Acetylcholine wordt gesynthetiseerd uit acetylco-enzym A en choline door het enzym choline-acetyltransferase. In het zenuwstelsel bevindt dit enzym zich vermoedelijk hoofdzakelijk in het cytoplasma van de zenuwuiteinden. Co-enzym A wordt gesynthetiseerd in mitochondria en krijgt toegang tot choline acetyltransferase na transport over het mitochondriale membraan naar het cytoplasma. Naast de synthese in de lever, wordt choline, gebruikt bij de productie van acetylcholine, verkregen uit voedingsbronnen. Er is een transportsysteem in capillaire endotheelcellen dat verantwoordelijk is voor het transport van choline, in zijn vrije en fosfolipide vormen, naar de hersenen. Hydrolyse van choline-bevattende fosfolipiden kan ook choline vrijmaken dat wordt gebruikt in de synthese van acetylcholine. Aangezien choline acetyltransferase niet verzadigd wordt door concentraties van acetyl co-enzym A en choline die naar schatting aanwezig zijn in het zenuwuiteinde, blijkt dat de snelheid van acetylcholine synthese afhankelijk is van de beschikbaarheid van precursoren. De enzymactiviteit wordt ook gereguleerd door remming van het product; door binding aan een allosterische plaats op choline acetyltransferase, remt acetylcholine de activiteit. Bovendien beïnvloeden massa-actie en neuronale activiteit de snelheid van de vorming van acetylcholine. Korte-termijn regulatie van de enzymactiviteit wordt gedeeltelijk bereikt door fosforylering geïnduceerd door proteïnekinases. Er zijn geen zeer specifieke en krachtige remmers van het enzym en er zij op gewezen dat farmacologische blokkade van deze stap (b.v. met naftyvinylpyridine) in de levenscyclus van acetylcholine een minder ingrijpend effect op de transmitter heeft dan remming van het choline transport.
Een specifieke acetylcholine transporter met lage affiniteit is verantwoordelijk voor de opname van de transmitter uit het cytoplasma in vesikels. De genen voor choline acetyltransferase en de vesiculaire acetylcholine transporter zijn georganiseerd in een enkele gen locus, en transcriptie van de twee genen is typisch co-gereguleerd. (±)-vesamicol is een selectieve remmer van deze transporter, waarbij L-(-)-vesamicol krachtiger is dan D-(+)-vesamicol. Eenmaal verpakt in blaasjes, is acetylcholine onderhevig aan stimulus-geïnduceerde afgifte door exocytose. Verscheidene krachtige toxines beïnvloeden de vrijgave van acetylcholine, met name botulinum toxine dat de vrijgave ervan remt.
Neuronaal acetylcholinesterase inactiveert zeer snel het grootste deel van acetylcholine dat in de hersenen vrijkomt, hoewel butyrylcholinesterase in gliacellen een klein deel van acetylcholine in de synaps kan hydrolyseren. In de periferie is acetylcholinesterase aanwezig in spieren die cholinerge innervatie ontvangen, terwijl butyryl-cholinesterase wijder verspreid is. Er zijn een aantal omkeerbare (b.v. physostigmine, BW284C51) en onomkeerbare (b.v. iso-OMPA) remmers van acetylcholinesterase bekend, en deze geneesmiddelen hebben tot gevolg dat de synaptische effecten van acetylcholine worden verlengd. Omkeerbare anticholinesterasen van de tweede generatie, zoals donepezil, rivastigmine (ENA 713), eptastigmine en galantamine (galanthamine), worden gebruikt als behandeling voor de ziekte van Alzheimer. Sommige cholinesterasen van de tweede generatie zijn van klinisch gebruik uitgesloten wegens onaanvaardbare bijwerkingen (bv. tacrine, metrifonaat). Onomkeerbare acetylcholinesteraseremmers worden gebruikt als insecticiden en middelen voor chemische oorlogsvoering. Choline, dat door acetylcholinesterase uit acetylcholine wordt vrijgemaakt, wordt door een transporter met hoge affiniteit weer in cholinerge terminals opgenomen en opnieuw gebruikt bij de synthese van de transmitter. Hemicholinium-3 remt choline transport krachtig en reversibel, en dit resulteert in een sterke afname van acetylcholine vorming. In tegenstelling tot hemicholinium-3 is A-4 (een bis-4-methylpiperidine-analogon van HC-3) werkzaam na perifere toediening. Stikstofmosterdanalogen van choline zijn krachtige irreversibele remmers van choline-opname met hoge affiniteit.