U.S. Food and Drug Administration

juli 2000

Toxicologische beginselen voor de veiligheidsbeoordeling van voedselingrediëntenRedbook 2000Hoofdstuk IV.C.1.d. Micronucleustest op zoogdier-erytrocyten

Terug naar Redbook 2000 inhoudsopgave

I. Inleiding

Micronuclei zijn cytoplasmatische chromatine-bevattende lichamen die worden gevormd wanneer acentrische chromosoomfragmenten of chromosomen tijdens de anafase achterblijven en er niet in slagen om tijdens de celdeling in de dochtercelkernen te worden opgenomen. Omdat genetische schade die resulteert in chromosoombreuken, structureel abnormale chromosomen of spindelafwijkingen tot micronucleusvorming leidt, dient de incidentie van micronuclei als een index van deze soorten schade. Er is vastgesteld dat in wezen alle agentia die dubbelstrengs chromosoombreuken veroorzaken (clastogenen) micronuclei induceren. Omdat het tellen van micronuclei veel sneller gaat en technisch minder veeleisend is dan het scoren van chromosoomafwijkingen, en omdat micronuclei het gevolg zijn van twee belangrijke soorten genetische schade (clastogenese en spindelontwrichting), is de micronucleus-test op grote schaal gebruikt om te screenen op chemische stoffen die deze soorten schade veroorzaken.

Deze richtsnoeren hebben betrekking op de meest gebruikte in vivo micronucleus-test: de micronucleus-test op erytrocyten van zoogdieren. Deze in vivo micronucleustest wordt gebruikt voor het opsporen van door de teststof veroorzaakte schade aan de chromosomen of het mitotisch apparaat van erytroblasten door analyse van erytrocyten zoals bemonsterd in beenmerg- en/of perifere bloedcellen van dieren, meestal knaagdieren.

Het doel van de micronucleustest is het identificeren van stoffen die cytogenetische schade veroorzaken die resulteert in de vorming van micronuclei die achtergebleven chromosoomfragmenten of hele chromosomen bevatten.

Wanneer een beenmergerytroblast zich ontwikkelt tot een polychromatische erytrocyt, wordt de hoofdkern geëxtrudeerd; gevormde micronuclei kunnen achterblijven in het anders geënucleerde cytoplasma. Het zichtbaar maken van micronuclei wordt in deze cellen vergemakkelijkt door specifieke kleuringstechnieken en omdat zij geen hoofdkern hebben. Een toename van de frequentie van micronuclei in polychromatische erytrocyten bij behandelde dieren is een aanwijzing voor geïnduceerde chromosoombeschadiging.

II. Definities

Centromeer (Kinetochore) is (een) gebied(en) van een chromosoom waarmee tijdens de celdeling spindelvezels zijn verbonden, die een ordelijke verplaatsing van de dochterchromosomen naar de polen van de dochtercellen mogelijk maken.

Micronuclei zijn kleine kernen, gescheiden van en toegevoegd aan de hoofdkernen van cellen, die tijdens de telofase van de mitose (meiose) worden geproduceerd door achterblijvende chromosoomfragmenten of hele chromosomen.

Normochromatische erytrocyt is een rijpe erytrocyt die ribosomen ontbeert en kan worden onderscheiden van onrijpe, polychromatische erytrocyten door kleuring die selectief is voor ribosomen.

Polychromatische erytrocyten zijn onrijpe erytrocyten, in een tussenstadium van ontwikkeling, die nog ribosomen bevatten en daarom van rijpe, normochromatische erytrocyten kunnen worden onderscheiden door kleuring die selectief is voor ribosomen.

III. Initiële overwegingen

Het beenmerg van knaagdieren wordt routinematig voor deze test gebruikt, aangezien polychromatische erytrocyten in dat weefsel worden geproduceerd. De meting van onrijpe (polychromatische) erytrocyten met micronuclei in perifeer bloed is evenzeer aanvaardbaar bij elke diersoort waarbij het onvermogen van de milt om erytrocyten met micronuclei te verwijderen is aangetoond, of waarbij een afdoende gevoeligheid is gebleken om stoffen te detecteren die structurele en/of numerieke chromosoomafwijkingen veroorzaken. Micronuclei kunnen aan de hand van een aantal criteria worden onderscheiden. Zo kan onder meer worden nagegaan of in de micronuclei al dan niet een kinetochore of centromeer-DNA aanwezig is. De frequentie van het aantal onrijpe (polychromatische) erytrocyten met micronuclei is het voornaamste eindpunt. Het aantal rijpe (normochromatische) erytrocyten in het perifere bloed dat micronuclei bevat onder een gegeven aantal rijpe erytrocyten kan ook als eindpunt van de bepaling worden gebruikt wanneer de dieren ononderbroken worden behandeld gedurende een periode die langer is dan de levensduur van de erytrocyt in de betrokken soort (bv. 4 weken in de muis), mits er in die soort/stam geen significante splenische selectie tegen gemicronucleerde erytrocyten optreedt. De gevolgen van eventuele splenische selectie moeten volledig worden onderzocht.

De in vivo micronucleustest bij zoogdieren is bijzonder relevant voor de beoordeling van het mutagene gevaar, omdat rekening kan worden gehouden met factoren van het metabolisme in vivo, de farmacokinetiek en de DNA-herstelprocessen, hoewel deze per soort, per weefsel en per genetisch eindpunt kunnen verschillen. Een in-vivotest is ook nuttig voor nader onderzoek van een mutageen effect dat met een in-vitrosysteem is gesignaleerd.

Als er aanwijzingen zijn dat de teststof, of een reactieve metaboliet, het doelweefsel niet zal bereiken, is het niet zinvol deze test te gebruiken.

IV. Principe van de testmethode

De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld. Indien beenmerg wordt gebruikt, worden de dieren op geschikte tijdstippen na de behandeling geofferd, wordt het beenmerg geëxtraheerd en worden preparaten gemaakt en gekleurd.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, wordt dit op geschikte tijdstippen na de behandeling afgenomen en worden uitstrijkpreparaten gemaakt en gekleurd.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) De preparaten worden geanalyseerd op de aanwezigheid van micronuclei.

V. Beschrijving van de methode

A. Bereidingen

1.

1. Keuze van diersoort

Historisch gezien zijn voor deze bepaling routinematig muizen of ratten gebruikt. Als beenmerg het bemonsterde weefsel is, kan elke geschikte zoogdiersoort worden gebruikt (zie deel III, hierboven). Zoals bij elk toxicologisch onderzoek moet de keuze van de geschikte soort worden gemotiveerd. Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, worden muizen aanbevolen. Elke geschikte zoogdiersoort kan echter worden gebruikt, mits het een soort is waarbij de milt geen erytrocyten met micronuclei verwijdert, of een soort waarvan is aangetoond dat de gevoeligheid voor het detecteren van stoffen die structurele en/of numerieke chromosoomafwijkingen veroorzaken toereikend is. Er moet gebruik worden gemaakt van algemeen gebruikte laboratoriumstammen van jonge gezonde dieren. Bij het begin van de studie moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit niet meer bedragen dan ±20% van het gemiddelde gewicht van elk geslacht.

2. Huisvesting en voederomstandigheden

De temperatuur in het proefdierlokaal moet geschikt zijn voor de gebruikte soort; voor muizen en ratten moet deze 22°C (±3°C) bedragen. De relatieve vochtigheid dient ten minste 30% te bedragen en mag bij voorkeur niet hoger zijn dan 70%, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte; gestreefd dient te worden naar 50-60%. De verlichting dient kunstmatig te zijn, met een volgorde van 12 uur licht en 12 uur donker. Voor het voederen kan gebruik worden gemaakt van conventionele laboratoriumdiëten met een onbeperkte toevoer van drinkwater. De keuze van het dieet kan worden beïnvloed door de noodzaak te zorgen voor een geschikt mengsel van een teststof wanneer deze langs deze weg wordt toegediend. De dieren kunnen individueel worden gehuisvest, of in kleine groepen van hetzelfde geslacht.

3. Voorbereiding van de dieren

Gezonde jongvolwassen dieren moeten willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen worden ingedeeld. De dieren moeten op unieke wijze worden geïdentificeerd. De dieren dienen gedurende ten minste vijf dagen aan de omstandigheden in het laboratorium te worden geacclimatiseerd. De kooien moeten zodanig worden ingericht dat mogelijke effecten als gevolg van de plaatsing van de kooien tot een minimum worden beperkt.

4. Voorbereiding van de doses

Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en zo nodig vóór de toediening aan de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks worden gedoseerd of vóór de dosering worden verdund. Er moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is.

B. Testomstandigheden

1.

1. Oplosmiddel/medium

Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en er mag geen vermoeden van chemische reactie met de teststof bestaan. Indien andere dan de gebruikelijke oplosmiddelen/media worden gebruikt, moet het gebruik daarvan worden gestaafd met referentiegegevens waaruit blijkt dat zij verenigbaar zijn met de teststof en de dieren. Aanbevolen wordt om, waar mogelijk, eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel/medium te overwegen.

2. Controles

Bij elke test met knaagdieren moeten in het algemeen voor elk geslacht zowel positieve als negatieve (oplosmiddel/medium) controles worden uitgevoerd. Wanneer de micronucleus-test echter wordt uitgevoerd als onderdeel van een algemeen toxiciteitsonderzoek volgens GLP-richtlijnen, zal de controle op de juiste dosering worden uitgevoerd door middel van chemische analyse. In dergelijke gevallen is het wellicht niet nodig de dieren gelijktijdig met een positief controlemiddel te behandelen en kunnen de kleuring en de score worden gecontroleerd door geschikte referentiemonsters op te nemen die eerder zijn verkregen van dieren die geen deel uitmaken van het huidige experiment. In studies met hogere diersoorten, zoals primaten of honden, kunnen positieve controles achterwege worden gelaten, mits het testlaboratorium eerder heeft aangetoond dat de reactie op positieve controlestoffen van de gebruikte soort aanvaardbaar is. In alle gevallen zijn tegelijkertijd uitgevoerde negatieve controles een verplicht onderzoeksonderdeel. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de behandelingsgroepen.

Positieve controles moeten in vivo micronuclei produceren op blootstellingsniveaus waarvan verwacht wordt dat ze een detecteerbare, statistisch significante stijging ten opzichte van het achtergrondniveau geven. De doses van de positieve controles moeten zo worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn, maar de identiteit van de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk aan de lezer wordt prijsgegeven. Het is aanvaardbaar dat de positieve controle via een andere weg dan de teststof wordt toegediend en slechts op één tijdstip wordt bemonsterd. Daarnaast kan het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen, indien deze beschikbaar zijn. Voorbeelden van positieve controlestoffen zijn:

Negatieve controledieren, die alleen met oplosmiddel of medium zijn behandeld en verder op dezelfde manier zijn behandeld als de behandelingsgroepen, moeten voor elk bemonsteringstijdstip worden opgenomen, met dien verstande dat het onder geschikte omstandigheden mogelijk kan zijn een dier als eigen controle te gebruiken door de monsters van vóór en na de behandeling te vergelijken. Indien afzonderlijke bemonstering wordt toegepast voor negatieve controles, dient het gekozen bemonsteringstijdstip te worden gemotiveerd. Daarnaast moeten ook onbehandelde controles worden gebruikt, tenzij er a) gegevens van het testlaboratorium beschikbaar zijn, of b) historische of gepubliceerde controlegegevens zijn waaruit blijkt dat het gekozen oplosmiddel/medium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

Als perifeer bloed wordt gebruikt, kan een voorbehandelingsmonster ook aanvaardbaar zijn als gelijktijdige negatieve controle, maar alleen in de korte perifere bloedonderzoeken (bv, 1-3 behandeling(en)) wanneer de resulterende gegevens binnen het verwachte bereik voor de historische controle liggen en wanneer de afwezigheid van een oplosmiddeleffect is aangetoond.

VI. Procedure voor ratten en muizen

De volgende paragrafen bevatten aanwijzingen voor de procedures bij muizen en ratten, de soorten die het meest voor deze test worden gebruikt.

A. Aantal en geslacht van de dieren

Elke behandelde en controlegroep moet ten minste vijf analyseerbare dieren per geslacht omvatten.(12) Als er op het tijdstip van de studie gegevens beschikbaar zijn uit studies bij dezelfde soort en met dezelfde blootstellingsweg, waaruit blijkt dat er geen significante verschillen in toxiciteit tussen de geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht uit te voeren.

B. Behandelingsschema

Er kunnen verschillende behandelingsschema’s (d.w.z. 1, 2 of meer behandelingen met een interval van 24 uur) worden aanbevolen. Monsters van verlengde doseringsschema’s zijn aanvaardbaar zolang een positief effect voor dit onderzoek is aangetoond of, voor een negatief onderzoek, zolang toxiciteit is aangetoond of de limietdosis (zie rubriek “D”, hieronder) is gebruikt en de dosering is voortgezet tot het tijdstip van bemonstering. Dit is gebaseerd op studies waaruit blijkt dat herhaalde blootstelling van muizen en ratten tot subchronische toxiciteit effecten veroorzaakt die vergelijkbaar zijn met die welke met de traditionele acute test worden verkregen.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Omdat er echter enige bezorgdheid bestaat dat de gevoeligheid bij onderzoeken op langere termijn zou kunnen afnemen doordat er geen echte MTD wordt bereikt, of omdat er aanpassing kan optreden, wordt er momenteel van uitgegaan dat de duur van de behandeling tot vier weken moet worden beperkt totdat de gevoeligheid van de test wordt bevestigd wanneer er langere behandelingen worden gebruikt.(12)

De teststoffen kunnen ook als gesplitste dosis worden toegediend, d.w.z, twee of meer behandelingen op dezelfde dag met een tussenpoos van niet meer dan enkele uren, om de toediening van een grote hoeveelheid materiaal te vergemakkelijken of om schommelingen in de bloedspiegels van het teststofje tot een minimum te beperken.

Twee manieren waarop de test kan worden uitgevoerd zijn:

• De dieren worden eenmaal of tweemaal met de teststof behandeld met een tussenpoos van niet meer dan 24 uur. Beenmergmonsters worden ten minste tweemaal genomen tussen 24 en 48 uur na de laatste dosis, met een passend interval of passende intervallen tussen de monsters. Voor het gebruik van bemonsteringstijden eerder dan 24 uur na de behandeling moet een motivering worden gegeven. Monsters van perifeer bloed worden ten minste tweemaal genomen tussen 36 en 72 uur na de laatste behandeling, met een passend interval of passende intervallen tussen de monsters. Wanneer op één bemonsteringstijdstip een positieve reactie wordt geconstateerd, zijn extra bemonsteringen niet nodig.
• In geval van drie of meer dagelijkse behandelingen (bv. drie of meer behandelingen met een interval van 24 uur) mogen de monsters voor het beenmerg eenmaal uiterlijk 24 uur na de laatste behandeling en voor het perifere bloed eenmaal uiterlijk 40 uur na de laatste behandeling worden genomen.(12), (20)

Aanvullende bemonsteringstijdstippen mogen worden gebruikt, indien dit relevant en wetenschappelijk gerechtvaardigd is.

C. Dosisniveaus

Als er een dosisbereikonderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen geschikte gegevens beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium worden uitgevoerd met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek.(7) Als er sprake is van toxiciteit, moeten er drie dosisniveaus worden gebruikt voor het eerste bemonsteringstijdstip. Deze dosisniveaus moeten een bereik hebben van duidelijke toxiciteit tot weinig of geen toxiciteit. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft alleen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt gedefinieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen veroorzaakt dat hogere dosisniveaus, gebaseerd op hetzelfde doseringsschema, naar verwachting tot letaliteit zouden leiden. Stoffen met specifieke biologische activiteiten bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vormen op de criteria voor dosisbepaling en moeten per geval worden beoordeeld. De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit van het beenmerg oplevert (b.v. een vermindering van het aandeel onrijpe erytrocyten onder het totale aantal erytrocyten in het beenmerg of het perifere bloed).

D. Limiettest

Als er geen waarneembare toxische effecten optreden na één behandeling met één dosisniveau van ten minste 2000 mg/kg lichaamsgewicht, of na twee behandelingen op dezelfde dag, en als genotoxiciteit niet zou worden verwacht op basis van gegevens van structureel verwante stoffen, is een volledig onderzoek met drie dosisniveaus wellicht niet nodig. Voor studies met een langere duur is de limietdosis 2000 mg/kg/lichaamsgewicht/dag voor een behandeling tot 14 dagen, en 1000 mg/kg/lichaamsgewicht/dag voor een behandeling langer dan 14 dagen. De verwachte blootstelling van de mens kan erop wijzen dat een hoger dosisniveau in de limiettest moet worden gebruikt.

E. Toediening van doses

De teststof wordt gewoonlijk toegediend door middel van een maagsonde met behulp van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule, of door intraperitoneale injectie. Andere wijzen van blootstelling kunnen aanvaardbaar zijn indien daarvoor een motivering kan worden gegeven. Het maximale volume vloeistof dat in één keer via een maagsonde of injectie kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Voor het gebruik van grotere volumes moet een motivering worden gegeven. Met uitzondering van irriterende of bijtende stoffen, waarvan de effecten normaliter bij hogere concentraties zullen verergeren, moet de variabiliteit in het testvolume tot een minimum worden beperkt door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume wordt bereikt.

F. Beenmerg/bloedpreparaten

Botmergcellen worden meestal onmiddellijk na het offeren uit het dijbeen of scheenbeen verkregen. Gewoonlijk worden cellen uit dijbenen of scheenbenen verwijderd, geprepareerd en gekleurd volgens gevestigde methoden. Perifeer bloed wordt afgenomen uit de staartader of een ander geschikt bloedvat. De bloedcellen worden onmiddellijk supravitaal gekleurd(4),(5),(14) of er worden uitstrijkpreparaten gemaakt en vervolgens gekleurd. Het gebruik van een DNA-specifieke kleuring (b.v. acridine oranje(15) of Hoechst 33258 plus pyronine-Y(30)) kan sommige artefacten elimineren die geassocieerd worden met het gebruik van een niet-DNA-specifieke kleuring. Dit voordeel sluit het gebruik van conventionele kleurstoffen (b.v. Giemsa) niet uit. Bijkomende systemen (bv, cellulosekolommen voor het verwijderen van cellen met een celkern(36)) kunnen ook worden gebruikt, mits is aangetoond dat deze systemen in het laboratorium afdoende werken voor micronucleuspreparaten.

G. Analyse

Het aandeel onrijpe erytrocyten onder het totaal (onrijpe + rijpe) erytrocyten wordt voor elk dier bepaald door in totaal ten minste 200 erytrocyten voor beenmerg en 1000 erytrocyten voor perifeer bloed te tellen.(9) Alle objectglaasjes, ook die van positieve en negatieve controles, moeten vóór de microscopische analyse onafhankelijk van elkaar worden gecodeerd. Per dier worden ten minste 2000 onrijpe erytrocyten gescoord op de incidentie van onrijpe erytrocyten met micronuclei. Aanvullende informatie kan worden verkregen door rijpe erytrocyten te scoren op micronuclei. Bij de analyse van objectglaasjes mag het aandeel onrijpe erytrocyten in het totale aantal erytrocyten niet minder dan 20% van de controlewaarde bedragen. Wanneer de dieren gedurende 4 weken of langer continu worden behandeld, kunnen ook ten minste 2000 rijpe erytrocyten per dier worden gescoord op het vóórkomen van micronuclei. Systemen voor geautomatiseerde analyse (beeldanalyse of flowcytometrische analyse van celsuspensies) zijn aanvaardbare alternatieven voor handmatige evaluatie indien zij naar behoren gerechtvaardigd en gevalideerd zijn ten opzichte van de klassieke microscopische scoring.(12)

VII. Procedure voor andere diersoorten dan ratten en muizen

Gepubliceerde informatie op basis van studies bij muizen, ratten, hamsters, varkens, honden, niet-menselijke primaten en mensen(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) blijkt dat spontane en geïnduceerde frequenties van erytrocyten met micronuclei bij de meeste zoogdiersoorten vergelijkbaar zijn, en suggereert dat meting van de incidentie van onrijpe erytrocyten met micronuclei in het beenmerg geschikt is voor de beoordeling van chromosomale of spilschade bij de soorten die tot op heden zijn bestudeerd. Het verschijnen en verdwijnen van onrijpe erytrocyten met micronuclei in het beenmerg is een functie van de kinetiek van de erytrogenese en de levensduur van erytrocyten bij elke soort, en daarom moeten de doserings- en bemonsteringsschema’s worden aangepast aan de juiste parameters van de erytrocytenkinetiek voor elke soort. Andere soorten dan muizen of ratten kunnen eventueel worden gebruikt, maar de volgende informatie moet worden vermeld:

• Aantoonbaarheid van de gekozen soort, en de gebruikte doserings- en bemonsteringsschema’s in relatie tot de kinetiek van erytropoëse en de levensduur van erytrocyten bij de gebruikte soort;
• Aantoonbaar bewijs dat de spontane micronucleusfrequentie consistent is met gepubliceerde informatie, en/of consistent binnen het laboratorium dat het onderzoek uitvoert;
• Aanwijzingen dat bekende genotoxische stoffen een toename van de micronucleusfrequentie veroorzaken bij de gebruikte diersoort, en referentiewaarden voor de grootte van de geïnduceerde respons;
• Effect van selectieve verwijdering van de micronucleuscellen uit het perifere bloed door de milt (wanneer dit laatste dient als het weefsel dat wordt gecontroleerd).

VIII. Gegevens en rapportage

A. Behandelingsresultaten

De gegevens van individuele dieren moeten in tabelvorm worden weergegeven. De experimentele eenheid is het dier. Het aantal gescoorde onrijpe erytrocyten, het aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei en het aantal onrijpe erytrocyten onder het totale aantal erytrocyten moeten voor elk geanalyseerd dier afzonderlijk worden vermeld. Wanneer de dieren gedurende vier weken of langer ononderbroken worden behandeld, moeten ook de gegevens over rijpe erytrocyten worden vermeld als deze zijn verzameld. Voor elk dier moet het aandeel onrijpe erytrocyten onder het totale aantal erytrocyten en, indien van toepassing geacht, het percentage rijpe erytrocyten met micronuclei worden vermeld. Indien er geen aanwijzingen zijn voor een verschil in reactie tussen de geslachten, kunnen de gegevens van beide geslachten voor de statistische analyse worden gecombineerd.

B. Evaluatie en interpretatie van de resultaten

Er zijn verschillende criteria om een positief resultaat te bepalen, zoals een dosisafhankelijke stijging van het aantal cellen met micronuclei of een duidelijke stijging van het aantal cellen met micronuclei in één dosisgroep op één bemonsteringstijd. Voor de evaluatie van de testresultaten moeten statistische methoden worden gebruikt.(24),(35) De statistische criteria voor een positief, negatief of onduidelijk resultaat moeten duidelijk in het protocol worden vermeld. Aangezien biologische factoren de interpretatie kunnen veranderen, mag statistische significantie niet de enige bepalende factor zijn om tot een conclusie te komen. Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal het in zeldzame gevallen onmogelijk zijn om op grond van de beschikbare gegevens een definitief oordeel te vellen over de activiteit van de teststof. De resultaten kunnen onduidelijk of twijfelachtig blijven, ongeacht het aantal keren dat het experiment wordt herhaald.

Positieve resultaten bij de micronucleustest wijzen erop dat een stof micronuclei induceert, die het resultaat zijn van chromosoomschade of schade aan het mitotisch apparaat in de erytroblasten van de geteste soort. Negatieve resultaten wijzen erop dat de teststof onder de testomstandigheden geen chromosoom- of spilschade veroorzaakt die leidt tot de vorming van micronuclei in de onrijpe erytrocyten van de testsoort.

De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in de grote bloedsomloop of specifiek het doelweefsel terechtkomen (bv. systemische toxiciteit), moet worden besproken. Het aantonen van een adequate blootstelling van het doelweefsel bij een negatieve micronucleustest is een bijzonder belangrijke overweging wanneer er positieve aanwijzingen zijn voor genotoxiciteit in een of meer andere testsystemen.

C. Testrapport

Het testrapport moet ook de volgende informatie bevatten:

1. Teststof

• identificatiegegevens en CAS-nr, indien bekend
• fysische aard en zuiverheid
• fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van het onderzoek van belang zijn
• stabiliteit van de teststof, indien bekend

2. Oplosmiddel/medium

• rechtvaardiging voor de keuze van het medium
• oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend

3. Doseeroplossingen

• tijden waarop de doseeroplossingen zijn bereid en gebruikt (of interval tussen bereiding en gebruik), en opslagcondities
• gegevens die de concentratie van de doseeroplossing verifiëren, indien beschikbaar

4. Gebruikte proefdieren

• soorten/stammen, met motivering
• aantal, leeftijd en geslacht van de dieren
• bron, huisvestingsomstandigheden, voeding, enz.
• individueel gewicht van de dieren bij het begin van de test, met vermelding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwijking van het lichaamsgewicht voor elke groep
• informatie over de mogelijke invloed van selectie van de milt op het vóórkomen van cellen met micronuclei in het perifere bloed, indien van toepassing

5. Testomstandigheden

• positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controlegegevens
• gegevens van het oriënterend onderzoek, indien uitgevoerd
• redenen voor de keuze van het dosisniveau
• details van de bereiding van de teststof
• details van de toediening van de teststof
• redenen voor de toedieningsweg en doseringsschema
• methoden om na te gaan of de teststof de grote bloedsomloop en/of het doelweefsel heeft bereikt, indien van toepassing
• omrekening van de concentratie van de teststof in dieet/drinkwater (ppm) naar de feitelijke dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing
• details over de voedsel- en waterkwaliteit
• detaille beschrijving van de behandelings- en bemonsteringsschema’s
• methoden voor het prepareren van objectglaasjes
• methoden voor het meten van de toxiciteit
• criteria voor het scoren van onrijpe erytrocyten met micronuclei en, indien van toepassing, rijpe erytrocyten
• aantal geanalyseerde cellen per dier
• criteria om studies als positief, negatief of onduidelijk te beschouwen

6. Resultaten

• verschijnselen van toxiciteit
• aandeel onrijpe erytrocyten onder het totaal aantal erytrocyten
• aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei onder het totaal aantal onrijpe erytrocyten, afzonderlijk vermeld voor elk dier
• indien van toepassing, aantal rijpe erytrocyten met micronuclei onder het totaal aantal rijpe erytrocyten, afzonderlijk vermeld voor elk dier
• gemiddelde ± standaardafwijking van het aantal onrijpe en, indien van toepassing, rijpe erytrocyten met micronuclei per groep
• dosis-responsrelatie, indien mogelijk
• statistische analyses en motivering van de toegepaste methode, met passende literatuurcitaat
• concurrente en historische negatieve controlegegevens
• concurrente en historische positieve controlegegevens

7. Bespreking van de resultaten

8. Conclusie

XI. Addendum: Identification of Micronuclei Derived from Acentric Fragments vs. Centromeric Chromosomes

Micronuclei kunnen worden gevormd door acentrische fragmenten of volledige chromosomen die in mitose achterblijven. Deze laatste micronuclei werden eerst herkend aan hun grote omvang,(49) door C-banding(47) of door meting van het DNA-gehalte.(46) Deze methoden waren echter niet erg betrouwbaar. Daarom werden twee moleculair cytogenetische methoden ontwikkeld om de aanwezigheid van centromeren in micronuclei vast te stellen en zo een onderscheid te maken tussen micronuclei van clastogene en aneugene oorsprong:(12) 1) immunofluorescente CREST-kleuring en 2) fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met pancentromerische DNA-probes. Wanneer het mechanistisch van belang is om de aanwezigheid van de kinetochore of centromeer in de micronuclei vast te stellen, kunnen deze methoden worden toegepast.

De CREST-methode toegepast op de beenmerg-micronucleustest wordt in detail beschreven door Miller en Adler.(33) Cellen op objectglaasjes (normale beenmerguitstrijkjes) worden gefixeerd, gedehydrateerd, in twee stappen geïncubeerd met SDS en Triton-X, en vervolgens gekleurd met antilichaam. DNA wordt tegengekleurd met Hoechst 33258.

Met FISH wordt de minor satellite DNA-probe die dicht bij het centromeer hybridiseert(43) gebruikt om het centromeergebied te identificeren, indien aanwezig. Een methode voor FISH met de centromerische DNA-probes is beschreven door Pinkel et al.(34) Deze methode kan worden toegepast op door stroming gesorteerde micronuclei bevattende erytrocyten(10) of op geïsoleerde micronuclei verkregen uit perifere bloedmonsters.(13)

In controleglaasjes is het percentage gelabelde micronuclei die de centromerische regio bevatten ongeveer 50%.(43) Ongeveer 70% van de micronuclei geïnduceerd door bekende aneugenen (colchicine en vinblastine) zijn gelabeld,(33) terwijl die geïnduceerd door clastogenen (hydrochinon en mitomycine C) slechts 5-15% gelabelde micronuclei laten zien.(33) Om de relatieve clastogene versus aneugene activiteit van een chemische stof te karakteriseren, is het nuttig om als index het aantal gemicronucleerde polychromatische erytrocyten per 1000 polychromatische erytrocyten te gebruiken die de centromere regio bevatten.(42)

De belangrijkste tekortkoming in de tot nu toe beschreven FISH methoden is dat zij geen onderscheid maken tussen normochromatische en polychromatische erytrocyten.(12) Bijgevolg zijn alleen preparaten waarin een grote fractie van de aanwezige micronuclei door het testvoorwerp wordt geïnduceerd, geschikt voor analyse. Zo zijn bijvoorbeeld monsters van perifeer bloed uit experimenten met acute blootstellingen bij volwassen dieren in wezen nooit geschikt voor analyse, omdat de doelcelpopulatie (onrijpe erytrocyten) slechts 3-5% van de erytrocyten in het monster uitmaakt.

Concluderend worden CREST- of FISH-labeling beschouwd als betrouwbare methoden om aneugene eigenschappen van chemische stoffen in de in vivo micronucleus-test te detecteren, mits erop wordt toegezien dat geschikte monsters voor de analyse worden gebruikt.(12) De complexiteit van de huidige methoden beperkt echter het gebruik ervan tot die gevallen waarin een chemische stof ervan wordt verdacht spindelstoornissen te veroorzaken (bijv, als gevolg van de aanwezigheid van grote micronuclei, de inductie van polyploïdie, enz.) of wanneer er andere specifieke redenen zijn om deze mechanistische informatie te verkrijgen.

X. References

1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). Micronuclei Induced in Peripheral Blood of mu-PIM-1 Transgenic Mice by Chronic Oral Treatment with 2-Acetylaminofluorene or Benzene but not with Diethylnitrosamine or 1,2-Dichloroethane. Mutation Res. 302:61-70.
2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Induction of Micronuclei by Benzene in B6C3F1 Mice: Retrospectieve analyse van perifere bloeduitstrijkjes van de NTP carcinogenese bioassay. Mutation Res. 143:55-59.
3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. and Book, S.A. (1989). Primate Micronucleus Study of L-Selenomethionine. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol Recommended for the Short-Term Mouse Peripheral Blood Micronucleus Test. Mutagenesis 10:153-159.
6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. and MacGregor, J.T. (1988). Association of Marginal Folate Depletion with Increased Human Chromosomal Damage In Vivo: Demonstration by Analysis of Micronucleated Erythrocytes. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J., and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). De in vivo micronucleustest bij ratten: integratie met een 14-daagse studie. Mutation Res. 342:71-6.
9. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample Size for the Estimation of Polychromatic to Normochromatic Erythrocyte Ratio in the Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 347:97-99).
10. Grawé J., Nüsse M. and Adler I.-D. (1997). Quantitative and Qualitative Studies of Micronucleus Induction in Mouse Erythrocytes Using Flow Cytometry: I. Measurement of Micronucleus Induction in Peripheral Blood Polychromatic Erythrocytes by Chemicals with Known and Suspected Genotoxicity. Mutagenesis 12:1-8.
11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). Evaluation of the Rodent Long-Term Micronucleus Assay: Summary of the 13th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. and Sutou, S. (2000). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay: II. Some Aspects of Protocol Design Including Repeated Treatements, Integration with Toxicity Testing, and Automated Scoring. Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Isolation of Micronuclei from Mouse Blood, Fluorescence In Situ Hybridization with a Mouse Centromeric DNA-Probe. Mutation Res. 307:245-251.
14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1990). Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Research 245:245-249.
15. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120:241-247.
16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res. 312:293-304.
17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123:61-118.
19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Induction of Micronuclei in Rat Bone Marrow and Peripheral Blood Following Acute and Subchronic Treatment with Azathioprine. Mutation Res. 291:79-85.
20. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An Optimal, Generalized Sampling Time of 30 ±6 h After Double Dosing in the Mouse Peripheral Blood Micronucleus Test. Mutagenesis 10:313-319.
21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadieen: Induction of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Blood of B6C3F1 Mice Exposed by Inhalation for 13 Weeks. Mutation Res. 209:171-176.
22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). Validation of micronucleus evaluation in the rat using flow cytometry with five model compounds. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). Principles and Practices of Integrating Genotoxicity Evaluation in Routine Toxicology Studies: A Pharmaceutical Industry Perspective. Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney pp. 184-232.
25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). The Effect of Exposure Regimen and Duration on Benzene-Induced Bone-Marrow Damage in Mice. I. Geslachtsvergelijking bij DBA/2 muizen. Mutation Res. 203:251-271.
26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. and Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: “Developments in Science and Practice of Toxicology”, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: The Basis of an Improved Micronucleus Test. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). De in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Meting in stationaire toestand verhoogt de efficiëntie van de test en maakt integratie met toxiciteitsstudies mogelijk. Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
31. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). Trenimon-Induced Chromosomal Damage in Bone Marrow Cells of Six Mammalian Species. Mutation Res. 12:417-425.
32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. Een rapport van het U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 239:29-80.
33. Miller B.M. and Adler I.-D. (1990). Application of Antikinetochore Antibody Staining (CREST Staining) to Micronuclei in Erythrocytes Induced In Vivo. Mutagenesis 5:411-415.
34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Cytogenetic Analysis Using Quantitative, High-Sensitivity Fluorescence Hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommissie voor richtlijnen voor mutageniteitsonderzoek. Rapport. Deel I herzien. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
36. Romagna, F. and Staniforth , C.D.(1989). The Automated Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 213:91-104
37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). A Rapid Screen for Cumulative Chromosomal Damage in Mice. Accumulatie van circulerende gemicronucleerde erythrocyten. Mutation Res. 113:481-487.
38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). The Persistence of Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: Detection of Chronic Chromosome Breakage in Mice. Mutatation Res. 104:367-369.
39. Schlegel, R. and MacGregor, J.T. (1984). The Persistence of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Circulation of Normal and Splenectomized Fischer 344 Rats: Implicaties voor Cytogenetische Screening. Mutation Res. 127:169-174.
40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. and Everson, R.B. (1986). Assessment of Cytogenetic Damage by Quantitation of Micronuclei in Human Peripheral Blood Erythrocytes. Cancer Res. 46:3717-3721.
41. Schmid, W. (1975). De Micronucleus Test. Mutation Res. 31:9-15.
42. Schriever-Schwemmer G. and Adler I.-D. (1997). Differentiation of Micronuclei in Mouse Bone Marrow Cells: A Comparison between CREST Staining and Fluorescence In Situ Hybridization with Centromeric and Telomeric DNA Probes. Mutagenesis 9:333-340.
43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U., and Adler I.-D. (1994). Extruded Micronuclei Induced by Colchicine or Acrylamide contain Most Lagging Chromosomes Identified in Paintbrush Smears by Minor and Major Mouse DNA Probes. Mutagenesis 12:201-207.
44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). Measurement of Micronucleated Erythrocytes and DNA Damage During Chronic Ingestion of Phenolphthalein in Transgenic Female Mice Heterozygous for the p53 Gene. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
45. Tsuchimoto, T. and Matter, B.E. (1979). In Vivo Cytogenetic Screening Methods for Mutagens, with Special Reference to the Micronucleus Test. Arch. Toxicol. 42:239-248.
46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L., and Kirsch-Volders M. (1989). The Mouse Bone Marrow Micronucleus Assay Can be Used to Distinguish Aneugens from Clastogens. Mutagenesis 4:6-11.
47. Verschaeve L., Vanderkerken K., and Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Vlek Technol. 63:351-354.
48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Phenolphthalein: Induction of Micronucleated Erythrocytes in Mice. Mutation Res. 341:151-60.
49. Yamamoto K.I. and Kikuchi Y. (1980). A Comparison of Diameters of Micronuclei Induced by Clastogens and by Spindle Poisons. Mutation Res. 71:127-131.
50. Yamamoto K.I. and Kikuchi Y. (1981). Studies on Micronuclei Time Response and on the Effects of Multiple Treatments of Mutagens on Induction of Micronuclei. Mutation Res. 90:163-173.