De coronavirusziekte 2019 (COVID-19) is een infectieziekte die een wereldwijde pandemie heeft veroorzaakt met meer dan 36 miljoen besmette mensen uit ongeveer 200 landen of grondgebieden, met tot op heden meer dan 1 miljoen sterfgevallen (Wereldgezondheidsorganisatie (WHO), 2020). De veroorzaker van COVID-19, het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), wordt verondersteld afkomstig te zijn van vleermuizen, aangezien het door vleermuizen overgedragen coronavirus RaTG13 tot op heden de genetische verwantschap het dichtst benadert (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Verscheidene soorten zijn bestudeerd om hun potentiële rol als tussengastheer te bepalen (Shi et al., 2020). Bovendien worden diermodellen om een COVID-19-achtige ziekte te recapituleren beschouwd als een belangrijke onderzoekslijn en vereist voor de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen en profylactische verbindingen.
Naast verschillende modelleringsstudies die potentiële diersoorten voorstellen die vatbaar zijn voor SARS-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), hebben meerdere experimentele infecties al een breed scala aan vatbare dieren aangetoond. Met name Egyptische fruitvleermuis, fret, gouden Syrische hamster, kat, muizen die gehumaniseerd angiotensine-converting enzyme 2 (ACE2) tot expressie brengen, BALB/c-muizen (die een gemuteerd SARS-CoV-2 gebruiken door verscheidene celkweekpassages) en sommige niet-menselijke primatensoorten zijn permissief voor virale infectie, waarbij zich een subklinische tot milde tot matige respiratoire ziekte ontwikkelt (Bao et al, 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Vanuit experimenteel oogpunt is de vatbaarheid van honden voor SARS-CoV-2 beperkt, aangezien geïnoculeerde dieren gedeeltelijk kunnen seroconverteren (Shi et al., 2020). De intranasale inoculatie van kip, eend en varken resulteerde daarentegen in geen enkel bewijs van infectie (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Varken worden vaak gebruikt in onderzoek vanwege de overeenkomsten met de mens in termen van anatomie, genetica, fysiologie en, ook, immunologie. Experimenten met varkens zijn immers waarschijnlijk voorspellender voor therapeutische en preventieve behandelingen bij de mens dan experimenten met knaagdieren (Meurens et al., 2012). Aangezien varkens echter niet vatbaar zijn voor SARS-CoV-2-infectie wanneer ze intranasaal worden geïnoculeerd (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), verdient de mogelijkheid om een varkensinfectiemodel met dit virus te ontwikkelen met behulp van andere mogelijke inoculatieroutes, onderzoek. De belangrijkste rationale om varkens te testen is dat de ACE2-receptor van deze soort functioneel is, hetzij door transfectie van varkens ACE2 in HeLa-cellen (die niet constitutief het menselijke ACE2 tot expressie brengen) (Zhou et al., 2020), hetzij dat pseudopartikels met het S-eiwit van SARS-CoV-2 in staat zijn om varkensniercellen te infecteren (Letko et al., 2020). Bovendien komt het ACE2-eiwit tot expressie in alle belangrijke weefsels van varkens, zoals vastgesteld door immunohistochemie (Xiao et al., 2020). Bijgevolg, om een vermoedelijk COVID-19 varkensmodel op te zetten, onderzochten wij het effect van verschillende natuurlijke en niet-natuurlijke routes van SARS-CoV-2 inoculatie bij tamme varkens (Sus scrofa domesticus).
Voor dit doel werden vier groepen van vijf 5- tot 6-weken oude conventionele biggen (Landrace × Large White) geselecteerd en geïnoculeerd door middel van verschillende routes: intranasaal (IN, 1,5 ml/nostril; totaal volume van 3 ml), intratracheaal (IT, 3 ml) zoals eerder beschreven (Garcia-Morante et al, 2016), intramusculair (IM, 1 ml in elke kant van de nekspieren; totaal volume 2 ml) of intraveneus (IV, 2 ml), met een einddosis van 105,8 weefselkweekinfectieuze dosis (TCID50) van het SARS-CoV-2 isolaat (GISAID ID EPI_ISL_510689) per elk dier. De IT- en IV-groepen werden vóór de inoculatie verdoofd met 10 mg/kg ketamine en 0,8 mg/kg xylazine. Een passage-2 SARS-CoV-2 werd gekweekt en getitreerd in Vero E6-cellen (ATCC CRL-1586), volgens hetzelfde protocol als voor andere coronavirussen (Rodon et al., 2019). Twee extra varkens werden gebruikt als negatieve controles.
Alle dieren waren seropositief tegen porcien respiratoir coronavirus, zoals bepaald door een commerciële ELISA (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Rekening houdend met het feit dat er geen antilichaam kruisreactiviteit tussen alfa- en bèta-coronavirussen is beschreven (Okba et al., 2020), werden de dieren in de studie gehouden. Initiële reactiviteit tegen PRCV werd verwacht aangezien dit virus alomtegenwoordig is in de Europese varkensstapel (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Welfare Committee van het Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) en door de Ethical Commission of Animal Experimentation van de Autonome Regering van Catalonië en uitgevoerd door gecertificeerd personeel. Experimenten met SARS-CoV-2 werden uitgevoerd in de Bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) faciliteiten van de Biocontainment Unit van IRTA-CReSA (Barcelona, Spanje).
Op 2 en 22 dagen post-inoculatie (dpi), werden twee en drie dieren/groep (IT, IM en IV), respectievelijk, geëuthanaseerd. Aangezien reeds was aangetoond dat IN-inoculatie geen SARS-CoV-2-infectie veroorzaakt (Shi et al., 2020), werden de op deze wijze geïnoculeerde varkens op dag 1 en 2 pi geëuthanaseerd om het bewijs van een mogelijke voorbijgaande vroege infectie in weefsels te beoordelen. Negatieve controledieren werden voor het begin van het experiment geëuthanaseerd. Monsters werden verzameld en verwerkt zoals eerder beschreven (Vergara-Alert et al., 2017). Kort gezegd werden bij alle dieren volledige necropsies uitgevoerd. Verschillende weefsels (frontale, mediale en caudale turbinaten; proximale, mediale en distale trachea; grote en kleine bronchus, linker craniale, mediodorsale en caudale longgebieden; nieren; lever; hart; en milt) werden genomen, gefixeerd door onderdompeling in 10% neutraal gebufferde formaline, ingebed in paraffine en op 3 µm doorsneden om dia’s te bereiden. Histologieglaasjes werden gekleurd met hematoxyline en eosine (HE) om mogelijke microscopische letsels te beoordelen. Bovendien werden dezelfde weefsels plus ileum, cervicale lymfeklier (LN), mediastinale LN, mesenteriale LN, bulbus olfactorius, tonsil, zwezerik, parotide speekselklier, bijnier, pancreas, hersenstam, oogleden en beenmerg ook genomen in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) in buisjes met korrels om SARS-CoV-2 upE-gen detectie door RT-qPCR uit te voeren (Corman et al., 2020). Neus- en rectumswabs werden ook genomen (dagelijks gedurende de eerste week en op 14 en 22 dpi) om ze te analyseren op de aanwezigheid van viraal RNA door middel van de hierboven genoemde RT-qPCR. Serummonsters verzameld op dagen 0, 14 en 22 pi werden getest op de aanwezigheid van antilichamen tegen SARS-CoV-2 spike S1 + S2 en nucleocapsid (N) proteïnen door middel van in-house ELISA’s (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Ook werd een virusneutralisatietest uitgevoerd volgens een eerder protocol met een kleine wijziging (Rodon et al., 2020), de seriële verdunningen van sera en SARS-CoV-2 werden gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd vóór de uitvoering van de plaattest.
Alle dieren werden dagelijks gecontroleerd, maar geen van hen vertoonde klinische symptomen na SARS-CoV-2 inoculatie. Ook werden geen bruto of microscopische laesies die toe te schrijven waren aan SARS-CoV-2 infectie gevonden bij een van de onderzochte dieren van alle inoculatiegroepen alsook bij de controlegroepen (gegevens niet getoond).
Geen van de varkens had nasale of rectale uitscheiding van viraal RNA. Proximale trachea van één IN-geïnoculeerd dier was positief bij 1 dpi voor viraal RNA (Cq = 24,36). De overige weefsels van dit dier en de rest van de varkens waren negatief voor RT-qPCR (qPCR-detectiegrens van 38,6 cycli).
Tegen 14 en 22 dpi konden lage niveaus van antilichamen gericht tegen het Spike-eiwit worden gedetecteerd bij alle dieren uit de IM- en IV-groepen (figuur 1a). Bovendien vertoonden deze varkens ook neutraliserende antilichaamtiters op 22 dpi (variërend van 74 tot 317 SNT50 reciproke verdunningstiter) (figuur 1b). Ook werden lage antilichaamspiegels gericht tegen het N-eiwit gevonden bij één van de drie IM en alle IV geïnoculeerde dieren tegen het einde van het experiment (gegevens niet weergegeven). Belangrijk is dat één enkel dier uit de IT-groep geen antilichamen tegen het S-eiwit vertoonde, maar wel antilichamen tegen het N-eiwit en neutraliserende titers (SNT50 reciproke verdunningstiter van 29) op dag 0 pi, wat zou kunnen wijzen op een mogelijke kruisreactie met een ander coronavirus dat varkens infecteert. Deze antilichamen tegen het N-eiwit namen af tegen de tijd dat het experiment werd beëindigd, wat suggereert dat ze van maternale oorsprong waren. Bovendien vertoonde dit dier geen seroneutraliserende antilichamen op de 22 dpi (Figuur 1b).
De huidige gegevens tonen aan dat SARS-CoV-2 niet in staat was varkens te besmetten via één van de geteste routes, namelijk IN, IT, IM en IV. Daarom bevestigen onze inspanningen eerdere experimenten die wijzen op een gebrek aan vatbaarheid van infectie door het varken (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), hoewel het kan worden gebruikt voor het beoordelen van de immunogeniciteit van de komende kandidaat-vaccins.
Belangrijk is dat de huidige studie verder gaat dan andere studies met SARS-CoV-2 en varkens, aangezien we een breder aantal inoculatieroutes hebben getest. Geen daarvan resulteerde echter in een productieve infectie bij biggen. Een belangrijk resultaat van deze studie was het bewijs van seroconversie tegen het Spike-glycoproteïne op dag 14 en 22 pi en de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen op dag 22 pi bij varkens die langs parenterale weg (IM en IV) werden geïnoculeerd. Gezien de korte duur van het experiment (22 dagen), onderstreept deze seroconversie het potentiële belang van het varken voor gebruik in immunogeniciteitsstudies voor SARS-CoV-2. In feite wordt het belang van het varken als geschikt diermodel voor immunologie, alsook voor fysiologie, farmacologie en chirurgie, van toepassing op de menselijke geneeskunde, algemeen erkend (Rothkötter, 2009).
Concluderend bevestigt de huidige studie dat biggen geen geschikt diermodel zijn voor COVID-19, maar het potentiële nut ervan als een model voor immunogeniciteit in preklinische studies voor de ontwikkeling van vaccins verdient verder onderzoek.