Structure of human lysosomal acid α-glucosidase-a guide for the treatment of Pompe disease

Structural overview

GAA wordt gesynthetiseerd als een 110 kDa glycoproteïne, dat via de mannose-6-fosfaatreceptor in het lysosoom terechtkomt en daar in het late endosomale/lysosomale compartiment een reeks proteolytische en N-glycaanbewerkingen ondergaat om een rijpe actieve vorm te verkrijgen die bestaat uit vier strak geassocieerde peptiden19,20. Omdat kristallisatie van de commerciële Myozyme ® precursor vorm van rhGAA (Q57-C952) niet veroorloven kristallen diffracting verder dan ~ 7 Å en eiwit stoornis voorspellers21 aangegeven dat de aanwezigheid van ongeordende peptide regio’s, voerden we in situ proteolyse met α-chymotrypsine aan vermoedelijke flexibele oppervlak lussen belemmeren de vorming van productieve kristalcontacten te verwijderen. De proteolytische behandeling leverde een polypeptide van ~ 5 kDa lagere massa dan de rhGAA precursor (Fig. 2a), die gemakkelijk gekristalliseerd. Hierdoor konden we diffractiegegevens verzamelen die zich uitstrekten tot 1,9 Å en de structuur van rhGAA oplossen door moleculaire vervanging (tabel 1). De proteolytisch verteerde vorm had een activiteit die vergelijkbaar was met die van de precursor (2,34 ± 0,06 en 2,26 ± 0,16 U mg-1 voor respectievelijk de precursor en de rijpe vorm), wat erop wijst dat de α-chymotrypsinebehandeling de functionaliteit van rhGAA niet heeft veranderd.

De kristalstructuur van rhGAA komt overeen met de rijpe vorm van humaan placentair GAA en rhGAA20 (Fig. 2b), wat suggereert dat behandeling met α-chymotrypsine de protease-labiele regio’s (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 en A782-R794) heeft verwijderd op een wijze die vergelijkbaar is met de proteolytische rijping die in vivo plaatsvindt. De algemene architectuur van rhGAA is vergelijkbaar met die van de menselijke glycoside hydrolase familie GH311 homologen, de intestinale borstelgrens enzymen maltase-glucoamylase (MGAM)22,23 en sucrase-isomaltase (SI)24 (Fig. 2c en Supplementary Fig. 1). Een N-terminaal trefoil type-P domein wordt gevolgd door een β-sheet domein, het katalytische (β/α)8 vat met twee inserts na β-strengen β3 (insert I) en β4 (insert II), en proximale en distale β-sheet domeinen aan de C-terminus. De precursorvorm van rhGAA bevat ~14 kDa carbohydraat en er zijn zeven glycosyleringsplaatsen voorspeld en gekarakteriseerd20. In de kristalstructuur hebben wij voor vijf daarvan glycaanstructuren van verschillende lengte waargenomen, met name bij N140, N233, N390, N470 en N652 (Fig. 2c en supplementaire Fig. 2). We ontdekten restverschil elektronendichtheid bij N882, onvoldoende om een glycaanstructuur te modelleren, en namen geen verschil elektronendichtheid waar bij N925.

Actieve plaats en remmerbinding

De smalle substraatbindingszak van rhGAA bevindt zich nabij de C-terminale uiteinden van β-strengen van het katalytische (β/α)8 domein en wordt gevormd door een lus van het N-terminale β-sheet domein en zowel inserts I als II (Fig. 2c). De enzymen van de familie GH31 verrichten hun katalyse via een klassiek Koshland dubbel verdringingsreactiemechanisme met behoud van de anomere koolstofconfiguratie in het product. Uit vroege karakterisering van de katalytische plaats van GAA25 en door homologie met mechanistisch ontleedde leden van familie GH3126,27, kunnen het katalytische nucleofiel en zuur/base worden toegewezen aan respectievelijk D518 en D616. Om inzicht te krijgen in de interactie van rhGAA met het gedocumenteerde farmacologische chaperon 1-deoxynojirimycine16,28 en zijn derivaat N-hydroxyethyl-deoxynojirimycine29 (DNJ en NHE-DNJ, respectievelijk), weekten we rhGAA kristallen met deze actieve site gerichte iminosugar remmers en verkregen voor beide complexen diffractiegegevens die reiken tot 2.0 Å resolutie (Tabel 1). DNJ bindt in een 4C1-conformatie in de substraat-bindende subsite -130 en wordt gestabiliseerd door waterstofbruggen met de zijketens van D404, D518, R600, D616, en H674. Verdere stabiliserende interacties worden gevormd door hydrofobe contacten met W376, I441, W516, M519, W613, en F649 (Fig. 3a, b). Afgezien van een kanteling van 20° in de zijketen van W376 treden er geen grote conformatieveranderingen op bij binding van DNJ in het actieve gebied van rhGAA. Dit is niet het geval bij binding van NHE-DNJ, dat dezelfde houding aanneemt als DNJ, maar waar de hydroxyethylsubstituent substantiële conformatieveranderingen in de zijketens van M519 en W481 induceert (Fig. 3c, d). In deze ligand-geïnduceerde conformatie, vestigt rhGAA residu W481, gelegen op het uiteinde van insert I, een stabiliserende interactie met de hydroxyethyl substituent van NHE-DNJ. Soortgelijke conformatieveranderingen kunnen worden waargenomen bij binding van NHE-DNJ aan de N-terminale subeenheid van MGAM (NtMGAM)31 (supplementaire Fig. 3a).

Substraatherkenning en specificiteit

Om een beeld te krijgen van de substraatherkenning door rhGAA, hebben we de diffractiegegevens tot 2,45 Å resolutie verkregen voor een rhGAA-kristal doordrenkt met acarbose, een niet-cleavable α-1,4-tetrasaccharide substraatanaloog (tabel 1). In dit complex, de valienamine ring ondergebracht in subsite -1 neemt een 2H3 half-chair conformatie, maar ondanks deze conformationele verschil ten opzichte van DNJ gebonden in de 4C1 half-chair conformatie, de waterstof-binding patroon in subsite -1 is in wezen identiek voor de twee verbindingen (Fig. 3e, f en aanvullende Fig. 3b). De niet-hydrolyseerbare “interglycoside” stikstof bezet het katalytische centrum en is waterstofgebonden aan het katalytische zuur/base D616. Het 6-deoxyglucosylgedeelte in subsite + 1 vormt via zijn 2- en 3-hydroxylgroepen waterstofbruggen met de geconserveerde R600 en met D282 afkomstig van een lus in het N-terminale β-sheet domein. Hoewel niet geconserveerd in sequentie, interageren residuen van deze lus onveranderlijk met koolhydraat liganden in alle beschikbare kristalstructuren van GH31 leden van de familie. De maltose-eenheid van acarbose in subsites + 2 en + 3 heeft geen directe interacties met rhGAA en wordt eerder gestabiliseerd door kristalrooster-pakkingsinteracties en een water-gemedieerd contact met de zijketen van W618, gelegen aan de rand van de substraat-bindende zak. Deze schaarste aan interacties suggereert dat rhGAA slechts twee productieve substraatbindingsplaatsen bezit, subsites -1 en + 1, maar interessant is dat het acarbose-maltose-gedeelte gebonden aan rhGAA dezelfde algemene houding aanneemt als wanneer het gebonden is aan NtMGAM22 , wat suggereert dat subsites + 2 en + 3 in rhGAA ook een functionele rol spelen (Supplementary Fig. 3c).

Glycogeen is een groot polymeer opgebouwd uit lineaire ketens van α-1,4-gekoppelde glucose-residuen met α-1,6-gekoppelde vertakkingen. In het cytosol wordt het energieopslagdeeltje afgebroken door de gelijktijdige werking van glycogeenfosforylase en een debranching-enzym. In het lysosoom is geen debranching-enzym aanwezig en moet GAA zorgen voor de hydrolyse van zowel α-1,4- als α-1,6-glycosidebindingen. rhGAA vertoont echter een duidelijke voorkeur voor de eerstgenoemde binding, aangezien de specificiteitconstante voor maltose 32-maal hoger is dan voor isomaltose (aanvullende tabel 2). Om de structurele basis voor de dubbele substraatspecificiteit te achterhalen, hebben we geprobeerd rhGAA kristallen te weken met het niet-hydrolyseerbare tetrasaccharide glucopyranosyl-α-(1,6)-thio-maltotriose. Deze aanpak is echter mislukt, waarschijnlijk doordat de kristalcontacten de accommodatie van het tetrasacharide belemmerden, dat door de α-1,6- koppeling iets langer is dan acarbose. Van acarbose is waargenomen dat het nauwelijks in de substraat-bindende spleet past en dicht tegen een symmetrie-gerelateerd molecuul aanligt (Fig. 3e). We hebben een α-1,6-gekoppeld disacharide afgeleid dat gebonden is binnen de actieve site van rhGAA door een structurele superpositie van rhGAA met het katalytische (β/α)8 domein van Blautia obeum GAA in complex met isomaltose32 (rmsd van 1.50 Å voor 318 uitgelijnde Cα posities). Het model laat zien dat er geen sterische hinder optreedt door de accommodatie van een α-1,6- koppeling tussen subsite -1 en + 1 en dat productieve waterstofbruggen tussen het glycopyranose-gedeelte in subsite + 1 en D282 gehandhaafd blijven (Fig. 4a, b). Door de grotere lengte van de α-1,6-verkoppeling ten opzichte van een α-1,4-koppeling is de stabiliserende waterstofbrug met R600 echter verzwakt, wat de lagere activiteit van het enzym op α-1,6-gekoppelde takken zou kunnen verklaren.

Het secundaire substraat-bindende domein

In het rhGAA-acarbose complex konden we het acarvosine gedeelte van een tweede acarbose molecuul waarnemen dat vastzit in een holte binnen het N-terminale trefoil Type-P domein, gelegen op dezelfde zijde van rhGAA waar de actieve site zich bevindt en op 25 Å afstand van acarbose dat daarin gebonden is (Fig. 4c). Het valienaminegedeelte waterstofbindt met zijn 4- en 6-hydroxylgroepen aan de hoofdketenstikstof en -zuurstof van C127, de hoofdketenzuurstof van A93 en de zijketen van D91. Verdere stabiliserende interacties worden gevormd door stapelinteracties met P125 en W126. P125 en D91 zijn geconserveerd of vervangen door conservatieve substituties in de familie GH31 enzymen die een trefoil type-P domein omvatten (supplementaire Fig. 4a). Grenzend aan de secundaire koolhydraat-bindingsplaats is de oppervlaktelus G116-M122 bijgesneden door proteolytische behandeling. Het is denkbaar dat de verwijdering van het segment G116-M122, uniek voor de lysosomale vertegenwoordigers van familie GH31 (supplementaire Fig. 4a, b), bijdraagt aan de vorming van de secundaire substraat-bindende pocket. Men zou zich kunnen voorstellen dat de secundaire acarbose-bindingsplaats op rhGAA een echte substraat-bindingsplaats is die mogelijk de verwerkbaarheid van het enzym verhoogt. Deze plaats zou ook een farmacofoor kunnen zijn voor in silico screening voor nieuwe farmacologische chaperonnes. Met name een trisaccharide afgeleid van acarbose is gebonden aan het N-terminale domein van familie GH31 α-1,4-glucan lyase van Gracilariopsis lemaneiformis 33 op een positie dicht bij de hier beschreven secundaire substraat-binding site (Supplementary Fig. 5).

N-acetylcysteïne is een allosterisch farmacologisch chaperon

Het bekende farmaceutische geneesmiddel N-acetylcysteïne (NAC) is aangetoond dat het fungeert als allosterisch farmacologisch chaperon het verbeteren van de stabiliteit van gemuteerde endogene GAA en rhGAA gebruikt voor ERT, zonder invloed op de katalytische activiteit18. Om het therapeutisch potentieel van NAC voor de ziekte van Pompe te benutten via structurele studies, hebben wij de kristalstructuur van rhGAA in complex met NAC nagestreefd. De 1,83 Å resolutie structuur van het complex, verkregen door kristal weken experimenten (Tabel 1), onthult twee NAC-bindende plaatsen ver van de actieve site (Fig. 4d, e), wat structureel bewijs levert dat NAC inderdaad een allosterisch chaperon is, zoals verwacht door functionele studies18. We stelden vast via activiteitstests en differentiële scanfluorimetrie dat NAC even goed rhGAA stabiliseert als het proteolytisch gerijpte enzym dat in deze studie werd geproduceerd, en dat het chaperon specifiek is voor GAA, aangezien NAC geen stabiliserend effect heeft op een GH31-homoloog uit rijst (aanvullende Fig. 6a, b en aanvullende Tabellen 3 en 4). In de structuur van het rhGAA-NAC complex bevindt zich een NAC molecuul, NAC1 genaamd, op ongeveer 30 Å afstand van de actieve plaats, op het grensvlak tussen de (β/α)8 barrel en het distale β-sheet domein (Fig. 4d). NAC1 bindt aan het carboxyl van de hoofdketen van H432 via zijn amidestikstof en de carboxylfunctie maakt een watergemedieerd contact met de zijketen van D513. De Cβ-Sγ en de acetylgroepen maken stacking interacties met de guanidinegroep van R437 en de lus G434-G435, respectievelijk. Een tweede, gedeeltelijk (75%) bezet NAC-molecuul (NAC2), bevindt zich op het grensvlak tussen de (β/α)8 loop en het proximale β-sheet domein op een afstand van 25 Å van de actieve site (Fig. 4e). De carboxyl functie van NAC2 maakt een water-gemedieerd contact met de hoofdketen zuurstof van L756, het thiol stapelt zich tegen de zijketen van Q757 en de acetylgroep stapelt zich tegen de zijketen van H742. De twee NAC-moleculen brengen minder en zwakkere interacties tot stand met rhGAA dan de chaperones DNJ en NHE-DNJ. Dit weerspiegelt de hogere concentraties NAC die nodig zijn voor chaperonactiviteit (mM vs, µM), zoals geïllustreerd door de K D van 11,57±0,74 mM die we verkregen met differentiële scanning fluorimetrie en door de K i van 3,4 en 3,0 µM voor DNJ en NHE-DNJ, respectievelijk18,29. Een sigmoïdale verzadigingscurve die het best past bij de experimentele punten ondersteunt de NAC allosterische volledig (NAC1) en gedeeltelijk (NAC2) bezette bindingsplaatsen (Supplementary Fig. 6c). De stapelinteracties tussen de acetylgroepen van NAC1 en NAC2 en rhGAA moeten aanzienlijk bijdragen aan de bindingsenergie, aangezien aan NAC verwante aminozuren, zoals N-acetylserine en N-acetylglycine eveneens een stabiliserend effect hebben op rhGAA, terwijl de niet-geacetyleerde tegenhangers geen effect hebben18. De structuur van het rhGAA-NAC complex laat een afname zien in de atomaire thermische verplaatsingsparameters van residuen rond de NAC-bindingsplaatsen ten opzichte van die van ongebonden rhGAA, wat wijst op een algehele inter-domein stabiliserende functie die wordt aangestuurd door NAC (Supplementaire Fig. 7a-d). In het kristal blijkt NAC ook een anti-oxidatief effect uit te oefenen aangezien residu C938 geoxideerd is tot de sulfeenzuur vorm in alle hier beschreven kristalstructuren, behalve in de structuur van het rhGAA-NAC complex (supplementaire Fig. 8a, b).

NAC en iminosugars vertonen verschillende chaperonprofielen

Sommige mutaties die tot de ziekte van Pompe leiden, reageren zowel op NAC als op de iminosugars DNJ en NB-DNJ, terwijl andere specifiek door een van beide farmacologische chaperons worden aangepakt16,17,18. De overgrote meerderheid van de GAA-mutanten die gevoelig zijn voor de chaperonactiviteit van iminosugars bevinden zich ofwel in het bereik van de actieve site of op structurele elementen die bijdragen tot de globale architectuur ervan. Bij de Pompe-patiënt, fibroblasten en muismodellen bevinden de GAA-mutanten die het meest op NAC reageren (A445P, Y455F, en L552P)18 zich op de inserts I en II, waar de corresponderende wild-type residuen bijdragen tot domeinstabilisatie. A445 bepaalt samen met F487 de grenzen van insert I, en de A445P mutant destabiliseert hoogstwaarschijnlijk de hele scaffold van insert I (Supplementary Fig. 9a). De hydroxyl zijketen van Y455 op insert I interageert met een lange lus van het katalytische domein, terwijl de zijketen van L552 op insert II hydrofobe interacties maakt met residuen van het N-terminale β-sheet domein (Supplementary Fig. 9b, c). De respectievelijke Y455F en L552P mutanten hebben zeer zeker een algemeen destabiliserend effect, dat duidelijk wordt opgevangen door NAC. Vandaar dat de chaperon-werking van iminosuikers kan worden beschouwd als een conformationele redding van structureel verstoorde actieve plaatsen, terwijl het effect van het allosterische chaperon NAC het gevolg lijkt te zijn van de stabilisatie van algemene of lokale conformationele fluctuaties.1449>