Synthese en remmende activiteit van enkele 4-hydroxycumarinederivaten op HIV-1 protease

2.1.2. De Michael-additie van Arylmethyleen-β-Ketoesters en Arylmethyleen-2,4-Pentaandionen aan 4-Hydroxycumarine

De tweede stap van de reactie is een additie van de verkregen arylmethyleen-β-Ketoesters aan 4-hydroxycumarine via de Michael-reactie, met gebruikmaking van natriummethoxide of piperidine als basisch middel. Deze reactie kan worden uitgedrukt als in figuur 4.

Figuur 4

De Michael-additie van 4-hydroxycoumarine en arylmethyleen-β-ketoesters.

Figuur 5

De Michael-additie van 4-hydroxycoumarine en 3-(4-hydroxy)fenylmethyleen-2,4-pentanedion (6).

2.2. Molecular Docking

De interactie van HIV-1 protease door moleculaire docking met enkele nieuw gesynthetiseerde 4-hydroxycoumarinederivaten werd onderzocht. Experimentele gegevens voor de activiteit van enkele 4-hydroxycoumarines werden ter vergelijking gebruikt.

Preliminaire moleculaire docking werd gemaakt op basis van bekende 4-hydroxycumarinederivaten, die een remmende activiteit van HIV-1 protease hebben (tabel 1) . Het raster is zo gekozen dat het ligand dat eerder aan het enzym was gebonden, te groot is (in dit geval is gekozen voor een raster met een grootte van 7 Å).

De 𝐺-score en E-model functies waarden zijn verkregen door deze methode. Zij worden scoringsfuncties genoemd en zijn abstracte equivalenten van Δ𝐺bind. Deze functies houden rekening met de vrije energie ten gevolge van de oplosmiddeleffecten, conformatieveranderingen in eiwit en ligand, interacties tussen eiwit en ligand (waterstofbruggen, ionische interactie en van der Waals krachten), vrij energieverlies van het bevriezen van de interne rotatie van eiwit en ligand, vrij energieverlies in translatie- en rotatie-energie, veroorzaakt door associatie van de twee moleculen, en de vrije energie ten gevolge van veranderingen in de vibratiemodus (meestal genegeerd). Als deze waarden voor een ligand negatiever zijn, betekent dit dat het bindingsvermogen van dit ligand beter is. Als de ligand bindingscapaciteit vertoont in één bepaalde conformatie, dan toont het programma dit als een “goede pose”.

Dit enzym bestaat uit twee polypeptideketens en het is van de aspartyl protease familie met twee aspartaat residuen die onderaan de actieve site liggen. We hebben gebruik gemaakt van de kristallografische structuur van het retrovirale HIV-1 protease, gebonden aan een peptidomimetische remmer BEA369 van de Protein Data Bank met pdb-code 1EBY.

Het kan worden geconcludeerd dat ligand (1) het sterkste bindingsvermogen heeft met HIV-1 protease. De resultaten van moleculaire docking bevestigen de experimentele gegevens over ligand (1).

Wat betreft liganden (1)-(5), de 𝐺-score en E-model waarden uit moleculaire docking, voor de groep van geteste verbindingen, zijn weergegeven in tabel 2.

De interacties tussen de onderzochte 4-hydroxycumarinederivaten en de actieve sites van het enzym HIV-1 protease worden gerealiseerd door waterstofbruggen en de van der Waals interacties. De meest actieve verbinding bijvoorbeeld, met de beste bindingsactiviteit, is verbinding (10), volgens liganden (1)-(4) (gebaseerd op de waarden van de scoringsfuncties). Dit komt waarschijnlijk door de vorming van waterstofbruggen tussen het pyran zuurstofatoom, de lacton carbonyl zuurstof, en één van de hydroxylgroepen (in metapositie) die aan de aromatische ring van de zijketen vastzit. De van der Waals aantrekkingskrachten dragen ook bij voor een goede binding. Volgens ligand (5) is verbinding (7) het meest actief. Er zijn twee waterstofbruggen voor verbinding (7) met deelname van pyran zuurstofatoom, carbonyl zuurstofatoom van de lacton ring en een en overeenkomstige eiwit fragmenten. De van der Waals interacties van aantrekking, waarin waarschijnlijk m-nitro groep deelneemt met een van de zuurstofatomen zijn substantieel voor de binding. De verbinding (7) schijnt actiever te zijn dan de experimentele liganden.

2.3. Biologische activiteit in celcultuur (MT-4-cellen)

Na het aantonen van de activiteit van sommige 4-hydroxycumarinederivaten tegenover geïsoleerde HIV-PR in moleculaire docking-experimenten, zou het interessant zijn om ze verder te testen op HIV-1-geïnfecteerde MT-4-cellen. De evaluatie van het anti-HIV effect gebeurde met een in vitro snelle en gevoelige microtiter infectie assay gebaseerd op cytolyse kwantificatie door vitale kleurstof (MTT) opname als een eindpunt voor infectie . Bovendien werd het effect van remmers op de endogene reverse transcriptase (RT) activiteit van met HIV-1 III B geïnfecteerde MT-4 supernatanten beschouwd als een marker voor het vermogen om de HIV-1 replicatie te blokkeren. MT-4-cellen werden geïnfecteerd en geïncubeerd met elke remmer gedurende 72-96 uur, en vervolgens werd de RT-activiteit gemeten in de celsupernatanten volgens de richtlijnen van de HS-Lenti Kit-RT assay (Cavidi, Zweden). Een studie van het directe effect van de nieuw gesynthetiseerde 4-hydroxycumarines op exogeen recombinant RT (rRT) werd ook uitgevoerd. Verder werden alle verbindingen getest op anti-HIV-1 PR activiteit. Tabel 3 geeft de resultaten weer van de microtiter infectietest met MTT en de remming van de HIV-1 PR activiteit. De experimenten werden uitgevoerd in maximale niet-toxische concentratie (MNC) voor elke verbinding.

Vooreerst is te zien dat de verbindingen (8), (7), en (12) een hogere MNC hebben, wat betekent dat ze meer cytotoxisch zijn dan de andere drie verbindingen. Slechts twee van hen (10) en (7) remden de virale replicatie in MT-4 cellen, de remming geïnduceerd door (7) was opmerkelijk (78%). Met behulp van 10x virale verdunningen, werd IC50 vastgesteld op 0,01 nM. Geen enkele verbinding had effect op zowel endogene als exogene RT. Dit betekent dat RT niet het doelwit was van de antivirale werking. Zoals voorspeld door moleculaire docking studies, werd de HIV-1 PR activiteit voor 24-25% geremd door (7) (5 afzonderlijke evaluaties werden gedaan). De discordantie die voor (7) werd gevonden tussen de gegevens betreffende remming van de infectiviteit (ongeveer 75%) en de proteaseactiviteit (25%) zou kunnen worden verklaard door een andere activiteit, zoals l anti-integrase. Het is bekend dat sommige 4-hydroxycumarinederivaten integraseremmers zijn.

De in dit artikel beschreven experimenten breiden de eerder gerapporteerde uit dat 4-hydroxycoumarinederivaten zouden kunnen dienen als nieuwe niet-peptidische PI’s. Net als tipranavir en darunavir zouden zij effectief kunnen zijn bij patiënten met ontwikkelde resistentie tegen peptidische PI’s. Vooral (7) zou verder kunnen worden gebruikt als een farmacofoor voor de synthese van nieuwe, meer actieve derivaten tegen HIV-1 protease.

3. Conclusie

Zes 4-hydroxycumarine verbindingen werden gesynthetiseerd door twee-staps synthese. De eerste stap is de Knoevenagel-reactie tussen aromatische aldehyden en ethylacetoacetaat of acetylaceton. De tweede stap is de Michael-additie van de verkregen arylmethyleen-β-ketoester of arylmethyleen-2,4-pentaandion met 4-hydroxycumarine. De producten worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd door 1H NMR, EI-MS, FTIR, en elementenanalyse.

Het bestuderen van hun bindingsactiviteit met HIV-1 PR werd uitgevoerd door moleculaire docking. Het kristal HIV-1 PR, gebonden met peptidomimetische remmer BEA369, werd gebruikt. De hoogste bindingsactiviteit vertoont verbinding (10), volgens de experimentele liganden (1), (2), (3), en (4) en verbinding (7), volgens ligand 5. Dit feit is waarschijnlijk te wijten aan een vorming van waterstofbruggen tussen pyran zuurstofatoom, lacton carbonyl zuurstof, en een van de hydroxylgroepen (in metapositie) gehecht aan de aromatische ring vanaf de zijketen. De van der Waals aantrekkingskrachten dragen ook bij tot een goede binding.

Alle zes verbindingen werden getest op anti-HIV-1 PR activiteit in MT4 cellen geïnfecteerd door HIV-1. De celoverleving werd geëvalueerd met de MTT-test en ook werd het % van remming van HIV-1 PR gemeten. De hoogste remming van HIV-1 PR (25%) en de hoogste MT4 celoverleving (78%) werden aangetoond door verbinding (7). Verbinding (7) zou verder gebruikt kunnen worden als farmacofoor om nieuwe meer actieve derivaten te synthetiseren tegen HIV-1 PR.

4. Experimenteel deel

4.1. Synthese van 4-Hydroxycumarinederivaten

4.1.1. Materialen en methoden

Alle uitgangsmaterialen werden gekocht bij Merck, Sigma-Aldrich, en Fluka. Zij worden zonder verdere zuivering gebruikt. De smeltpunten zijn gemeten in open capillaire buisjes op een Büchi 535 smeltpuntapparaat. De IR-spectra werden opgenomen met een Shimadzu FT-IR 8101 M spectrometer in nujol, en de frequenties worden uitgedrukt in cm-1. De 1H NMR spectra werden opgenomen in Brucker 250 MHz in DMSO-d6 of aceton met TMS als interne standaard (chemische verschuivingen worden gerapporteerd in ppm eenheden, koppelconstanten (𝐽) in Hz). Afkortingen zijn als volgt: s: singlet, d: doublet, dd: doublet, dq: dubbel kwartet, dqui: dubbel kwintet, t: triplet, en m: multiplet.

Massaspectrale analyse werd uitgevoerd door elektronenionisatie op massaspectrometer Hewlett-Packard 5973 bij 70 eV.

4.1.2. Algemene procedure voor de bereiding van arylmethyleen-β-ketoesters

Aromatisch aldehyde en ethylacetoacetaat worden in equimolaire hoeveelheden gemengd in een rondbodemkolf. Piperidine (0,03 mol) en ijsazijn (0,04 mol) worden eveneens aan het reactiemengsel toegevoegd. Dit laatste wordt gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Nadat 20 mL ether en/of 150 mL gedestilleerd water aan het reactiemengsel zijn toegevoegd, worden kristallen met verschillende kleuren gevormd. Deze kristallen worden gefiltreerd en gewassen. Daarna worden ze gedroogd bij kamertemperatuur en opnieuw gekristalliseerd in geschikte oplosmiddelen – hoofdzakelijk alcoholen (ethanol, propaanol en 2-propanol) en water.

4.1.3. Procedure voor de bereiding van 3-(4-hydroxy)-fenylmethyleen-2,4-pentandion (6)

4-Hydroxybenzaldehyde (3,66 g, 0,03 mol) en acetylaceton (5,14 mL, 0,05 mol) worden gemengd in een rondbodemkolf. Piperidine (0,03 mol) en ijsazijn (0,04 mol) worden eveneens aan het reactiemengsel toegevoegd. Dit laatste wordt gedurende 120 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Daarna wordt 150 mL gedestilleerd water aan het reactiemengsel toegevoegd. Er worden kristallen met verschillende kleuren gevormd. Deze kristallen worden afgefiltreerd en gewassen. Daarna worden ze gedroogd bij kamertemperatuur en geherkristalliseerd in methyleenchloride.

4.1.4. Algemene procedure voor de bereiding van condensatieproducten met 4-hydroxycumarine

Arylydene-β-ketoester, verkregen bij de vorige reactie, en 4-hydroxycumarine worden in equimolaire hoeveelheden gemengd in 25-30 mL methanol (gebruikt als oplosmiddel). Natriummethoxide (0,003 mol) als basisch middel wordt eveneens aan de reagentia toegevoegd. Het reactiemengsel wordt gekookt en gedurende 60 uur onder reflux geroerd. De reactie wordt gecontroleerd met TLC (hexaan : aceton = 2 : 1 of hexaan : aceton : chloroform : methanol = 5 : 3 : 2 : 1). Wanneer de hoeveelheden reagentia uitgeput zijn, wordt de verhitting stopgezet. Het residu van het reactiemengsel wordt afgefiltreerd en met heet water gewassen om de 4-hydroxicumarine die niet gereageerd heeft, te verwijderen. Daarna werd het residu gedroogd bij kamertemperatuur en geherkristalliseerd in een geschikt oplosmiddel (methanol, ethanol of 2-propanol).

4.1.5. De Michael Additie tussen 3-(4-Hydroxybenzylideen)-2,4-Pentaandion (SS-23) en 4-Hydroxycoumari

3-(4-Hydroxybenzylideen)-2,4-pentaandion (1,02 g, 0,005 mol) en 4-hydroxycoumarine (0,81 g, 0,005 mol) worden gemengd in een kleine overmaat van 4-hydroxycoumarine in 15-25 mL methanol. Piperidine (0,003 mol) als basisch middel wordt ook toegevoegd aan de reagentia. Het reactiemengsel wordt gekookt en gedurende 60 uur onder reflux geroerd. De reactie wordt gecontroleerd met TLC (hexaan : chloroform : azijnzuur = 10 : 10 : 4, hexaan : chloroform : azijnzuur = 10 : 10 : 2, hexaan : aceton = 2 : 1). Wanneer de hoeveelheden reagentia uitgeput waren, werd de verhitting stopgezet. Het residu van het reactiemengsel werd afgefiltreerd en met heet water gewassen om de 4-hydroxicumarine die niet gereageerd heeft, te verwijderen. Daarna werd het residu gedroogd bij kamertemperatuur en geherkristalliseerd in aceton.

4.2. Molecular Docking

Alle moleculaire docking-berekeningen zijn uitgevoerd met het Maestro Macromodel Glide-programma van het Schrodinger-pakket. Alle structuren (experimenteel geteste en nieuwe) zijn geminimaliseerd met het programma Macromodel, met gebruikmaking van het krachtveld OPLS2005 en 5000 iteraties. De röntgenstructuur van het enzym HIV-1 protease, samen met de remmer BEA369, is verkregen van de Protein Data Bank met PDB code 1EBY.

4.3. Cellijnen en virussen

MT-4-een menselijke lymfoblastoïde suspensie cellijn, vriendelijk ter beschikking gesteld door Gianfranco Pancino- Institute Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Parijs, Frankrijk) vertegenwoordigen een klassiek model voor experimentele productieve infectie met HIV-1 III B stam en gebruikt als een routine doel voor de studie van het effect van putatieve HIV-remmers in celkweek.

Als bron van HIV-1 werden supernatanten van de H9/HTLV III B lijn – een gift van Dr. R. Gallo (NIH, USA) – gebruikt. De supernatanten werden verzameld en gecentrifugeerd om de cellen te verwijderen, en virusvoorraden werden bereid met bekend p24-antigeengehalte (460 pg/mL, Murex HIV Antigen mAB-test), RT-activiteit (565,3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Zweden), en infectiviteit (2 × 106 infectieuze virionen/mL, microtiter infectie assay). MT-4 en H9/HTLV III B-cellen werden gekweekt in RPMI 1640, aangevuld met 10% FCS (invitrogen). Cytotoxiciteitstests en antivirale testen in celkweek

De bestudeerde verbindingen werden eerst opgelost in DMSO en verder verdund in celgroeimedium zonder foetaal serum. Alle oplossingen werden ex tempore bereid.

De volgende parameters werden bestudeerd: cytotoxische concentratie 50-CC50, indien mogelijk (de concentratie die de dood van 50% van de MT-2 cellen verhindert), maximale niet-toxische concentratie-MNC, en remmende concentratie 50-IC50 (concentratie die de virale replicatie met 50% verhindert). CC50 en MNC werden gedetecteerd door MTT-opnamebepaling. IC50 werd bestudeerd op MT-4 cellen door microtiter infectie assay waarbij de bescherming van cellen tegen het cytopathische effect van HIV gemeten door MTT test . Experimenten onder omstandigheden van acute infectie werden uitgevoerd in 96-well microtiterplaten met 6-8 parallellen/experiment. Celcontroles (MT-4-cellen met alleen medium) en virale controles (met virus geïnfecteerde MT-4-cellen) werden bij elk experiment uitgevoerd. Voor antivirusbepalingen werd HIV aan elk putje toegevoegd om een multipliciteit van infectie van 0,1 te verkrijgen, behalve voor de celcontroles. Virushechting werd gedurende een uur toegestaan bij 37°C/5% CO2. De platen werden gedurende 72-96 uur geïncubeerd bij 37°C/5% CO2. Daarna werd de MTT-test uitgevoerd zoals beschreven en werd de extinctie van levensvatbare cellen colorimetrisch gemeten bij A540 nm. Voor alle experimenten werd de gemiddelde waarde van elke kolom berekend (alleen als de waarden in A540 niet ±10% verschilden). Voor antivirale assays werden de gemiddelde waarden van experimentele en controleregels vergeleken en werd het percentage beschermde cellen (celoverleving) bij de juiste concentratie van de stof uitgezet tegen de concentratie van de stof om IC50 te verkrijgen. De celoverleving (% celbescherming) werd berekend volgens de volgende formule: =%cellprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) waarbij 𝑋 de gemiddelde waarde is van A540 van HIV-geïnfecteerde cellen die met de juiste concentratie van de bestudeerde verbinding zijn behandeld; controle-HIV is de gemiddelde waarde van A540 van HIV-geïnfecteerde cellen zonder toevoeging van enige verbinding; celcontrole is de gemiddelde waarde van A540 van niet-geïnfecteerde en niet-behandelde cellen met een remmer.

Als referentiestoffen werden ABC (Abacavir, de bekende nucleoside reverse transcriptase inhibitor-NRTI) en pepstatine gebruikt.

4.4.1. Endogene RT-activiteit en direct effect van de verbindingen op RT

Het werd getest met HS-Lenti Kit-RT-assay (Cavidi, Zweden). De kit bevat recombinant RT (rRT) als standaard, die RT-kwantificering mogelijk maakt. Voor de endogene RT-test werden de supernatanten van met HIV-1 geïnfecteerde/ongeïnfecteerde MT-4-cellen na incubatie met/zonder verbindingen getest volgens de richtlijnen van de fabrikant. Het niveau van RT-activiteit in het supernatant werd berekend (in pg/mL) uit de HIV-1 rRT-standaardset in elke kit. Het directe effect van de verbindingen op de rRT activiteit werd gemeten met dezelfde kit en had tot doel RT als doelwit van antivirale werking aan te tonen. Passende stapsgewijze verdunningen van de remmer werden bereid in controlebuffer en aan het reactiemengsel toegevoegd. De reactie werd gedurende 3 uur bij 33°C uitgevoerd. De RT-activiteit van standaardverdunningen werd vergeleken met die waaraan verbindingen waren toegevoegd of met controles (waaraan alleen incubatiemengsel zonder verbindingen was toegevoegd).

4.4.2.

Een eerder door Broglia et al., 2006 , beschreven methode voor de detectie van recombinant protease-activiteit werd gewijzigd om natief viraal protease te gebruiken. Als een bron van natieve HIV-1 protease, weer suspensie van geconcentreerde virale voorraad (50x) van chronisch geïnfecteerde H9/HTLV IIIB cel supernatanten werd gebruikt. De lysis van virale deeltjes en het vrijkomen van het actieve enzym (protease) werd uitgevoerd met behulp van disruptie (lysis) buffer met 2,5% Triton X-100 in fosfaatbuffer. De concentratie van de weefselkweekvloeistof die het virus bevatte, werd uitgevoerd door ultracentrifugatie in Biofuge Stratos, Heraeus, gedurende 1 uur, bij 4°C en 35000 omw/min. De pellet werd geresuspendeerd om 50x concentraat te verkrijgen in disruptiebuffer.

Voor elk experiment werd het volgende reactiemengsel bereid: 1000 𝜇L fosfaatbuffer (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L HIV-proteasesubstraat III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Zwitserland) in DMSO, ex tempore bereid; 20 μL enzym (HIV-stock) genomen uit een oplossing die 25 𝜇L verstorende (lysis)buffer + 100 μL HIV-stock bevat, 40 min geïncubeerd bij 37°C voorafgaand aan het experiment.

De HIV-1 PR-activiteit werd gemeten met behulp van directe spectrofotometrische aflezing van de enzymreactie substraatgebruik bij 300 nm, bij kamertemperatuur en 1 cm padlengte, met behulp van T80 + UV-Vis spectrofotometer (PG instrumenten). De aanvankelijke reactiesnelheid (V0) werd op 0,0020-0,0030 ΔAbs/min gebracht door de enzymactiviteit (virale concentratie) te variëren. De geteste verbinding en de referentie-inhibitor (hier pepstatine gebruikt) werden vóór het enzym aan het reactiemengsel toegevoegd om de screening op remmende werking uit te voeren. IC50 werd gedefinieerd als de concentratie van de geteste verbinding die de snelheid van de reactie vermindert met 50% van de aanvankelijke snelheid zonder geteste (referentie)verbinding.