- Results
- Identification of Mutations Specific Affecting 2-APB Responses.
- Initiële elektrofysiologische karakterisering van TRPV3-H426 en TRPV3-R696 Channels.
- Voltage-afhankelijke respons bleef intact in 2-APB mutanten.
- Temperatuurgevoeligheid van TRPV3-H426N en TRPV3-R696K.
- Calcium-afhankelijke desensibilisatie van TRPV3-R696K.
- De 2-APB gevoeligheid in TRPV3 orthologs.
- De 2-APB gevoeligheid in verwante ThermoTRPs: TRPV1, TRPV2, en TRPV4.
Results
Identification of Mutations Specific Affecting 2-APB Responses.
We screenden een muis TRPV3 mutantbibliotheek bestaande uit ≈14,000 cDNA constructs met gemiddeld 2.5 mutaties per kloon gegenereerd door foutgevoelige PCR. Mutant constructen werden getransfecteerd in menselijke embryonale nier (HEK293) cellen, en calcium reacties opgewekt door warmte (42 ° C), 25 uM 2-APB, en 1,75 mM kamfer werden gecontroleerd in een fluorescentie imaging plate reader (FLIPR). We hebben onlangs de identificatie beschreven van residuen die specifiek vereist zijn voor TRPV3 warmte activering (20). Hier hebben we ons gericht op de 2-APB en kamfer dataset om residuen te identificeren die specifiek vereist zijn voor chemische responsen.
Specifiek selecteerden we klonen die normale responsen vertoonden voor een chemische stof, maar significant verminderde activering door de andere (voor selectiecriteria, zie Methoden). Positieve klonen werden geplukt, opnieuw gekweekt, en volledige dosis-respons curves tegen elke stimulus werden gemeten, en EC50 waarden berekend (zie Methoden). Van zeven mutante klonen werd bevestigd dat ze specifiek 2-APB-deficiënt waren, en ze werden gesequenced. Opmerkelijk was dat alle 7 klonen mutaties vertoonden in 1 of 2 residuen. Het eerste, histidine (H) 426, is aanwezig in de cytoplasmatische N terminus regio, tussen de ankyrine en transmembraan domeinen. Wij identificeerden 4 verschillende substituties van H426 in het scherm (Tabel 1). De tweede, arginine (R) 696 is aanwezig in de C-terminale cytoplasmatische TRP box (IWRLQR), een geconserveerd domein in TRP kanalen (2, 3). De 3 mutaties op dit residu hebben dezelfde nauw verwante arginine naar lysine substitutie. Alle 7 mutaties veroorzaakten ernstige tekorten in 2-APB responsen, zonder de kamfer responsen te beïnvloeden (Tabel 1). Hoewel ook enkele kamferdeficiënte klonen werden geïdentificeerd, ging het daarbij om relatief subtielere mutaties, waarbij de EC50-waarden van kamfer ≈2-voudig of minder veranderden (gegevens niet weergegeven). Om deze reden hebben we deze studie gericht op de 2 residuen die specifiek >10-voudige 2-APB deficiëntie veroorzaken.
- View inline
- View popup
TRPV3 mutanten geassocieerd met deficiëntie van 2-APB gevoeligheid
Initiële elektrofysiologische karakterisering van TRPV3-H426 en TRPV3-R696 Channels.
FLIPR is een indirecte manier om ionkanaal activiteit te meten. Om onze FLIPR resultaten te bevestigen, gebruikten we patch clamp techniek en gemeten hele-cel stromen van wild-type muis TRPV3, TRPV3-H426N, en TRPV3-R696K wanneer 2-APB (1 uM tot 3 mM) of kamfer (0,3 tot 20 mM) werden individueel bad toegepast van lage tot hoge concentraties (Fig. 1 en Fig. S1). In een concentratie-afhankelijke wijze, 2-APB geactiveerd stromen in HEK293 cellen getransfecteerd met wild-type TRPV3 met gemiddelde EC50 waarden van 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) en 36,8 ± 3.6 uM (nHill = 3,3) bij +100 en -100 mV, respectievelijk (Fig. 1A; Fig. S1A); 2-APB niet induceerde meetbare stromen in HEK293 cellen getransfecteerd met TRPV3-H426N tot 100 uM. Echter, concentraties van 2-APB die verzadigend zijn voor wild-type TRPV3 (0,3 tot 3 mM) waren in staat om stromen te activeren in deze mutant in een concentratie-afhankelijke wijze (Fig. 1A; Fig. S1A). Bijgevolg vertoonde de TRPV3-H426N een >10-voudige EC50-verschuiving van 2-APB-afhankelijke activering, en de respons bereikte nooit verzadiging. In parallelle experimenten activeerde kamfer ook stromen in HEK293 cellen getransfecteerd met wild-type TRPV3 op een concentratie-afhankelijke manier met EC50 waarden van 6.7 ± 0.1 (nHill = 7.8) en 7.0 ± 0.1 mM (nHill = 8.4) bij +100 en -100 mV, respectievelijk. Belangrijk is dat wild-type reacties op kamfer werden waargenomen in HEK293 cellen getransfecteerd met de TRPV3-H426N , wat bevestigt dat kamfer activering onveranderd is in deze mutant (Fig. 1A; Fig. S1B).
Electrofysiologische karakterisering van TRPV3-H426N en TRPV3-R696K. (A) Concentratie-respons curves van 2-APB- en kamfer-geactiveerde responsen in wild-type en H426N mutant onthullen specifiek verlies van 2-APB respons, maar niet kamfer-geactiveerde respons. (B) Bij de R696K-mutant was de door 2-APB geactiveerde respons ook specifiek aangetast, terwijl de door kamfer geactiveerde respons vergelijkbaar was tussen de wild-type TRPV3 en de R696K-mutant. Voor R696K mutant werd de acute piekrespons gebruikt om de EC50-waarde te berekenen. De foutbalkjes zijn SE’s. Voor 2-APB responsen: n = 17 voor wild-type TRPV3; n = 9 voor H426N mutant; en n = 6 voor R696K mutant. Voor kamfer reacties: n = 10 voor wild-type TRPV3; n = 5 voor H426N mutant; en n = 10 voor R696K mutant.
In hele-cel patch-clamp experimenten, 2-APB induceerde ook minimale TRPV3-R696K activering. Bij +100 mV begon 2-APB HEK293-cellen die dit mutantkanaal tot expressie brengen te activeren bij ≈3 μM, en bereikte verzadiging bij 30 μM, met een EC50 van 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Hogere concentraties van 2-APB (>30 μM) riepen een desensibiliserende stroom op met een “off-respons” na het uitwassen van 2-APB, een fenomeen dat hieronder in detail wordt beschreven. Echter, bij -100 mV, 2-APB niet in geslaagd om R696K mutant kanalen te activeren, zelfs bij 1 mM (Fig. 1B; Fig. S1A). De maximale 2-APB respons bij 1 mM bij -100 mV was -2,3 ± 1,4 pA/pF (n = 6), die aanzienlijk kleiner (>10-voudig) dan voor wild-type TRPV3 kanalen (-482,1 ± 69,2 pA/pF bij 300 pM, n = 17), wat suggereert dat de maximale kanaalrespons opgewekt door 2-APB is verminderd in de TRPV3-R696K mutant. Kamfer activeerde echter vergelijkbare responsen op TRPV3- en TRPV3-R696K-getransfecteerde HEK293 cellen (Fig. 1B; Fig. S1B). Daarom bevestigden de eerste elektrofysiologische gegevens onze screeningresultaten dat TRPV3-H426N en TRPV3-R696K mutanten deficiënt zijn in 2-APB responsiviteit, zonder de algehele kanaalfunctie te beïnvloeden zoals getest door hun vermogen om te reageren op kamfer.
We vroegen vervolgens welke zijketen eigenschappen van H426 en R696 cruciaal zijn voor TRPV3 activatie door 2-APB. We muteerden individueel posities 426 en 696 naar alle andere aminozuren en maten FLIPR dosis-respons curves voor zowel 2-APB als kamfer. Interessant is dat alle H426 mutanten een verminderde 2-APB respons hadden met een sterke (>10-voudige) verhoging van de EC50 waarden (Tabel S1). De meeste mutanten hadden normale kamferreacties, behalve de helix-brekende proline-substitutie, die een ≈2-voudige verhoging van kamfer-EC50 liet zien. Deze gegevens zijn consistent met het resultaat van onze primaire screening, waarbij 4 verschillende substituties werden geïdentificeerd die resulteerden in 2-APB deficiëntie op deze positie. Mutantkanalen met aromatische zijketens F, T en W reageerden niet op kamfer of 2-APB. De meeste R696 mutanten vertoonden echter verminderde 2-APB responsen, maar hadden ook verminderde maximale kamfer (20 mM) responsen, wat erop wijst dat deze mutaties de algehele kanaalexpressie of -functie beïnvloeden (Tabel S2). Dit resultaat is ook consistent met ons eerste resultaat van de primaire screening, waar alleen de lysine substitutie werd geïdentificeerd als specifiek vereist voor 2-APB op dit residu. R696F vertoonde ook enig 2-APB-specifiek tekort, hoewel de maximale kamferresponsen licht werden beïnvloed. De mutanten R696D, R696G, R696N, R696P, R696S en R696T vertoonden geen significante respons op 2-APB of kamfer in vergelijking met cellen die getransfecteerd waren met de pcDNA-vector.
Voltage-afhankelijke respons bleef intact in 2-APB mutanten.
Voltage-afhankelijkheid blijkt een belangrijke rol te spelen bij de activering en gating van TRP-kanalen (1, 10-12, 21). In afwezigheid van chemische stimulatoren (bijvoorbeeld kamfer of 2-APB), spanning stappen van -120 tot +180 mV (20 mV stap) niet activeren stromen in HEK293 cellen getransfecteerd met wild-type TRPV3, wat aangeeft dat TRPV3 (in tegenstelling tot TRPV1 en TRPM8) niet wordt geactiveerd door spanning alleen op het bereik hier getest (20, 22). Echter, in aanwezigheid van 30 uM 2-APB, een spanning-afhankelijke stroom werd geactiveerd (Fig. S2A). Zoals verwacht, geen detecteerbare spanning-gemoduleerde stroom werd gezien in TRPV3-H426N wanneer behandeld met 30 uM 2-APB (Fig. S2B). Echter, 6 mM kamfer opgeroepen een spanning-afhankelijke stroom in HEK293 cellen die wild-type TRPV3 (V1 / 2 van 81,3 ± 2,6 mV) (Fig. S2 A en D) en TRPV3-H426N (V1 / 2 van 81,3 ± 2,5 mV) (Fig. S2 B en D). Vergelijkbaar met TRPV3-H426N, was er geen detecteerbare spanning gemoduleerde stroom in TRPV3-R696K wanneer behandeld met 30 uM 2-APB (Fig. S2C). Kamfer activeerde echter een spanningsafhankelijke stroom met een V1/2 van 81,1 ± 5,4 mV (Fig. S2 C en D). Deze resultaten geven aan dat spanningsmodulatie intact is in TRPV3-H426N en TRPV3-R696K, en impliceert dat verlies van spanningsafhankelijkheid waarschijnlijk niet de oorzaak is van de verminderde respons op 2-APB in deze mutant kanalen.
Temperatuurgevoeligheid van TRPV3-H426N en TRPV3-R696K.
Temperatuurgevoeligheid is een kenmerk van TRPV3 kanaalfunctie (14, 16, 23). Daarom vroegen we of de temperatuuractivering was veranderd in TRPV3-H426N en TRPV3-R696K klonen. We hebben de temperatuur (25 tot 42 °C) activatie gemeten van HEK293 cellen getransfecteerd met wild-type TRPV3, TRPV3-H426N, of TRPV3-R696K mutant in een FLIPR assay. Hitte reacties van TRPV3-H426N waren gelijk aan of iets groter dan wild-type TRPV3 reacties (n = 4 experimenten), wat suggereert dat 2-APB- en warmte-activatie kan worden gescheiden (Fig. S2E; en gegevens niet weergegeven). De warmtereacties in TRPV3-R696K waren echter veel kleiner dan in wild type (n = 3 experimenten), wat suggereert dat deze mutant niet specifiek de 2-APB activering verandert (Fig. S2E).
Calcium-afhankelijke desensibilisatie van TRPV3-R696K.
Een interessant kenmerk van de 2-APB respons in TRPV3-R696K-getransfecteerde HEK293 cellen is een snelle desensibilisatie bij >30 μM 2-APB en een off-respons op 2-APB bij hoge concentraties (Fig. S3). Dit fenomeen is in tegenstelling tot wild-type TRPV3, die sensibiliseert in reactie op repetitieve/continue stimulatie van chemicaliën of warmte (14, 16). Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan TRPV3 sensibilisatie wordt voorgesteld als een verlies van calcium inhibitie van dit kanaal (22). Omdat desensibilisatie van de meeste andere TRP kanalen (zoals TRPV1 en TRPA1) aan chemische of temperatuur stimuli ook afhangt van extracelullar calcium (24, 25), zijn we begonnen om te testen of extracellulair calcium een rol speelt in 2-APB-geactiveerde desensibiliserende reacties in TRVP3-R696K. Verrassend genoeg, in de afwezigheid van extracelullar calcium, 100 uM 2-APB activeerde een robuuste, wild-type-achtige inwaartse en uitgaande stromen in TRPV3-R696K (stroomdichtheid van TRPV3-R696K: 755.7 ± 200,0 pA/pF bij +100 mV, -641,2 ± 133,9 pA/pF bij -100 mV (n = 5); wild-type TRPV3: 615,0 ± 266,7 pA/pF bij +100 mV, en -471,0 ± 83,2 pA/pF bij -100 mV, n = 9) (Fig. S4 A en B). Dit resultaat suggereert dat vervanging van een arginine door een lysine op positie 696 in de TRP box van TRPV3 het kanaal in een desensibiliserende toestand brengt op 2-APB maar niet op kamfer stimulatie op een calcium-afhankelijke manier. Een verondersteld Ca2+-bindend residu in het pore-lus domein, aspartaat 641, is geconserveerd onder alle TRPV kanalen, en is kritisch voor de permeatie-eigenschappen van TRP kanalen (26, 27). Mutatie van D641 in asparagine (N) heeft aangetoond de ruthenium rood blokkade en de hoge affiniteit extracelullar calcium inhibitie van TRPV3 en andere TRP kanalen te verminderen (17, 22, 26, 27). Daarom hebben we onderzocht of de D641N mutatie de TRPV3-R696K kloon kon verlossen van calcium-afhankelijk verlies van 2-APB respons. In een FLIPR-test had de TRPV3-D641N een EC50 van 2,8 ± 1,3 uM (nHill = 0,7), wat ongeveer de helft is van de waarde van wild-type TRPV3 (5,7 ± 1,2 uM, nHill = 1,1). De dubbele mutant TRVP3-D641N/R696K had een EC50 van 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), waaruit blijkt dat de D641N-mutatie de 2-APB-respons van de TRPV3-R696K volledig herstelde. Zoals verwacht, was de kamferrespons vergelijkbaar tussen TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N, en TRPV3-D641N/R696K (Fig. S4 C en D). Deze studies tonen aan dat TRPV3-R696 niet louter een 2-APB mutatie is. De waargenomen tekortkomingen zijn calcium-gemedieerd, en beïnvloeden 2-APB maar niet kamferresponsen.
De 2-APB gevoeligheid in TRPV3 orthologs.
Amino acid conservaties en variaties tussen orthologs zijn nuttige hulpmiddelen voor het ontleden van structuur-functie relaties van eiwitten, waaronder TRP kanalen (28, 29). Daarom vroegen we of deze TRPV3 orthologen vergelijkbare kamfer en 2-APB reacties hebben. Inderdaad, menselijke, hond, en kikker TRPV3 kanalen, die histidines hebben op muis-equivalente positie 426 (Fig. 2A), hebben vergelijkbare 2-APB reacties wanneer overgeëxpresseerd in HEK293 cellen (hoewel kamfer reacties in Xenopus tropicalis TRPV3 waren verminderd in vergelijking met wild-type muis TRPV3) (Fig. 2C). Zoals verwacht, wanneer H426 in mens, hond en kikker gemuteerd werd in N, werden de 2-APB concentratie-respons curven sterk naar rechts verschoven in elk van deze TRPV3 orthologs (Fig. 2B). Ook deze mutatie verminderde de kamfergevoeligheid niet in vergelijking met wild-type TRPV3 orthologen (Fig. 2C). Integendeel, zowel menselijke als kikker TRPV3 H426N mutanten hadden een iets hogere kamfergevoeligheid dan hun wild-type tegenhangers. Deze resultaten wijzen erop dat het 2-APB activeringsmechanisme van TRPV3 geconserveerd zou kunnen zijn in verschillende soorten.
Een geconserveerde vereiste van H426 voor 2-APB responsen bij zoogdier en amfibie TRPV3 orthologs. (A) Sequence alignment van muis, rat, mens, hond, kikker, en kip TRPV3. Positie 426 is aangegeven. (B) FLIPR EC50 waarden van 2-APB (B) en kamfer (C) in H426N equivalente mutanten van kikker, mens, en hond TRPV3; fTRPV3 verwijst naar kikker TRPV3; hTRPV3 verwijst naar mens TRPV3; en dTRPV3 verwijst naar hond TRPV3. Foutbalken zijn SE’s; n = 5 voor elke kloon.
Intrigerend is dat, hoewel R696 geconserveerd is in de TRP box van TRPV3 bij alle soorten, de positie die overeenkomt met muis 426 in kip TRPV3 (cTRPV3) een N is (427). Zoals hierboven aangetoond, een H-N substitutie op 426 residu in zoogdieren of amfibieënsoorten interfereert met de juiste 2-APB reacties (Fig. 2A). In overeenstemming met het feit dat dit residu belangrijk is voor 2-APB reacties, is de EC50 van 2-APB in cTRPV3 146,8 ± 3,4 uM (nHill = 2,5) in vergelijking met die van 11,5 ± 3,5 uM (nHill = 1,1) voor muis TRPV3. Opvallend, muteren N427 in H verschoof de concentratie-respons curve van 2-APB aanzienlijk naar links (EC50 van 6,1 ± 0,9 uM, nHill = 2,3), terwijl het verlaten van de EC50 waarde voor kamfer ongewijzigd (Fig. 3A). Whole-cell patch clamp opnamen bevestigden dat de 2-APB concentratie-respons curve sterk naar links verschoven was in de kip TRPV3-N427H in vergelijking met wild-type cTRPV3 bij zowel +100 als -100 mV (Fig. 3B). Single-channel opnamen bleek bijna 200-voudige toename van kanaalopeningen ten opzichte van het basale niveau door 25 uM 2-APB in inside-out patches van cTRPV3-N427H-expressie van cellen (n = 7), terwijl er geen significante veranderingen werden waargenomen in inside-out patches van wild-type cTRPV3-expressie van HEK293 cellen (n = 5). Echter, 6 mM kamfer verhoogde sterk enkele-kanaal openingen in inside-out patches van HEK293 cellen getransfecteerd met ofwel wild-type cTRPV3 of cTRPV3-N427H mutant op vergelijkbare niveaus (Fig. 3 C-E). Vandaar dat een enkele puntmutatie in kip TRPV3 specifiek verhoogt de gevoeligheid voor 2-APB.
N427H mutatie herstelt de 2-APB gevoeligheid van kip TRPV3. (A) Concentratie-respons curven van 2-APB en kamfer in kip wild-type TRPV3, cTRPV3-N427H, en pcDNA op FLIPR. Foutbalken zijn SE’s; n = 6 voor elke kloon. (B) Whole-cell patch-clamp stroom-dichtheid concentratie-respons curves van 2-APB-geactiveerde stromen in HEK293 cellen getransfecteerd met wild-type of N427H mutant kip TRPV3 bij +100 en -100 mV. Foutbalken zijn SE’s; n = 4 voor wild-type kip TRPV3, en n = 5 voor cTRPV3-N427H mutant. (C) Inside-out single channel opnamen van wild-type kip TRPV3 behandeld met 25 μM 2-APB of 3 mM kamfer. (D) Single channel stroomsporen (inside-out configuratie) van cTRPV3-N427H kanaal behandeld met 25 uM 2-APB of 6 mM kamfer. (E) Gemiddelde vouw toename van enkele kanaal activiteiten ten opzichte van basale niveaus opgewekt door 2-APB of kamfer in inside-out patches uitdrukken van wild-type cTRP3 of cTRPV3-N427H mutant (*, P < 0,05, Student’s t-test; n = 4 voor wild-type cTRPV3; en n = 5 voor cTRPV3-N427H mutant).
De 2-APB gevoeligheid in verwante ThermoTRPs: TRPV1, TRPV2, en TRPV4.
Mammalian TRPV3 is nauw verwant aan TRPV1 (39% aminozuur homologie), TRPV2 (36% homologie), en TRPV4 (38% homologie). Interessant is dat 2-APB een gemeenschappelijke agonist is van TRPV1, TRPV2, en TRPV3, maar niet van TRPV4 (18). Daarom vroegen wij ons af of er een gemeenschappelijk mechanisme bestaat voor de werking van 2-APB op deze verwante ionenkanalen. De equivalente positie van de muis TRPV3 His-426 is N in TRPV1 (N419), TRPV2 (N379), en TRPV4 (N456) (Fig. 4A; Fig. S5A). De equivalente positie van de muis TRPV3 R696 in de TRP box is ook R (R701) in TRPV1, een geconserveerde lysine (K664) in TRPV2, en een niet-geladen tryptofaan (W737) in TRPV4 (Fig. 4A; Fig. S5A).
Mutaties van TRPV4 op 2 cytoplasmatische residuen die zijn geïdentificeerd, maken TRPV4 gevoelig voor 2-APB. (A) Sequence alignment van de N-terminale regio en de C-terminale TRP box van muis TRPV3 en rat TRPV4. Residuen die nodig zijn voor muis TRPV3 reacties op 2-APB en gelijkwaardige residuen in TRPV4 zijn aangegeven. Diagrammen illustreren de posities van de 2 intracellulaire residuen en tonen een schematische voorstelling van de dubbele mutaties in TRPV4. Foutbalkjes zijn SE’s; n = 5 voor elke kloon. (B) Concentratie-afhankelijke respons op 2-APB en 4-α-PDD in HEK293 cellen getransfecteerd met wild-type of gemuteerde TRPV4; n = 5 voor elke kloon.
We richtten ons op het N-terminale H residu, dat specifiek nodig is voor een goede 2-APB respons voor zoogdieren en amfibieën TRPV3, en een N naar H mutatie op dit residu is voldoende om robuuste 2-APB respons te induceren in kip TRPV3. Wild-type TRPV1 en TRPV2 hebben N’s op dezelfde positie als TRPV3 H426, maar vertonen robuuste responsen op 2-APB. Dit resultaat doet de mogelijkheid rijzen dat TRPV1 en TRPV2 reageren op 2-APB via verschillende mechanismen in vergelijking met TRPV3. Niettemin hebben we getest of het introduceren van een H op deze positie specifiek de 2-APB responsen in TRPV2 en TRPV1 beïnvloedt. De TRPV1-N419H mutant had verhoogde responsen op zowel 2-APB als capsaïcine, wat wijst op een niet-specifiek effect op kanaalexpressie of -functie (Fig. S5B). De overeenkomstige TRPV2-N379H mutant had vergelijkbare 2-APB en probenecid (een andere TRPV2 agonist) responsen in vergelijking met wild-type TRPV2 (Fig. S5C) (30). Deze resultaten suggereren dat het mechanisme van 2-APB activering van TRPV2 en TRPV1 niet volledig geconserveerd is met dat van TRPV3 (zie Discussie).
We vroegen ons vervolgens af of de equivalente residuen van TRPV3-H426 en R696 verantwoordelijk zijn voor het ontbreken van 2-APB responsen in TRPV4. Om deze vraag te beantwoorden muteerden we gelijkwaardige aminozuurresiduen op N456 en W737 in TRPV4 naar respectievelijk H en R (Fig. 4A). Wild-type TRPV4 en TRPV4-W737R vertoonden slechts marginale 2-APB responsen in vergelijking met vector-getransfecteerde controles (Fig. 4B). Echter, opmerkelijk, HEK293 cellen getransfecteerd met TRPV4-N456H gereageerd op 2-APB met een EC50 van 131,0 ± 3,3 uM (nHill = 2,4). Ook TRPV4 met dubbele mutaties N456H/W737R toonden een nog robuustere respons op 2-APB, met een EC50 van 10,0 ± 0,8 uM (nHill = 1,2) (dicht bij de waarde van wild-type muis TRPV3) (Fig. 4B). Reacties op de TRPV4 agonist 4-α-PDD waren niet significant verschillend tussen wild-type TRPV4 en alle TRPV4 mutanten, wat suggereert dat verhoogde 2-APB reacties niet te wijten zijn aan verhoogde TRPV4 expressie niveau of de algehele winst van functie (Fig. 4B). Opnamen in uitgesneden inside-out patches uitdrukken TRPV4, TRPV4-N456H, TRPV4-W737R, of TRPV4-N456H/W737R onthuld enkel-kanaal activiteit door 150 pM 2-APB in zowel TRPV4-N456H en TRPV4-N456H/W737R, met de laatste met meer robuuste reacties (Fig. S6 B en C). Geen 2-APB-geactiveerde enkele kanaal activiteit werd gezien in wild-type TRPV4 en TRPV4-W737R (Fig. S6A; en data niet getoond). Deze resultaten geven aan dat verschillen op de 2 aminozuurresiduen geïdentificeerd in onze screening verantwoordelijk zijn voor het gebrek aan 2-APB gevoeligheid van TRPV4.