Celoverleving na bestraling
Onderzoek naar door straling veroorzaakte celgroei en celsterfte, gedefinieerd als de tijd die nodig is voor een volledig verlies van de proliferatiecapaciteit of exaltatie van de proliferatiecapaciteit, is een van de meest gebruikte en betrouwbaarste methoden om stralingseffecten op cellen te bestuderen. Voor de bestralingsexperimenten heeft ons laboratorium geverifieerd dat de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-metingen evenredig waren met het aantal cellen in vitro, althans in de fase van exponentiële groei (gegevens niet aangetoond). Bestraling met 12C6+-ionen met hoge energie leidt gewoonlijk tot de dood van de overgrote meerderheid van de cellen. De fractie van celdood in de achterblijvende fase na bestraling en veranderingen in verdubbelingstijd kunnen worden gemeten door op verschillende tijdstippen na bestraling te testen. Omdat onze assay niet alleen een eenmalige bepaling van de overleving was, kon ook gemakkelijk informatie over de groeiprestaties worden verkregen. De overlevingskromme werd getekend op een natuurlijke logaritmische schaal van de overlevingsfractie tegenover verschillende fysische parameters.
C. tyrobutyricum 25755 cellen werden bestraald 20 uur na het zaaien. De stammen met de laagste metabolische activiteit en de traagste proliferatie of cellen die ophielden met prolifereren werden van de test uitgesloten door wassen en trypsiniseren wanneer de uitplating na bestraling werd uitgevoerd. De overlevingsfractie zoals verkregen uit vergelijking (1) werd vergeleken met een representatieve reeks experimentele gegevens. Figuur 1 toont een vergelijking van de overlevingskrommen na 12C6+-ionenbestraling bij verschillende stralingsenergieën voor de verschillende stammen van C. tyrobutyricum ATCC 25755. De resultaten van de MTT-test zijn uitgezet tegen de bestralingsdosis (10 tot 50 Gy) bij 68 AMeV van energie en 106 tot 108 ionen – puls-1 niveaus, die e0 → e-4,5 voor figuur 1A, e0 → e-5,8 voor figuur 1B en e0 → 0 voor figuur 1C. Figuur 1D-F toont de cellulaire overleving gegevens van de resultaten van de MTT-assay tegen de bestralingsdosis (10 tot 50 Gy) bij 114 AMeV van energie en 106 tot 108 van ionen – puls-1 niveaus, die e0 → 0. In het algemeen werd voldoende overeenstemming tussen de berekeningen en de experimentele gegevens verkregen. Voor de bij 68 AMeV behandelde stammen onderschatte de vergelijking de doeltreffendheid van de dosis, terwijl voor de cellen die bij hoge energieën (114 AMeV) werden bestraald, het resultaat werd overschat. De maximale afwijking, afgeleid uit de verhouding tussen berekende en gemeten doses voor een bepaald effectniveau, bedroeg 15%. De overlevingsfractie van de stammen hing sterk af van de bijzondere fysische kenmerken van de 12C6+-ionenbundel, zoals bepaald door de energie, de dosis en de ionen – puls-1 niveaus van de beschouwde deeltjes (figuur 1). Het is duidelijk dat de overlevingsfractie afnam met toenemende koolstofionenergie. Zoals verwacht vertoonde de logaritmische overleving dezelfde kenmerken: de overleving was afhankelijk van de energie, de ionenpuls-1 en de dosis van de 12C6+-ionenbestraling. De toename van één fysische parameter per keer leidde tot een afname van de overleving. Een zeer beperkte overleving (e-3,5 → e-6,5) werd verkregen wanneer het 12C6+-ion werd bestraald met 114 AMeV energie, een dosis van 20 tot 40 Gy en 106 tot 108 ionen-puls-1.
Het effect van bestraling met 12C6+-ionen op de overleving van Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. De cellen werden 20 uur na het zaaien bestraald en de mate van overleving werd bepaald met MTT-tests. De overlevingsgegevens zijn uitgezet tegen de bestralingsniveaus. (A-C) 12C6+-ionen werden versneld tot 68 AMeV, en hun ionen/puls varieerde van 106 tot 108, bij een dosistempo van 10 tot 50 Gy. (D-F) 12C6+ -ionen werden versneld tot 114 AMeV, en hun ionen/puls varieerden van 106 tot 108, bij een dosistempo van 10 tot 50 Gy. Cellen met een lage metabolische activiteit en een langzame proliferatie of cellen die ophouden met prolifereren werden van de proef uitgesloten door wassen en trypsiniseren wanneer de uitplating na bestraling werd uitgevoerd.
Vele celtypes worden gekenmerkt door een regelmatige celdeling om de 12 tot 24 uur. Door de kracht van exponentiële groei kan één enkele cel duizenden dochtercellen produceren binnen ongeveer 9 tot 12 normale delingscycli, d.w.z. een paar dagen. Na bestraling kunnen de overlevenden dan bestaan uit enkele mutanten. Een zeer klein percentage van de overlevenden van C. tyrobutyricum ATCC 25755 kan een verbeterd vermogen vertonen om butyraat te produceren.
De effecten van boterzuur op de celgroei na bestraling
C. tyrobutyricum ATCC 25755 gebruikt glucose of xylose als koolstof- en energiebron. De monosacharide wordt in de cel getransporteerd via een fosfoenolpyruvaat-afhankelijk fosfotransferase-opnamesysteem. Daarna wordt glucose of xylose gemetaboliseerd via glycolyse, die een onbeduidende pH-afhankelijkheid vertoont in het bereik van pH 7 tot pH 5,5. De fermentaties werden echter gestopt wanneer glucose of xylose niet langer door de cellen werd verbruikt, als gevolg van remming door butyraat. Om het specifieke effect van bestraling op de celgroeiprofielen (gebaseerd op metingen van de optische dichtheid (OD) van de celsuspensie bij 600 nm) verder te onderzoeken, werden individuele batchculturen uitgevoerd in chemisch gedefinieerd P2-medium (uitgevoerd in serumflessen) dat 42 g-L-1 glucose bevatte en aangevuld was met 3,6, 7,2 en 10,8 g-L-1 boterzuur. De pH van de cultuur van C. tyrobutyricum ATCC 25755 (Figuur 2A, controle) daalde tot ongeveer 4,8 (ΔpH van 1,4, van pH 6,2) in vergelijking met wanneer het werd aangevuld met 3,6 g-L-1 van boterzuur (Figuur 2A1), 7.2 g-L-1 boterzuur (figuur 2A2) en 10,8 g-L-1 boterzuur (figuur 2A3), bedroegen de overeenkomstige pH-waarden respectievelijk ongeveer 6,0 (ΔpH van 0,5, vanaf 6,5), 6,1 (ΔpH van 0,3, vanaf 6,4) en 5,9 (ΔpH van 0,5, vanaf 6,4). Wanneer de cultuur echter bestraald werd met 68 AMeV bij een dosis van 40 Gy (Figuur 2D, controle), daalde de pH tot ongeveer 4,8 (ΔpH van 1,7 uitgaande van 6,5) terwijl bij een dosis van 40 Gy (aangevuld met 3,6 g-L-1 boterzuur) (Figuur 2D1), een dosis van 40 Gy (aangevuld met 7.2 g-L-1 boterzuur) (figuur 2D2) en een dosis van 40 Gy (aangevuld met 10,8 g-L-1 boterzuur) (figuur 2D3), waren de pH-waarden respectievelijk ongeveer 4,6 (ΔpH van 1,6 vanaf 6,2), 4,8 (ΔpH van 1,4 vanaf 6,2) en 5,9 (ΔpH van 0,3 vanaf 6,2). Wanneer de cultuur werd bestraald bij 114 AMeV en een dosis van 40 Gy (figuur 2G, controle), daalde de pH tot ongeveer 5,7 (ΔpH van 0,6 uitgaande van 6,3), terwijl bij een dosis van 40 Gy (aangevuld met 3,6 g-L-1 boterzuur) (figuur 2G1), een dosis van 40 Gy (aangevuld met 7.2 g-L-1 boterzuur) (figuur 2G2) en een dosis van 40 Gy (aangevuld met 10,8 g-L-1 boterzuur) (figuur 2G3), de pH-waarden respectievelijk ongeveer 5,7 (ΔpH van 0,6 vanaf 6,3), 5,4 (ΔpH van 0,9 vanaf 6,3) en 5,6 (ΔpH van 0,7 vanaf 6,3) bedroegen. Wanneer de cultuur werd bestraald bij 68 AMeV en een dosis van 20 Gy (aangevuld met 7,2 g-L-1 boterzuur) (Figuur 2B2), daalde de pH tot ongeveer 4,4 (ΔpH van 0,9 vanaf 6,3), terwijl bij een dosis van 30 Gy (aangevuld met 7.2 g-L-1 boterzuur) de pH daalde tot ongeveer 4,4 (ΔpH van 0,9 vanaf 6,3).2 g-L-1 boterzuur) (figuur 2C2) en een dosis van 40 Gy (aangevuld met 7,2 g-L-1 boterzuur) (figuur 2D2), de pH-waarden ongeveer 4,6 (ΔpH van 1,7 uitgaande van 6,3) en 4,8 (ΔpH van 1,5 uitgaande van 6,3) waren, respectievelijk. Wanneer de cultuur werd bestraald bij 114 AMeV en een dosis van 40 Gy (aangevuld met 10,8 g-L-1 boterzuur) (figuur 2E3), daalde de pH-waarde tot 5,9 (ΔpH van 0,4 uitgaande van 6,3) terwijl bij een dosis van 30 Gy (aangevuld met 10,8 g-L-1 boterzuur) (figuur 2F3) en een dosis van 40 Gy (aangevuld met 10,8 g-L-1 boterzuur) (figuur 2G3), de pH-waarden ongeveer 6,0 (ΔpH van 1,7 uitgaande van 6,3) en 4,8 (ΔpH van 1,5 uitgaande van 6,3) bedroegen.0 (ΔpH van 0,3 uitgaande van 6,3) en 5,8 (ΔpH van 0,5 uitgaande van 6,3), respectievelijk.
Tijdsverloop van de activiteiten van wild-type en bestraalde cellen als functie van de toegevoegde boterzuurconcentraties tijdens de eerste 54 uur van de fermentatie. (A) Celgroei van de wild-type stammen, niet beïnvloed door de toevoeging van butyraat (controleculturen). (B-D) Celgroei van de bestraalde stammen (energie 68 AMeV en doses van 20, 30 en 40 Gy), niet beïnvloed door de toevoeging van butyraat (controleculturen). (E,F) Celgroei van de bestraalde stammen (energie 114 AMeV en doses van 20, 30 en 40 Gy), niet beïnvloed door de toevoeging van butyraat (controleculturen). ( A1-A3) De effecten van toegevoegd butyraat op de groei van wild-type cellen. Individuele batchculturen werden uitgevoerd in chemisch gedefinieerd P2-medium (uitgevoerd in serumflessen) dat glucose (ongeveer 42 g-L-1) bevatte en aangevuld was met 3,6 (A1), 7,2 (A2) en 10,8 g-L-1 (A3) butyraatzuur. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) Het effect van toegevoegd butyraat op de groei van de bestraalde cellen (energie 114 AMeV en doses van 20, 30 en 40 Gy). Individuele batchculturen werden uitgevoerd in chemisch gedefinieerd P2-medium (uitgevoerd in serumflessen) dat glucose (ongeveer 42 g-L-1) bevatte en aangevuld was met 3,6 (X1), 7,2 (X2) en 10,8 g-L-1 (X3) boterzuur. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) De effecten van toegevoegd butyraat op de groei van de bestraalde cellen (energie 114 AMeV en doses van 20, 30 en 40 Gy). Individuele batchculturen werden uitgevoerd in chemisch gedefinieerd P2-medium (uitgevoerd in serumflessen) met glucose (ongeveer 42 g-L-1) en aangevuld met 3,6 (X1), 7,2 (X2) en 10,8 g-L-1 (X3) boterzuur.
Deze verschillen in pH reguleren de temporele omschakeling die gepaard gaat met de vorming van oplosmiddelen voor elke bestraalde stam. Dit suggereert dat de wild-type en bestraalde stammen een bifasisch metabolisch patroon vertoonden dat sterk werd beïnvloed door de pH van het medium. Als algemene trend verbruikten de cellen aanvankelijk glucose om de groei te ondersteunen en produceerden en scheidden ze organische zuren (butyraat en acetaat) uit als primaire metabolieten (acidogenese), die een daling van de pH van het medium veroorzaakten wanneer ze zich tot bepaalde niveaus ophoopten. Door deze verhoging van de zuurgraad van de bouillon verschoof de vorming van zuren in de richting van de productie van oplosmiddelen wanneer de cultuur de stationaire fase van de celgroei bereikte (solventogenese). Bij een hoge pH worden voornamelijk organische zuren gevormd, terwijl bij een lage pH de productie van oplosmiddelen wordt gestimuleerd. Zoals verwacht waren de aard van de metabolische verschuiving en het kinetische patroon van de solventvorming stamafhankelijk, aangezien bestraalde stammen hun eigen intrinsieke genetische en metabolische kenmerken vertoonden. Van boterzuur is eerder gemeld dat het de celgroei remt. Uit de resultaten bleek dat er bij de wild-type stammen een geleidelijke remming van de celgroei optrad, waarbij geen realistische groei werd waargenomen bij boterzuurconcentraties boven 3,6 g-L-1. Bij de bestraalde stammen was er echter geen geleidelijke remming van de celgroei en werd er geen realistische groei waargenomen bij boterzuurconcentraties boven 10,8 g-L-1.
Om het effect van toegevoegd butyraat meer in detail te onderzoeken, werden de celgroeiprofielen (gebaseerd op OD-metingen) voor de wild-type stammen en bestraalde stammen vergeleken (Figuur 2A1-G3) gedurende de eerste 54 uur van de fermentatie. Interessant is dat de boterzuurtolerantie van de stammen sterk werd verbeterd wanneer de energie en de dosis van de 12C6+-ionenbestraling werd verhoogd. De metabolische routes van het glucosemetabolisme in C. tyrobutyricum ATCC 25755 worden getoond in Figuur 3. Het acetyl-CoA, acetoacetyl-CoA en butyryl-CoA zijn drie belangrijke tussenproducten, en zijn van bijzonder belang voor fermentatie met betrekking tot het potentieel voor de vorming van verschillende producten tijdens acidogenese of solventogenese. Deze tussenproducten zijn belangrijke vertakkingen die de metabolische stroom ofwel naar zuur ofwel naar solventvorming leiden. Het laatste belangrijke tussenproduct, butyryl-CoA, initieert de vorming van boterzuur/butyraat. Butyraat wordt geproduceerd door de opeenvolgende activiteiten van PTB, en BK . Beide enzymen zijn het actiefst tijdens de acidogenese en hun specifieke activiteiten nemen af tijdens de solventogenese, twee-voudig voor PTB en zes-voudig voor Buk . Gewoonlijk is een sterke pH-afhankelijke activiteit met een in vitro optimum bij acidogene pH-waarden van pH 5,5 (optimaal rond pH 4,7) en een in vivo (endogene) pH groter dan 5,5 vereist om solventogenese te induceren. Toch bracht een vergelijkende analyse van deze kavels duidelijk één grote cluster aan het licht, bestaande uit de stammen die bestraald zijn met 68 AMeV en 40 Gy en de stammen die bestraald zijn met 114 AMeV en doses van 30 en 40 Gy. De twee groepen vertoonden een zeer vergelijkbare algemene tolerantie voor toenemende butyraatconcentraties in vergelijking met de wild-type bacteriën.
Metabolische routes van het glucosemetabolisme in Clostridium tyrobutyricum . Enzymen worden als volgt met letters aangeduid: lactaatdehydrogenase; pyruvaat-ferredoxine oxidoreductase; NADH-ferredoxine oxidoreductase; NADPH-ferredoxine oxidoreductase; hydrogenase; fosfaatacetyltransferase (fosfotransacetylase); acetaat kinase; acetaldehyde dehydrogenase; ethanol dehydrogenase; thiolase (acetyl-CoA acetyltransferase); acetoacetyl-CoA; acetaat/butyraat:CoA-transferase; acetoacetaat-decarboxylase; 3-hydroxylbutyryl-CoA-dehydrogenase; crotonase; butyryl-CoA-dehydrogenase; fosfaatbutyletransferase (fosfobutyrylase); butyraatkinase.
Effect van 12C6+-ionenbestraling op de boterzuurproductie
De boterzuurproductie van de bestraalde stammen was sterk verbeterd, zowel wat betreft de eindconcentratie van het product als wat betreft de opbrengst in vergelijking met de wild-type stam, zoals blijkt uit figuur 4B,E. De niet bestraalde (wild-type stam, controle) C. tyrobutyricum cultuur geïnoculeerd in glucose-minimale media begon bijna onmiddellijk suiker te verbruiken, waarbij de boterzuurproductie 12 tot 18 uur later begon (figuur 4A,B). Dezelfde controlecultuur geïnoculeerd in een clostridiaal groeimedium (CGM) met 60 g-L-1 glucose had meer dan 96 uur nodig om te acclimatiseren, ondanks het feit dat de bestraalde stammen en de fermentaties met de wild-type stammen onder dezelfde omstandigheden werden getest. De langere periode van minimaal metabolisme en minimale productiviteit komt doordat de bestraling (verschillende parameters) een vertraging in de logfase van de celgroei veroorzaakte (Figuur 4C,F). De boterzuurtolerantie van de bestraalde stammen was sterk verbeterd, waardoor zij meer boterzuur konden produceren, wat resulteerde in volledige glucosebenutting en productie van meer dan 32 g-L-1 boterzuur en vergelijkbare niveaus van celbiomassa. Bovendien nam de boterzuur/controle-verhouding toe van 1,0 voor de wild-type stam tot 1.52 voor de stammen die bestraald werden met 114 AMeV en 40 Gy, 1.37 voor de stammen die bestraald werden met 114 AMeV en 30 Gy, 1.41 voor de stammen die bestraald werden met 68 AMeV en 40 Gy, en 1.31 voor de stammen die bestraald werden met 68 AMeV en 30 Gy. Deze tendens wijst erop dat de koolstof- en energieflux in de metabole routes van de bestraalde stammen werden herverdeeld, wat ook resulteerde in aanzienlijke veranderingen in de productie van verschillende gistingsproducten. Opgemerkt moet worden dat de azijnzuurproductie (gegevens niet weergegeven) tijdens de fermentatie veel eerder afvlakte dan de butyraat/boterzuurproductie. De fermentaties stopten toen de glucose niet langer door de cellen werd verbruikt, als gevolg van een ophoping van organische zuren en afvalproducten in de bouillon, die remming van de celgroei en andere activiteiten veroorzaakte. De bestraalde stammen waren echter toleranter voor boterzuur, zoals blijkt uit de veel hogere butyraatconcentratie die uiteindelijk werd bereikt in de fermentaties met deze bestraalde stammen in vergelijking met de wild-type. Dit is niet helemaal verrassend; zoals blijkt uit figuur 3, kan de verhoogde boterzuurtolerantie van de bestraalde stammen ook worden toegeschreven aan de verminderde flux door de butyraat PTA/AK-route. Aangezien de bestraalde stammen niet langer afhankelijk waren van de PTA/AK-route voor energieproductie en overleving, werden zij minder gevoelig voor remming door boterzuur.
Vergelijking van de zuur- en biomassa drooggewicht productie van wild-type en bestraalde C. tyrobutyricum gekweekt op glucose (met 60 g-L-1) in clostridiaal groeimedium bij 37°C bij pH 5,5 en 6,0. (A-C) Effect van bestraling met 12C6+-ionen (energie 68 AMeV en doses van 20, 30 en 40 Gy) op de glucoseconcentratie, de boterzuurproductie en het drooggewicht van de biomassa. (D-F) Effect van bestraling met 12C6+-ionen (energie 114 AMeV en doses van 20, 30 en 40 Gy) op de glucoseconcentratie, de boterzuurproductie en het drooggewicht van de biomassa. (G) SDS-PAGE van cellulaire eiwitten van C. tyrobutyricum. Rij WT: wildtype; rij 1: cellen bestraald bij 68 AMeV en een dosis van 30 Gy; rij 2: cellen bestraald bij 68 AMeV en een dosis van 40 Gy; rij 3: cellen bestraald bij 114 AMeV en een dosis van 30 Gy; rij 4: wildtype en cellen bestraald bij 114 AMeV en een dosis van 40 Gy; rij MW: markers voor het moleculaire gewicht van eiwitten.
Inductie van de ack- en pta-genen, die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de acetaatvormingsroute, verbetert de boterzuurproductie aanzienlijk. Om een beter inzicht te krijgen in de fermentatiekinetiek van het glucosemetabolisme na blootstelling van C. tyrobutyricum aan 12C6+-ionenbestraling en de daaruit voortvloeiende schade aan de ack- en pta-genen, werd de eiwitexpressie van wild-type en bestraalde stammen bestudeerd en vergeleken. Figuur 4G toont de resultaten van SDS-PAGE. De analyse bevestigde de expressie van het eiwit (molecuulgewicht, ongeveer 85 kDa) in vier bestraalde stammen, met het hoogste niveau van eiwitexpressie in rijstrook 4. De hoeveelheid van een eiwit van ongeveer 106 kDa was veel hoger voor de stam die was bestraald met 114 AMeV en 40 Gy dan de wild-type stam. AK en PTA van verschillende micro-organismen zijn gekarakteriseerd, maar de resultaten vertoonden grote variaties in hun molecuulgewicht. Enzymactiviteitstests werden dus uitgevoerd om de rol van AK, PTA en PTB in de zuurvormende routes verder te bestuderen (figuur 3). De metabole selectiviteit in C. tyrobutyricum wordt beïnvloed door het groeistadium, waarbij exponentieel groeiende culturen zowel boterzuur als azijnzuur produceren, terwijl tragere stationaire groeisnelheden de neiging hebben boterzuur te produceren. Daarom werden tijdens de log-fase groei van elke batch cultuurmonsters verwijderd en geanalyseerd op de activiteiten van PTA, PTB en AK in de bestraalde en wild-type stammen. De specifieke enzymactiviteiten voor PTA, PTB en AK in de bestraalde stammen (verschillende fysische parameters) werden bepaald en hun relatieve activiteiten werden vergeleken met die van de wild-type stam. De AK-activiteit was verminderd met ongeveer 47% voor de stammen die bestraald waren met 114 AMeV en 40 Gy, 31% voor de stammen die bestraald waren met 114 AMeV en 30 Gy en 26% voor de stammen die bestraald waren met 68 AMeV en 40 Gy. Vergeleken met de wild-type stammen hadden de stammen die bestraald waren met 114 AMeV en 40 Gy een lagere AK-activiteit (47%) maar een onverwacht hogere PTA-activiteit (129%), hoewel de PTB-activiteiten vergelijkbaar waren. Omdat de bij 114 AMeV bestraalde stammen een veel lagere AK-activiteit hadden, zou de PTA-AK-route verzwakt zijn en produceerden zij dus meer butyraat (60 g-L-1) uit glucose dan de wild-type stammen. Zoals eerder vermeld, kunnen deze verbeteringen worden toegeschreven aan een verhoogde tolerantie voor butyraatremming en tot op zekere hoogte aan de verminderde koolstofflux door de PTA-AK-route, zoals blijkt uit de verhoogde butyraat/acetaatverhouding bij de bestraalde stammen.
Effect van 12C6+ bestraling op zuuropbrengst en groei van C. tyrobutyricum
Een experiment werd uitgevoerd in fermentatiemodus met glucose als primaire koolstofbron om de butyraatproductiecapaciteit van C. tyrobutyricum ATCC 25755 na bestraling te bepalen. Zoals kan worden gezien in figuur 5A,B, steeg de opbrengst aan boterzuur uit glucose aanzienlijk, van 0,43 g-g-1 voor de wild-type stammen tot 0,56 g-g-1 voor de stam die bestraald werd met 68 AMeV en een dosis van 30 Gy, 0,56 g-g-1 voor de stam die bestraald werd met 68 AMeV en een dosis van 30 Gy.59 g-g-1 voor de stam die is bestraald bij 68 AMeV en een dosis van 40 Gy, 0,63 g-g-1 voor de stam die is bestraald bij 114 AMeV en een dosis van 30 Gy, en 0,66 g-g-1 voor de stam die is bestraald bij 114 AMeV en een dosis van 40 Gy. Er zij op gewezen dat de butyraatopbrengst voor de bij 114 AMeV en een dosis van 40 Gy bestraalde stam hoger zou zijn geweest (>0,66 g-g-1) als het glucoseverbruik tijdens de lagefase werd verwaarloosd. Het azijnzuur geproduceerd door de bij 68 AMeV en doses van 30 en 40 Gy bestraalde stam was vergelijkbaar met dat van het wildtype. Het azijnzuur geproduceerd door de stam bestraald bij 114 AMeV en doses van 30 en 40 Gy daalde echter in vergelijking met dat van het wilde type. Zoals blijkt uit figuur 5B, daalde de opbrengst aan azijnzuur uit glucose ook aanzienlijk, van ongeveer 0,11 g-g-1 voor de wild-type stam tot ongeveer 0,08 g-g-1 voor de stam die bestraald werd met 114 AMeV en 30 Gy, en ongeveer 0,07 g-g-1 voor de stam die bestraald werd met 114 AMeV en 40 Gy. Niettemin steeg de butyraat/acetaat-verhouding (g/g) van 3,99 voor de wild-type stam tot 5,82 voor de bestraalde stammen, een duidelijke aanwijzing dat de metabolische routes in de bestraalde stammen werden verlegd ten gunste van de productie van boterzuur boven de productie van azijnzuur. Zoals blijkt uit figuur 3, moet, aangezien de AK- en PTA-activiteiten in de bestraalde stammen aanzienlijk waren verlaagd, meer pyruvaat zijn gekataboliseerd via de butyraatproducerende route, wat heeft geleid tot een hogere butyraatopbrengst uit glucose. Bovendien kan het boterzuur ook hebben bijgedragen tot een vroegere overschakeling op de zuurproducerende route, wat tot uiting kan zijn gekomen in een tragere groeisnelheid. Om dezelfde reden hadden de bestraalde monsters te lijden van een tragere groeisnelheid omdat minder ATP werd geproduceerd uit de acetaat-producerende (PTA-AK) route, die normaal gesproken meer ATP per mol gemetaboliseerd glucose kan genereren dan de butyraat-producerende (PTB-BK) route.
Vergelijking van de zuurproductie voor de wild-type en bestraalde C. tyrobutyricum-cellen. (A) De productie van boterzuur en azijnzuur werd geschat op basis van de hellingen van de lineaire plots voor de wild-type cellen en de cellen die bestraald waren met 68 AMeV en doses van 30 en 40 Gy. (B) De productie van boterzuur en azijnzuur is geschat op basis van de hellingen van de lineaire plots voor de wild-type cellen en de cellen die zijn bestraald met 114 AMeV en doses van 30 en 40 Gy. (C) Linearisering (integratie) van de kinetische groeiprofielen van het drooggewicht van de biomassa in de tijd met behulp van een natuurlijke logaritmische transformatie. De maximale specifieke groeisnelheden voor de wild-type en de bestraalde cellen werden berekend volgens het voorbeeld dat gegeven werd voor de cellen die bestraald werden met 114 AMeV en een dosis van 40 Gy en gekweekt werden in Clostridium groeimedium met 60 g-L-1 glucose. BDW, biomassa drooggewicht.
Een plot van μ max werd vervolgens bepaald bij hoge concentraties van initieel glucose (40, 60, 80 en 120 g-L-1) door de fermentatiegegevens te passen aan de voorspellingen van de modelsimulatie. Linearisering (integratie) van de kinetische groeiprofielen van het drooggewicht van de biomassa (BDW) in de tijd werd bereikt door gebruik te maken van de natuurlijke logaritmische transformatie:
Waarbij x(t) = BDW-concentratie op elk tijdstip x 0 ; t = oorspronkelijke BDW-concentratie; μ max = maximale specifieke groeisnelheid (h-1); en de specifieke groeisnelheid is μ = (1/x(t)) – (dx/dt). Ter vereenvoudiging werd aangenomen dat alle bacteriën de exponentiële wet van celgroei volgden in een batchcultuur volgens een eersteordekinetisch model. De specifieke groeisnelheid van de cellen, of de toename van de celmassa in de tijd, vertegenwoordigt een verschuiving in selectiviteit bij verschillende groeisnelheden, wat een aanzienlijke invloed heeft op het fermentatieproces . Snelle celgroei heeft een hogere energiebehoefte en produceert bij voorkeur azijnzuur. Bij lage groeisnelheden wordt de productie van boterzuur bevoordeeld ten opzichte van azijnzuur. Bij continue fermentatie is de productie van butyraat/boterzuur hoger wanneer μ lager is. Wanneer μ naar nul neigt, treedt een oscillatie in de productiviteit op . Deze vergelijkingen maken een vergelijking mogelijk van de groeisnelheid van batch- en continue systemen bij de wild-type en de bestraalde stammen.
Het model is niet media-onafhankelijk: de gebruikte media zoals hierboven beschreven beïnvloeden zowel de celgroeisnelheid als de geproduceerde hoeveelheden butyraat/boterzuur, en verschillende glucoseconsumptieprofielen zouden verschillende resultaten opleveren. Om de optimale glucoseconcentratie voor de celgroei beter te kwantificeren, werden de maximale specifieke groeisnelheden voor de wild-type en bestraalde stammen bepaald aan de hand van kinetische gegevens uit de exponentiële groeifase en uitgezet tegen de concentratie toegevoegde glucose. Zoals te zien is in figuur 5C, zijn de maximale specifieke groeisnelheden voor de bij 114 AMeV en een dosis van 40 Gy bestraalde stammen berekend volgens het voorbeeld waarbij de stam werd gekweekt in CGM-medium dat 60 g-L-1 glucose bevatte. Het beste lineaire bereik van datapunten werd gekozen dat overeenkomt met de exponentiële groeifase van de stam. In sommige gevallen, wanneer niet aan de minimumeis van drie experimentele datapunten werd voldaan, werd een alternatieve uitdrukking gebruikt die slechts met twee extreme punten (aan het begin en aan het einde van de exponentiële fase) rekening hield. De richtingscoëfficiënt van de rechte lijn (m = μmax) geeft de maximale specifieke groeisnelheid (0,213 h-1). Het unaire lineaire regressiemodel (y = 0,2129x – 2,6457) had een aangepaste determinatiecoëfficiënt van R2 = 0,9765, wat aangeeft dat alle gegevenspunten op de best passende lijn liggen en geen gegevenspunten van deze lijn afwijken. Bovendien werd elke specifieke groeisnelheid geschat uit de helling van de overeenkomstige semi-logaritmische plot van de BDW tegen de tijd. Foutbalkjes worden uitgedrukt als de standaardafwijking (SD) verkregen uit berekeningen van elk onafhankelijk fermentatie-replicaat voor de bestraalde stammen en het wilde type (de oorspronkelijke gegevens worden niet getoond). Uit de resultaten blijkt dat deze bestraalde stammen een significant lagere specifieke groeisnelheid hadden (μ = 0,38 ±0,03 tot 0,21 ±0,02 h-1) in vergelijking met het wilde type (μ = 0,38 tot 0,42 h-1). Het gebruik van 12C6+-ionenbestraling bij 68 AMeV, 20 tot 40 Gy en 106 tot 108 ionenpuls-1 resulteerde in bijzonder lange vertragingsfasen van respectievelijk 10, 12 en 16 uur. Ter vergelijking: bestraling met 12C6+-ionen bij 114 AMeV, 20 tot 40 Gy en 106 tot 108 ionenpuls-1 resulteerde in vertragingsfasen van respectievelijk 12, 18 en 24 uur. Deze langere vertragingsfasen kunnen gedeeltelijk worden toegeschreven aan de verschillende bestralingsparameters en de lage dichtheid van de inoculatiehoeveelheid die bij de fermentatie werd gebruikt. De lagere specifieke groeisnelheid voor de bestraalde cellen kan een gevolg zijn van de metabolische belasting van de cellen als gevolg van de lagere hoeveelheid energie die door het glucosemetabolisme wordt gegenereerd als gevolg van de schade die bij hogere energie en doses wordt veroorzaakt. Vergeleken met de wild-type stammen vertoonden de 20 en 30 Gy bestraalde stammen bij 68 AMeV vergelijkbare groei- en glucoseverbruiksprofielen, met een bijna identieke specifieke groeisnelheid van μ = 0,42 ±0.03 h-1, terwijl de met 30 en 40 Gy bestraalde stammen bij 114 AMeV een aanzienlijk langere vertragingsfase vertoonden, een trager glucoseverbruik en een veel lagere specifieke groeisnelheid van μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) en μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Zoals eerder opgemerkt, wordt acetaat gesynthetiseerd via PTA- en AK-reacties, waarbij de laatste reactie ATP oplevert (figuur 3). Voor de biosynthese van butyraat worden twee moleculen acetyl-CoA gecondenseerd tot acetoacetyl-CoA, gevolgd door een reductie tot butyryl-CoA, dat vervolgens wordt omgezet in butyraat via PTB- en BK-reacties waarbij ATP wordt gegenereerd. De lagere specifieke groeisnelheid voor de bestraalde stammen (energie 114 AMeV en doses van 30 en 40 Gy) kan worden toegeschreven aan de metabolische belasting van de cellen door minder energie (ATP) generatie tijdens het glucosemetabolisme als gevolg van bestralingsschade van ack en pta. De BDW uit glucose voor de bestraalde stammen verschilde ook van de wild-type stammen. De plot van BDW versus tijd en specifieke groeisnelheid van de bestraalde stammen gaf aan dat de koolstof- en energieflux herverdeeld werden over de metabolische routes van deze stammen, wat ook resulteerde in significante veranderingen in de zuurproductie van fermentatieproducten.