PEI bevordert de aanhechting van zwak verankerende cellen en primaire weefsels
PC-12 cellen worden gebruikt als een model van neuronale differentiatie in het laboratorium, omdat behandeling van deze cellen met zenuwgroeifactor (NGF) neurietverlenging en de expressie van biochemische markers van het sympathische neuronale fenotype induceert. Zij groeien als zwak verankerende cellen en collageen- of polylysinepolymeren worden vaak gebruikt voor de pre-coating van platen voor PC-12 celkweek. PC-12 cellen werden in het laboratorium gekweekt in naïeve putjes of in putjes die vooraf gecoat waren met diverse hechtingsfactoren (multiwell-12 weefselkweekschaaltjes), om het effect op de verankering van de cellen aan het substraat waar te nemen. In afwezigheid van een coating agent, de cellen vertoonden een karakteristieke neiging om clusters van cellen die zich ophopen naar het midden van de put te vormen; deze cellen zijn stevig bevestigd onderling, maar zeer zwak gehecht aan de weefselkweekschaal (figuur 1D). Dit resulteert in een zeer heterogene verdeling van de cellen (er blijven zeer weinig cellen over aan de rand van de wells) en een aanzienlijk verlies van cellen tijdens wasprocedures of veranderingen van medium. Voorbehandeling van de platen met PEI resulteerde in een aanzienlijk homogenere verdeling van de cellen in de putjes, waarbij de cellen zich stevig aan de plaat hechtten en veel minder de neiging vertoonden tot clustering (figuur 1A). Ter vergelijking werden platen ook voorbehandeld met andere veelgebruikte coating agents, collageen (figuur 1B) en poly-D-Lysine (PDL; figuur 1C), wat resulteert ook in steviger bevestiging van de cellen aan de platen en een meer homogene verdeling van cellen.
Aanhechting van PC-12 cellen en neuronale explantaten aan cultuur schalen. PC-12 cellen beter aan plastic oppervlakken die werden voorbehandeld met verankering-bevorderende factoren, zoals PEI (paneel A), collageen (paneel B), of PDL (paneel C), in vergelijking met de onbehandelde plastic oppervlak controle (paneel D), die cellen bevatte in clusters en zeer losjes gehecht aan het substraat (foto’s werden genomen halverwege tussen het midden en de rand van de plaat). PEI coating resulteerde in een homogene verdeling van cellen stevig aan de schotel substraat (paneel A). PEI bevordert gehechtheid aan cultuur gerechten van retinale explantaten van zebravis (paneel E). Deze gehechtheid factor was ter ondersteuning van neuriet uitbreiding in retinale explantaten voorbereid voor axonale groei door een pre-conditionering laesie aan de oogzenuw (paneel F). De bar in de fotomicrofoto’s komt overeen met 25 urn in de panelen A-D, 50 urn in paneel E, en 100 urn in paneel F.
Om verder te testen de verankering verbetering eigenschap waargenomen met de PEI voorbehandeling van de cultuur schalen, werd een tweede systeem gebruikt. Netvliesexplantaten van teleostvissen zijn gebruikt bij de studie van zenuwregeneratie. Wanneer een beschadiging wordt aangebracht aan de oogzenuw van de vis, wordt een regeneratiereactie in gang gezet en de retinale ganglioncellen (RGC’s) van het netvlies verlengen hun axon opnieuw naar het tectale doelweefsel. Wanneer het netvlies van een dergelijke “geprepareerde” vis wordt geëxplanteerd en gekweekt, wordt de regeneratierespons in vitro waargenomen door de versnelde extensie van lange neurieten. Dit fenomeen vereist echter het gebruik van een extracellulaire matrix of hechtingsfactoren (bijvoorbeeld collageen of PDL-coating), aangezien de explantaten een zeer lage affiniteit vertonen voor het niet-gecoate plastic oppervlak. Experimenten werden uitgevoerd om na te gaan of PEI kon fungeren als een bevestigingsfactor bevorderlijk voor axonale uitgroei van zebravis retinale explantaten. Netvlies explantaten van controle zebravis ogen waren in staat om te hechten aan PEI-behandelde cultuur schalen (figuur 1E). Bovendien retinale explantaten van vissen die een conditionering laesie ontvangen waren in staat om axonen krachtig uit te breiden wanneer gekweekt met behulp van PEI als bevestigingsfactor (figuur 1F).
De resultaten met het netvlies explantaten suggereerde dat neuronale cellen gehecht aan PEI-gecoate gerechten kunnen differentiëren, het genereren van neurieten die goed hechten aan het substraat. Om deze hypothese te testen met de pro-neuronale PC-12 cellen, werden differentiatie-experimenten door NGF behandeling uitgevoerd met cellen gehecht aan schalen gecoat met PEI. De PC-12 cellen behandeld met NGF bleef stevig bevestigd aan de plaat gedurende meerdere dagen, het genereren van netwerken van neurieten (figuur 2). De resultaten wijzen erop dat PEI permissief is voor het differentiatieproces en voor de aanhechting van de neurieten aan de schotel. De gedifferentieerde cellen bleven stevig verankerd gedurende immunocytochemie experimenten (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García en R. P. Ballestero, ongepubliceerde resultaten).
Differentiatie van PC-12 cellen bevestigd aan cultuur schalen gecoat met PEI. PC-12 cellen gehecht aan PEI gecoate schotels bleef stevig verankerd aan de plaat en uitgebreid neurieten na behandeling met NGF. De foto’s tonen de voortgang van de differentiatie van de behandelde cellen in de tijd: 0 uur (paneel A), 24 uur (paneel B), 48 uur (paneel C) en 96 uur (paneel D) na het begin van de behandeling met 100 ng/ml NGF. De balk in de fotomicrofoto’s komt overeen met 25 μm.
Sterkte van verankering van eukaryote cellen aan kweekschalen voorbehandeld met PEI en andere hechtingsfactoren
Drie verschillende cellijnen werden geselecteerd om het vermogen van PEI om sterke verankering aan plastic kweekschalen te bevorderen te testen. PC-12 en HEK-293 cellen zijn hierboven beschreven als zwak verankerend. Anderzijds zijn MYS-cellen primaire fibroblasten die zich sterk aan plastic kweekschaaltjes hechten en uitgroeien tot een monolaag van cellen op het oppervlak. Om de sterkte van de verankering van de diverse cellen aan platen te testen, werd een protocol uitgevoerd waarbij 4 opeenvolgende wasbeurten met isotone buffer werden uitgevoerd, gevolgd door het gebruik van een colorimetrisch protocol voor het tellen van de cellen die in de plaat bleven (op basis van de vitale kleurstof neutraalrood). Met de verschillende aanhechtingsfactoren voorbehandelde platen werden vergeleken met platen die geen voorbehandeling hadden ondergaan (onbehandeld). De experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de gemiddelden van de kleurstof die achterbleef in de platen die elke behandeling kregen, werden berekend. Deze gemiddelden werden genormaliseerd tot het gemiddelde dat werd verkregen met de PEI-voorbehandeling, waaraan in alle experimenten de arbitraire waarde van 100,0% werd toegekend. De resultaten van representatieve experimenten met de 3 cellijnen worden getoond in figuur 3 (ten minste drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd met elke cellijn). PC-12-cellen hechtten zich bijna even goed aan platen gecoat met PEI, collageen of PDL (relatieve celtellingen van 100,0% ± 5,3%, 89,3% ± 5,0% en 96,3% ± 5,8%, voor respectievelijk PEI, collageen en PDL). Er werd echter een aanzienlijk verlies van cellen waargenomen bij vergelijking van onbehandelde platen met PEI-behandelde platen, met een relatief celaantal van 43,9% ± 5,8% (figuur 3A). In het geval van HEK-293 hechtten de cellen zich sterk aan zowel PEI- als PDL-behandelde putjes. In het representatieve experiment getoond in figuur 3B, de relatieve tellingen met deze twee behandelingen waren 100,0% ± 0,4% en 96,8% ± 1,7% respectievelijk. Echter, een groot aantal cellen verloren wanneer uitgezet in de onbehandelde putten (relatieve telling van 8,3% ± 0,6%), of in de putten die werden voorbehandeld met collageen (11,5% ± 1,2%), wat suggereert dat deze cellen vrij losjes hechten aan plastic of aan collageen beklede putten. Tenslotte, wanneer de fibroblast cellen (MYS cellen) werden gebruikt, de cellen leek te vrij goed hechten aan alle vier oppervlakken, met inbegrip van de onbehandelde putten (figuur 3C). Figuur 3C toont een representatieve plot, met relatieve MYS cel aantallen van 100,0% ± 2,2%, 85,9% ± 7,8%, 73,7% ± 6,6%, en 77,1% ± 1,4%, met putten voorbehandeld met PEI, collageen, of PDL, of onbehandelde putten respectievelijk. Deze cellijn hecht zich dus vrij goed aan het onbehandelde plastic oppervlak in vergelijking met de PC-12 en HEK-293 cellijnen.
PEI-coating bevordert een stevige hechting van zwak verankerende cellen aan het substraat. Het verlies van cellen veroorzaakt door een protocol dat meerdere wasbeurten omvatte, werd gemeten om de sterkte in de hechting van cellen aan cultuurschalen gecoat met factoren die celverankering bevorderen, te beoordelen. PEI werd vergeleken met andere bevestigingsfactoren (collageen, PDL) en met onbehandelde controleschotels. De relatieve celtellingen werden genormaliseerd door een arbitraire waarde van 100,0% toe te kennen aan de met PEI voorbehandelde schotels. PEI coating resulteerde in een aanzienlijke verbetering van de verankering sterkte in PC-12 cellen (grafiek A) en in HEK-293 cellen (grafiek B), gunstig te vergelijken met andere algemeen gebruikte bevestigingsfactoren. Er werden geen voordelen waargenomen bij de hechting van een sterk verankerende cellijn (MYS-cellen, grafiek C). De balken tonen het gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige assays, die representatief zijn voor ten minste drie verschillende uitgevoerde experimenten (* significant hoger dan onbehandelde controle, p < 0,01; ** significant hoger dan onbehandelde controle in het gepresenteerde experiment, p < 0,01, maar significantie niet gehandhaafd in onafhankelijke experimenten).
Om een indicatie te geven van de variatie tussen de experimenten werden de gemiddelden ± standaardafwijkingen van de relatieve celtellingen, verkregen in de onafhankelijke experimenten, berekend voor elke cellijn en behandeling (merk op dat aangezien in alle experimenten de telling voor met PEI voorbehandelde putjes op 100,0% werd gesteld, de waarde voor het globale gemiddelde met deze coating-agent precies 100,0% is voor alle cellijnen). De vergelijkende resultaten voor de andere behandelingen worden hieronder aangegeven. Voor de PC-12-cellen bedroegen de relatieve tellingen 81,5% ± 8,8% voor met collageen behandelde putjes (n = 4), 93,9% ± 21,2% voor met PDL behandelde putjes (n = 4), en 52,1% ± 13,7% voor onbehandelde putjes (n = 4). Voor de HEK-293 cellen waren de relatieve tellingen 16,3% ± 12,7% voor met collageen geprepareerde putjes (n = 3), 99,6% ± 2,5% voor met PDL geprepareerde putjes (n = 3), en 9,0% ± 4,1% voor onbehandelde putjes (n = 3). In de experimenten met MYS-cellen was het gemiddelde van de relatieve tellingen met collageen voorbehandelde putjes 92,7% ± 16,2% (n = 3), 71,1% ± 6,7% voor PDL-behandelde putjes (n = 3), en 78,4% ± 11,5% voor onbehandelde putjes (n = 3). Statistische analyse geeft aan dat de verbetering van de hechting van zowel PC-12 en HEK-293 cellen aan PEI-behandelde schalen versus onbehandeld plastic is significant (p < 0,05 en p < 0,01 respectievelijk, t-test analyse), terwijl het niet statistisch significant voor MYS-cellen (p > 0,05).
Om de eigenschappen van PEI als bevestigingsfactor voor zwak verankerende cellen verder te karakteriseren, werden experimenten uitgevoerd om de dosering van PEI te analyseren die optimale celverankering kan bieden, het bereik van celaantallen die kunnen profiteren van de aanwezigheid van PEI, en de stabiliteit van PEI als bevestigingsfactor. Figuur 4A toont de resultaten van een representatief experiment waarbij de sterkte van de aanhechting van HEK-293-cellen aan schalen met een coating van verschillende doses PEI wordt getest. De celtellingen werden genormaliseerd naar de waarde verkregen voor de behandeling met 25 μg/ml PEI, die op 100,0% werd gesteld. Uit de resultaten blijkt dat concentraties van PEI van 2,5 μg/ml of hoger resulteerden in maximale aanhechtingsverbetering, wat suggereert dat het oppervlak van de plastic schaal bij deze concentraties volledig met het polymeer is gecoat. De hogere concentraties van het polymeer leken geen toxische effecten op de cellen te hebben als de in de oplossing achtergebleven overmaat aan PEI grondig werd verwijderd (lichte toxische effecten werden waargenomen bij de concentratie van 250 μg/ml als de oplossing na de behandeling niet volledig werd verwijderd). Het getoonde experiment is representatief voor 4 onafhankelijke experimenten. Figuur 4B geeft de resultaten weer die zijn verkregen met verschillende aantallen PC-12- en HEK-293-cellen. De figuur toont relatieve celtellingen, waarbij een arbitraire waarde van 100,0% werd toegekend aan de gemiddelde telling verkregen uit de met PEI behandelde putjes met het hoogste aantal van elke cellijn (3,2 × 105 HEK-293 cellen en 1,5 × 106 PC-12 cellen). Uit de resultaten blijkt dat PEI goed werkte als hechtingsfactor over een breed spectrum van celaantallen voor zowel PC-12- als HEK-293-cellen. Lagere celaantallen konden niet op betrouwbare wijze worden getest omdat zij dicht bij de gevoeligheidsgrens van de neutraalroodtest lagen. De getoonde resultaten zijn representatief voor ten minste 4 onafhankelijke experimenten uitgevoerd met elke cellijn. Figuur 4C toont de resultaten van een experiment dat is uitgevoerd om de stabiliteit van PEI als hechtingsfactor te testen. In dit experiment werd een set platen behandeld met PEI en vervolgens 10 dagen in PBS bij 4°C bewaard. In een tweede test werden platen met PEI behandeld en (met medium) 3 dagen in de 37°C CO2 incubator gehouden, waarbij het medium om de 24 uur werd ververst. De prestaties van PEI in deze platen werden vervolgens vergeleken met platen die met PEI waren behandeld volgens het standaardprotocol dat voor eerdere experimenten was beschreven. De resultaten tonen relatieve celtellingen genormaliseerd naar het gemiddelde van de extincties verkregen met de standaard PEI-behandelde platen, waaraan de arbitraire waarde van 100,0% werd toegekend. De resultaten geven aan dat de PEI-coating stabiel blijft op het oppervlak van de plastic schaal gedurende ten minste 10 dagen van koeling, en dat deze niet wordt verwijderd door incubatie bij 37°C in medium of zelfs door herhaalde mediumwisselingen. De resultaten zijn representatief voor 4 onafhankelijke experimenten die in drievoud zijn uitgevoerd.
Karakterisering van de eigenschappen van PEI als hechtingsfactor. Grafiek A: Toenemende doses PEI werden getest om het concentratiebereik voor optimale coating te bepalen. PEI liet een volledige verbetering van de hechting zien bij concentraties van 2,5 μg/ml en hoger. Grafiek B: PEI bevorderde de aanhechting van zowel PC-12 als HEK-293 cellen over een breed bereik van celaantallen (geteste aantallen zijn aangegeven op de X-as). Grafiek C: PEI coating bleef stabiel op de cultuur schotel oppervlak over lange incubatieperiode en medium veranderingen (10d-PBS: PEI-behandelde schotel gedurende 10 dagen geïncubeerd in PBS bij 4°C; 96 h-3MC: PEI-behandelde schotel gedurende 96 uur geïncubeerd met 3 mediumwisselingen bij 37°C). Voor alle grafieken, de balken tonen het gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige assays, die representatief zijn voor ten minste 3 onafhankelijke experimenten (* aanzienlijk hoger dan onbehandelde controle, p < 0,01).
PEI voorbehandeling verbetert lipofection van zwak verankerende cellen
Transfectie van eukaryote cellen door lipofection omvat verschillende stappen, media toevoegingen en vervangingen, die een tol kan eisen in zwak verankerende cellen. Zelfs als zorg wordt betracht om celverliezen te voorkomen, kunnen de zwak verankerde cellen minder efficiënt zijn in de opname van de transfectiecomplexen. Aangezien PEI voorbehandeling van celkweekschalen de sterkte van de gehechtheid van cellen aan dergelijke oppervlakken verhoogd, werd de hypothese dat de gehechtheidsfactor een positief effect op de transfectie opbrengsten verkregen door lipofection hebben kan. De drie hierboven beschreven cellijnen werden gebruikt om deze hypothese te testen met behulp van de coating middelen eerder onderzocht. Transfecties werden uitgevoerd met een plasmide dat codeert voor het reporterenzym β-galactosidase. Het transfectierendement werd gecontroleerd door bepaling van de activiteit van het reporterenzym in de lysaten van de getransfecteerde cellen. Ten minste twee onafhankelijke assays in drievoud werden uitgevoerd met elke cellijn. Representatieve plots worden getoond in figuur 5. De opbrengsten (β-galactosidase activiteiten) werden genormaliseerd naar de activiteit verkregen met PEI pre-coating, die werd ingesteld als een referentie op 100,0%. In het algemeen werd waargenomen dat de transfectie opbrengsten werden verbeterd in de zwak verankerende cellen door de pre-coating met middelen die celhechting aan de plaat te bevorderen. In het geval van PC-12-cellen, pre-coating van putten met PEI, collageen of PDL resulteerde in een 2- tot 3-voudige verbetering van de transfectie opbrengst ten opzichte van de onbehandelde putten: relatieve opbrengsten van 100,0% ± 1,4% voor PEI, 87,0% ± 8,7% voor collageen, en 100,1% ± 2,4% voor PDL, versus 42,9% ± 2,2% voor de onbehandelde putten (Figuur 5A). De verbetering van de transfectie opbrengst door PEI voorbehandeling was meer uitgesproken voor HEK-293 cellen. Het experiment in figuur 5B toont een relatieve activiteit van 21,1% ± 3,4% voor de cellen in de onbehandelde putten, in vergelijking met 100,0% ± 8,4% voor de PEI-behandelde putten (ongeveer 5-voudige toename). Voorbehandeling met collageen of PDL resulteerde in meer bescheiden inducties (ongeveer 2- tot 3-voudig in figuur 5B). De laagste verbetering werd waargenomen met collageen, vergelijkbaar met de lagere verbetering van de gehechtheid van HEK-293 cellen die eerder werd waargenomen in figuur 3B. Tot slot, voor de sterk hechten MYS fibroblasten, was er geen significant positief effect waargenomen door het gebruik van gehechtheid factoren in de transfectie procedure. Variaties waren meestal minder dan 20% voor alle experimentele omstandigheden. De representatieve experiment getoond in figuur 5C in feite toont een iets hogere transfectie opbrengst voor de onbehandelde putten dan voor de PEI-behandelde platen (relatieve activiteit van 117,7% ± 3,2% voor de onbehandelde putten versus 100,0% ± 4.8% voor de met PEI voorbehandelde putten, oftewel een ongeveer 1,2-voudig hogere transfectieopbrengst bij de controle).
PEI verbetert de transfectie van zwak verankerende cellen. Transfectie opbrengsten werden bepaald door β-galactosidase assays en genormaliseerd naar de opbrengsten verkregen met PEI coating van de cultuur schotel (waaraan een arbitraire waarde van 100,0% toegewezen). PEI en andere bevestigingsfactoren verbeterde de transfectie van los hechtende cellijnen zoals PC-12 cellen (grafiek A) en HEK-293 cellen (grafiek B). Er werd geen significant effect waargenomen bij goed hechtende cellen zoals MYS-fibroblasten (grafiek C). De balken geven het gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige assays, die representatief zijn voor ten minste twee onafhankelijke experimenten (* significant hoger dan onbehandelde controle, p < 0,01).
Compilatie van de resultaten van alle uitgevoerde experimenten, de gemiddelde vouw-inductie (± standaardafwijking) waargenomen in de transfectie opbrengst van PC-12 cellen verankerd aan PEI in vergelijking met cellen op onbehandelde putten was 2.4-voudig (± 0,1 voudig; n = 3), terwijl de verbetering met HEK-293 cellen was 6,3-voudig (± 0,5 voudig; n = 2). t-test statistische analyse geeft aan dat beide verhogingen significant zijn (p < 0,05). Geen significante transfectie verbetering werd waargenomen in de experimenten met MYS cellen, met een gemiddelde vouw-verandering van 1,0-voudige (± 0,3-voud; n = 2) door de voorbehandeling met PEI (in principe identiek aan de opbrengst zonder behandeling).