Stabiliteitsstudies van thiocolchicoside in bulk en capsules met behulp van RP-HPTLC/Densitometrie

Een aantal analysemethoden, zoals LC-ESI-MS RP-HPLC en UV-Spectrofotometrie, zijn vastgesteld voor de bepaling van thiocolchicoside alleen in bulk en in farmaceutische formuleringen.

Thiocolchicoside is beschikbaar in combinatie met veel andere geneesmiddelen; daarom zijn verschillende methoden zoals UV-Spectrofotometrische , RP-HPLC , en HPTLC methoden bestudeerd voor de bepaling van thiocolchicoside in gecombineerde toedieningsvormen.

De richtlijnen van de Internationale Conferentie voor Harmonisatie (ICH), getiteld “Stability Testing of New Drug Substances and Products”, vereisen dat stresstests kunnen worden uitgevoerd om de inherente stabiliteitskenmerken van de werkzame stof te verduidelijken. Een ideale stabiliteitsindicerende methode is een methode die zowel het standaardgeneesmiddel als de afbraakproducten daarvan oplost. Er moet dus een betrouwbare en snelle bepalingsmethode worden ontwikkeld, die ook kan worden gebruikt om de afbraakcomponenten optimaal te scheiden van de oorspronkelijke verbinding. Voor zover wij weten, is er in de literatuur echter nog nooit een artikel vermeld over de stabiliteitsindicerende RP-HPTLC-bepaling van thiocolchicoside. Het doel van het in dit artikel beschreven werk is om de voorwaarden vast te stellen voor de identificatie en kwantitatieve analyse van thiocolchicoside in aanwezigheid van zijn afbraakproducten om de zuiverheid van het bulkgeneesmiddel en de stabiliteit van zijn doseringsvormen te beoordelen. De geschiktheid van stabiliteitsindicerende RP-HPTLC methode voor kwantitatieve bepaling van thiocolchicoside werd bewezen door validatie in overeenstemming met de vereiste van ICH richtlijnen.

2. Experimenteel

2.1. Chemische stoffen en reagentia

Thiocolchicoside werd verkregen als een geschenkmonster van Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, India. HPLC-kwaliteit methanol, HCl, NaOH, en H2O2 werden gekocht bij Merck Chemicals, India.

2.2. HPTLC Instrumentation

De geneesmiddelstandaard en de monsters werden gespot in de vorm van banden van 6 mm breedte met een CAMAG Linomat microliter spuit (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Zwitserland) met behulp van een CAMAG Linomat 5-sample applicator (CAMAG Muttenz, Zwitserland) met een constante toepassingssnelheid, 150 nL per seconde. De platen werden voorgewassen met methanol en gedurende 10 minuten geactiveerd bij 100°C voorafgaand aan de chromatografie. De chromatografie werd uitgevoerd op aluminiumplaten die waren voorgecoat met silica gel 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Duitsland). Lineair stijgende ontwikkeling met methanol: water (70 : 30 v/v) als mobiele fase werd uitgevoerd in een glazen kamer met twee troggen van 20 × 10 cm (CAMAG Muttenz, Zwitserland). De optimale verzadigingstijd van de mobiele fase in de kamer was 30 minuten bij kamertemperatuur (28 ± 2 °C). De lengte van de chromatogramrun bedroeg ongeveer 80 mm. De ontwikkelingstijd van de plaat bedroeg 25 min. Na de ontwikkeling werden de platen in luchtstroom gedroogd door een luchtdroger. Detectie van de spot werd vervolgens uitgevoerd bij 377 nm met een CAMAG TLC Scanner 3 in absorptiemodus, bediend door winCATS software versie 1.3.0. De stralingsbron was een deuteriumlamp. De spleetafmetingen waren 6 mm × 0,45 mm en de scansnelheid bedroeg 20 mm per seconde.

2.3. Preparation of Stock Standard

Stock standaard oplossing van 1 mg/ml van thiocolchicoside in methanol.

2.4. Lineariteitsstudie

Stock standaardoplossing in het bereik van 0,2 tot 1,2 mL werd overgebracht in zes afzonderlijke 10 mL maatkolven, en het volume werd aangevuld met methanol. Van elk van de bovengenoemde oplossingen werd 5 μl op RP-HPTLC-platen aangebracht om een concentratie in het bereik van 100 tot 600 ng per band te verkrijgen. De ijkgrafiek voor de methode werd geconstrueerd als piekoppervlakte versus geneesmiddelconcentratie.

2.5.

Om het gehalte aan thiocolchicoside in de capsule te bepalen, werden twintig capsules (MYORIL, etiketclaim: 8 mg thiocolchicoside per capsule) gewogen; de inhoud van de capsules werd verwijderd; en het gemiddelde gewicht werd bepaald. Een hoeveelheid die overeenkomt met 8 mg thiocolchicoside werd overgebracht in een maatkolf van 100 ml met 50 ml methanol en gedurende 10 minuten gesonificeerd; het volume werd op de maatstreep gebracht en gefiltreerd met Whatmann nr. 41-filtreerpapier. Een volume van 5 mL werd verdund tot 10 mL met methanol; resulterende oplossing 5 pi toegepast op RP-HPTLC plaat voor de bepaling van thiocolchicoside. De platen werden ontwikkeld en gescand zoals hierboven beschreven.

2.6. Methodevalidatie

De methode werd gevalideerd voor de volgende parameters volgens de ICH-richtlijnen.

2.6.1. Precisie

Herhaalbaarheid van monstertoepassing en meting van piekoppervlak werden uitgevoerd met zes replicaten van de testconcentratie (400 ng per band van thiocolchicoside). De intra- en interdagvariatie voor de schatting van thiocolchicoside werd uitgevoerd met gebruikmaking van drie replicaten bij drie verschillende concentratieniveaus (200, 300, en 500 ng per band).

2.6.2. Detectiegrens (LOD) en Kwantificatielimiet (LOQ)

Om de detectie- en kwantificatielimiet te bepalen, werden thiocolchicosideconcentraties in het onderste deel van het lineaire bereik van de kalibratiecurve gebruikt. Van de standaard stockoplossing werd thiocolchicoside 100, 120, 140, 160, 180 en 200 ng per band in drievoud op de RP-HPTLC-plaat aangebracht en de LOD en LOQ werden berekend met behulp van de volgende vergelijkingen: waarbij “” de standaardafwijking van de piekoppervlakken van de drugs is (), die als maat voor de ruis wordt genomen en “” de helling van de overeenkomstige ijkcurve is.

2.6.3. Specificiteit

De specificiteit van de methode werd gecontroleerd door het analyseren van drug standaard en monster. De band voor thiocolchicoside in het monster werd bevestigd door de waarden en spectra van de band te vergelijken met die van de drugstandaard. De piekzuiverheid van thiocolchicoside werd bevestigd door de spectra op drie verschillende niveaus te vergelijken, namelijk piek-start (), piek-apex (), en piek-eind () posities van de band.

2.6.4. Robuustheid

De robuustheid van de methode werd uitgevoerd door het analyseren van 400 ng thiocolchicoside door twee verschillende analisten waarbij dezelfde experimentele en omgevingscondities werden aangehouden.

2.6.5. Nauwkeurigheid

Negen banden van thiocolchicoside monsteroplossing (200 ng per band) werden aangebracht op plaat, en vervolgens werd de bekende hoeveelheid thiocolchicoside in drievoud aangebracht op 80, 100, en 120% (160, 200 en 240 ng per band) van de monsterconcentratie (200 ng per band) en opnieuw geanalyseerd met de voorgestelde methode. Dit werd uitgevoerd om het terugvindingsonderzoek van het geneesmiddel op verschillende niveaus in de formuleringen te evalueren.

2.6.6. Robuustheid

Door kleine wijzigingen aan te brengen in de samenstelling van de mobiele fase, de hoeveelheid mobiele fase, de tijd van aanbrengen tot ontwikkelen, en de tijd van ontwikkelen tot scannen werden de effecten op de resultaten onderzocht. Mobiele fasen met verschillende samenstellingen van methanol : water (72 : 28 v/v) en methanol : water (68 : 32 v/v) werden uitgeprobeerd en de chromatogrammen werden gedraaid. De platen werden voorgewassen met methanol en geactiveerd bij 80 ± 5°C gedurende 2, 5, en 8 min. voorafgaand aan de chromatografie. De robuustheid van de methode werd uitgevoerd met zes replicaten van dezelfde vlek (400 ng per band van thiocolchicoside).

2.7. Gedwongen afbraak van thiocolchicoside

2.7.1. Zure en basische hydrolyse

Nauwkeurig afgewogen hoeveelheid 10 mg thiocolochicoside werd afzonderlijk opgelost in 10 mL methanolische oplossing van 1,0 M HCl en 0,5 M NaOH, respectievelijk, en gedurende 30 min bij 60°C in het donker teruggesluisd om waarschijnlijke degradatieve werking van licht te vermijden. Een volume van 1,0 mL van de bovenstaande oplossingen werd afzonderlijk genomen, geneutraliseerd en verdund tot 10 mL met methanol. De resulterende oplossingen werden in drievoud op de RP-HPTLC-platen aangebracht (telkens 5 μL, d.w.z. 500 ng per band). De chromatogrammen werden ontwikkeld en gescand zoals hierboven beschreven.

2.7.2. Oxidatieve afbraak

Voor oxidatieve afbraak werd een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid van 10 mg thioclochicoside afzonderlijk opgelost in 10 ml methanoloplossing van 1% v/v H2O2 en 3% v/v H2O2, respectievelijk, en gedurende 30 min in het donker bij kamertemperatuur bewaard. Na 30 minuten werd 1,0 mL van elk van de bovenstaande oplossingen genomen en verdund tot 10 mL met methanol. De resulterende oplossingen werden in drievoud op RP-HPTLC-platen aangebracht (telkens 5 μl, d.w.z. 500 ng per band). De chromatogrammen werden ontwikkeld en gescand zoals hierboven beschreven.

2.7.3.

Nauwkeurig afgewogen hoeveelheid van 10 mg thiocolchicoside werd bij 70°C gedurende 8 uur in een oven bewaard. Het werd overgebracht in een maatkolf van 10 mL met methanol en het volume werd tot de maatstreep aangevuld. Er werd 1,0 mL van de bovenstaande oplossing genomen en tot 10 mL verdund met methanol. De resulterende oplossing werd in drievoud op de RP-HPTLC-plaat aangebracht (telkens 5 μl, d.w.z. 500 ng per band). Het chromatogram werd ontwikkeld en gescand zoals hierboven beschreven.

2.7.4. Fotodegradatie

Nauwkeurig afgewogen hoeveelheid van 10 mg thiocolchicoside werd opgelost in 10 mL methanol en de oplossingen werden gedurende 24 uur in het licht gehouden. Een passend volume 1,0 mL van bovenstaande oplossing werd genomen en verdund tot 10 mL met methanol. De resulterende oplossing werd in drievoud op de RP-HPTLC-plaat aangebracht (5 μL elk, d.w.z. 500 ng per band). Het chromatogram werd ontwikkeld en gescand zoals hierboven beschreven.

3. Resultaten en Discussie

3.1. Voor de selectie van de geschikte mobiele fase voor de scheiding van thiocolchicoside werden verschillende runs uitgevoerd met mobiele fasen die oplosmiddelen van verschillende polariteit bevatten, bij verschillende concentratieniveaus. Van de verschillende gebruikte combinaties van mobiele fasen gaf de mobiele fase bestaande uit methanol : water (70 : 30 v/v) een scherpe en goed gedefinieerde piek bij een waarde van 0,60 ± 0,02 (figuur 2). De goed afgetekende banden werden gevonden toen de kamer gedurende 30 min bij kamertemperatuur met de mobiele fase werd verzadigd.

Figuur 2

Chromatogram van thiocolchicoside-standaard met ( 0,60 ± 0,02) bij 377 nm in methanol: water (70 : 30 v/v) als mobiele fase.

3.2. Calibration Curve

De lineaire regressiegegevens voor de kalibratiecurven () toonden een goed lineair verband over het concentratiebereik van 100-600 ng per band. De lineaire regressievergelijking bleek te zijn , = 0,9984 (figuur 3).

Figuur 3

Kalibratiekromme van thiocolchicoside (100-600 ng per band).

3.3. Validation of Method

De ontwikkelde methode werd gevalideerd volgens de ICH-richtlijnen.

De precisie van de methode werd aangetoond in termen van % relatieve standaardafwijking (% RSD) van het piekgebied. De resultaten (tabel 1) belichamen de precisie van de methode, die werd bepaald aan de hand van de helling van het laagste deel van de ijkgrafiek. De LOD en LOQ bleken respectievelijk 9,77 ng en 29,63 ng te zijn, hetgeen aangeeft dat de gevoeligheid van de methode toereikend is.

Parameters Concentratie (ng per band) % Gevonden hoeveelheid % RSD Herhaalbaarheid () 400 99.39 0.61 Intraday () 200 100.73 0.64 300 99.83 0.78 500 99.18 0.32 Interday () 200 100,80 1,43 300 99,65 0.70 500 99,91 0,50

: aantal bepalingen.

Tabel 1

Herhaalbaarheid en intra- en interdagprecisie.

De terugvindingsstudies werden uitgevoerd bij 80%, 100%, en 120% van de testconcentratie volgens de ICH-richtlijnen. Het terugvindingspercentage van thiocolchicoside op alle drie niveaus bleek in het bereik van 99,92-100,04% te liggen. De toegevoegde en bepaalde hoeveelheden geneesmiddel en het terugvindingspercentage zijn vermeld in tabel 2. De piekzuiverheid van thiocolchicoside werd bevestigd door de spectra te evalueren op de begin-, piek-apex- en piek-eindposities van de band, namelijk (, ) = 0,9995 en (, ) = 0,9986, waaruit de specificiteit van de methode blijkt (figuur 4). Er werd een goede correlatie ( = 0,9989) verkregen tussen de standaard van het geneesmiddel en het geneesmiddel dat uit de capsuleformule werd geëxtraheerd. De robuustheid van de methode werd geëxperimenteerd door doelbewust de chromatografische omstandigheden te wijzigen, en het effect op het chromatogram werd waargenomen. De standaardafwijking van de piekoppervlakken werd voor elke parameter berekend, en het RSD-percentage bleek minder dan 2% te bedragen. De lage waarden van de % RSD wijzen op de robuustheid van de methode; de resultaten zijn weergegeven in (tabel 3). De robuustheid van de methode werd geverifieerd door verschillende analisten en de % RSD bleek 0,57 en 0,58 te zijn, wat aangeeft dat de methode robuust is.

88 Drug Initiële hoeveelheid (ng per band) Hoeveelheid toegevoegde drugstandaard (%) % teruggewonnen drug () % R.S.D. () Thiocolchicoside 200 80 99.92 0.74 100 100.04 0.04 0.00 120 99,97 0,46

: aantal bepalingen.

Tabel 2

Verwinningsonderzoeken.

Parameter ± S.D. van piekoppervlakte () % R.S.D. () Mobiele fase samenstelling (±2 mL) 32.38 0.73 Hoeveelheid mobiele fase (±5%) 37,31 0,84 Tijd tussen aanbrengen en ontwikkelen (±10 min) 24.72 0.55 Tijd van ontwikkeling tot scannen (±10 min) 36.77 0.82 Activatie van TLC-platen 34,40 0,77

: aantal bepalingen.

Tabel 3

Robuustheid van de methode.

Figuur 4

Piekzuiverheidsspectra van thiocolchicoside-standaard (a) en uit capsule geëxtraheerd thiocolchicoside (b) gescand op piek-start-, piek-apex- en piek-eindposities.

3.4. Analyse van de op de markt gebrachte formulering

Thiocolchicoside, geëxtraheerd uit de capsuleformulering, vertoonde een enkele vlek met = 0,60 ± 0,02 in het chromatogram. Het gemiddelde % geneesmiddelgehalte bleek 100.27% van de labelclaim te zijn met 0.88% RSD.

3.5. Stability-Indicating Property

3.5.1. Zure afbraak

Gedwongen afbraak van thiocolchicoside in 1,0 M HCl (60°C gedurende 30 min) bleek instabiel te zijn en vertoonde twee extra pieken bij waarden 0,33 en 0,71 (figuur 5(a)). De vlekken van de afgebroken producten waren goed gescheiden van de vlek van thiocolchicoside.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figuur 5

RP-HPTLC-chromatogrammen van thiocolchicoside dat is afgebroken door a) zure hydrolyse (1 M HCl), (b) alkalische hydrolyse (0.5 M NaOH), (c) oxidatieve stress (1% v/v H2O2), en (d) oxidatieve stress (3% v/v H2O2).

3.5.2. Basische afbraak

Thiocolchicoside bleek instabiel te zijn tijdens alkalihydrolyse in 0,5 M NaOH bij 60°C gedurende 30 min. Het geneesmiddel vertoonde één extra piek bij waarde 0,72, terwijl thiocolchicoside bij 0,60 bleef (figuur 5(b)). De vlekken van de afgebroken producten waren goed gescheiden van de medicijnvlekken.

3.5.3. Oxidatieve Degradatie

Thiocolchicoside bezit een zwavelatoom, dat gevoeliger is voor oxidatie door H2O2. Na behandeling van thiocolchicoside met 1% v/v H2O2 werden drie extra pieken met waarden 0,38, 0,46 en 0,70 waargenomen, terwijl thiocolchicoside bij 0,60 bleef (figuur 5(c)). Bij oxidatieve afbraak met 3% v/v H2O2 werd thiocolchicoside volledig afgebroken, wat resulteerde in twee belangrijke pieken bij waarden van respectievelijk 0,58 en 0,64 en één piek bij 0,70 (figuur 5(d)). De piekzuiverheidsspectra van thiocolchicoside dat na afbraak in 1 M HCl, 0,5 M NaOH en 1% v/v H2O2 is teruggevonden en de thiocolchicoside-standaard die op de piek-begin-, piek-apex-, en piek-eindposities van de vlek is gescand, zijn te zien in (figuur 6). Uit de resultaten van de stresstests bleek dat de methode zeer specifiek was voor thiocolchicoside. De afbraakproducten waren volledig te onderscheiden van de oorspronkelijke verbinding. Er werd geen decompositie vastgesteld bij blootstelling van de geneesmiddeloplossing aan zonlicht tijdens foto- en thermische degradatie, wat wijst op de stabiliteit van het geneesmiddel onder beide omstandigheden. De resultaten van de geforceerde degradatiestudie van thiocolchicoside zijn samengevat in (tabel 4).

Stressvoorwaarden Temperatuur % herstel () Thiocolchicoside piek-1 piek-2 piek-3 1.0 M HCl 60°C 78,00 (0,60) 8,22 (0,33) 13,78 (0,71) 0,5 M NaOH 60°C 85 (0.60) 15 (0,72) – – 1% v/v H2O2 RT 67,50 (0,60) 2.18 (0,38) 10,20 (0,46) 20,12 (0,70) Photodegradatie-daglicht (8 uur/dag) RT 92.94 (0.60) – – – Droge warmte 70°C 98.12 (0,60) – – –

RT: Kamertemperatuur.

Tabel 4

Forced degradation studies.

Figuur 6

Piekzuiverheidsspectra van thiocolchicoside teruggewonnen na afbraak in 1 M HCl, 0.5 M NaOH, 1% v/v H2O2, afbraakmiddelen en thiocolchicoside-standaard gescand op piek-start-, piek-apex- en piek-eindposities.

4. Conclusie

In de huidige studie werd geforceerde degradatie van thiocolchicoside uitgevoerd om de inherente chemische stabiliteit ervan te verduidelijken. Daartoe werd een RP-HPTLC methode ontwikkeld. De ontwikkelde methode bleek eenvoudig, snel, selectief, gevoelig en geschikt te zijn voor de bepaling van thiocolchicoside in bulkmateriaal en capsuleformulering. Tijdens het onderzoek is gebleken dat thiocolchicoside gevoelig is voor hydrolyse door zuren en basen, alsmede voor oxidatie. Aangezien de methode een stabiliteitsindicatie is, kan zij worden gebruikt om de zuiverheid te bepalen van het geneesmiddel dat uit verschillende bronnen verkrijgbaar is, door de daarmee samenhangende onzuiverheden op te sporen. Bovendien kan worden geconcludeerd dat de in het geneesmiddel aanwezige onzuiverheden het gevolg kunnen zijn van hydrolyse of oxidatie tijdens de verwerking en opslag van het geneesmiddel.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgment

De auteurs zijn R. C. Patel Institute of Pharmaceutical Education and Research, Shirpur (M.S.), India, dankbaar voor het verstrekken van de vereiste faciliteiten om dit onderzoekswerk uit te voeren.