dat in haloarchaea een glucose-specifiek overloopmetabolisme resulteert in acetaatvorming. Bij acetaatvorming in E. coli en B. subtilis is het bacteriële twee-enzymmetrisch mechanisme via PTA en AK betrokken, terwijl in Haloarcula acetaatvorming wordt gekatalyseerd door ACD, het archaeale één-enzymmetrisch mechanisme. In zowel E. coli als B. subtilis bleek glucose de coderende pta- en ack-genen te induceren, hetgeen wijst op een gecoördineerde regulatie van glycolyse en acetaatvorming. Tot nu toe is de transcriptionele regulatie van de acetaat-vormende ACD in het archaeon H. marismortui niet geanalyseerd. Echter, de gecoördineerde regulatie van GDH en van ACD activiteit suggereert een vergelijkbare glucose-specifieke transcriptionele regulatie van zowel glycolyse door de gemodificeerde Entner-Doudoroff pathway als van acetaat vorming door ACD.

Tijdens aërobe groei op peptiden vormde H. marismortui geen acetaat en werd ACD activiteit gedownreguleerd. In dit opzicht verschilt Haloarcula van de bacterie E. coli, dat tijdens aërobe groei op peptiden in de loop van een “overloop”-metabolisme aanzienlijke hoeveelheden acetaat vormt . H. marismortui verschilt ook van het anaerobe hyperthermofiele archaeon P. furiosus en andere anaerobe, hyperthermofiele archaea, die grote hoeveelheden acetaat vormen door middel van ACD tijdens anaerobe groei op zowel suikers als peptiden. Tijdens de anaërobe peptide- en suikergisting van P. furiosus is acetaatvorming door ACD de belangrijkste plaats van ATP-vorming via fosforylering op substraatniveau; tijdens de aërobe afbraak van suikers en peptiden door H. marismortui daarentegen wordt de meeste energie bewaard door elektronentransportfosforylering in de ademhalingsketen en is acetaatvorming door ACD dus minder belangrijk of overbodig. Aldus lijkt acetaatvorming door ACD in Haloarcula beperkt te zijn tot suikermetabolisme in de loop van een “overflow” metabolisme.

4.2 Acetaatactivering tot acetyl-CoA in H. marismortui wordt gekatalyseerd door ACS

Dit werd geconcludeerd uit de upregulatie van ACS-activiteit parallel met acetaatverbruik (Figs. 1, 2, 3). Een rol van ACD in acetaatactivering kon worden uitgesloten, aangezien ACD werd gedownreguleerd tijdens perioden van acetaatverbruik. ACD in Haloarcula werkt in vivo dus alleen in de richting van acetaatvorming. ACS is ook het meest voorkomende mechanisme van acetaatactivering in bacteriën waar het streng gereguleerd is; b.v. in E. coli en B. subtilis wordt het acs gen geïnduceerd door acetaat en onderdrukt door glucose . In Haloarcula suggereert de upregulatie van de ACS-activiteit door acetaat en de downregulatie door glucose een soortgelijke regulatie op transcriptioneel niveau als bij bacteriën. Opgemerkt moet worden dat in tegenstelling tot E. coli en B. subtilis, de bacterie C. glutamicum acetaat activeert via een door acetaat geïnduceerde AK/PTA-route.

De activiteit van MS, een sleutelenzym van de glyoxylaatcyclus, werd verhoogd tijdens perioden van acetaatconsumptie in H. marismortui samen met ACS, wat suggereert dat acetaat-specifieke gecoördineerde regulatie van ACS en de anaplerotische glyoxylaatcyclus optreedt. Zowel de activiteit van MS als die van ACS werden door glucose gedownreguleerd. Gecoördineerde acetaat-specifieke inductie van genen van acetaatactiveringsenzymen (zie boven) en van de glyoxylaatroute is gerapporteerd voor verscheidene bacteriën, waaronder E. coli en C. glutamicum. Onlangs werd voor het eerst bewijs geleverd voor inductie van genen voor zowel malaatsynthase als isocitraatlyase door acetaat voor het halofiele archaeon H. volcanii.

De activiteit van MS in plaats van ACS werd echter ook geüpreguleerd tijdens exponentiële groei op peptiden in afwezigheid van acetaat, hetgeen erop wijst dat de regulatie van MS complexer is en niet beperkt is tot acetaat. Een rol van MS (en van de glyoxylaatcyclus) in het peptidenmetabolisme zou kunnen worden verklaard door het feit dat veel aminozuren worden afgebroken tot acetyl-CoA, waarvoor een functionele glyoxylaatroute voor anabolisme nodig zou zijn. De toename van ACS activiteit, waargenomen in de stationaire fase tijdens groei op peptiden, kan tot nu toe niet verklaard worden, het zou te wijten kunnen zijn aan een algemene stress respons van de stationaire fase cellen.

4.3 Glucose specifieke kataboliet repressie in H. marismortui

Haloarcula marismortui vertoonde diauxische groei op glucose/acetaat mengsels met glucose als preferent substraat wat wijst op een soort katabole repressie van acetaat gebruik door glucose. Glucose-specifieke katabolietonderdrukking is tot nu toe niet geanalyseerd in archaea. In bacteriën is de moleculaire basis van de onderdrukking van koolstofkatabolieten door glucose in detail bestudeerd, b.v. in E. coli en B. subtilis. Tijdens de groei van C. glutamicum op glucose/acetaat mengsels werd monofasische groei beschreven met gelijktijdige consumptie van acetaat en glucose, terwijl in Azotobacter vinelandii acetaat het geprefereerde substraat is. De regulerende principes achter deze kenmerken worden momenteel onderzocht.

Verder onderzoek is nodig om de voorgestelde substraatspecifieke regulatie van acetaatvormende en acetaatactiverende enzymen, ACD en ACS, in relatie tot het acetaat- en glucosemetabolisme op transcriptioneel niveau te onderbouwen. Deze studies, die de zuivering en identificatie van de coderende genen van de ACD en ACS van H. marismortui vereisen, zijn aan de gang.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

>

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

te karakteriseren.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

Author notes