Omdat nauwkeurige eiwitkwantitering essentieel is voor alle experimenten met betrekking tot eiwitonderzoek, zijn er verschillende methoden ontwikkeld om de concentratie van eiwitten in een bepaalde assay te meten. Enkele van de meer traditionele methoden van totale eiwitkwantificatie omvatten de meting van UV-absorptie bij 280 nm (A280), Bicinchoninezuur (BCA) en Bradford-tests, en andere alternatieve methoden zoals Lowry en andere nieuwe assays.
Omdat eiwitten licht absorberen bij een specifieke golflengte, kan de meting worden verkregen met behulp van een spectrofotometer. Met name de aminozuren tyrosine en tryptofaan hebben een zeer specifieke absorptie bij 280 nm, waardoor een directe A280 meting van de eiwitconcentratie mogelijk is.
UV-absorptie bij 280 nm wordt routinematig gebruikt om de eiwitconcentratie in laboratoria te schatten, vanwege de eenvoud, het gebruiksgemak en de betaalbaarheid. Metingen zijn snel en zeer reproduceerbaar omdat er geen incubatie nodig is. Bovendien vereist deze methode ook een uiterst klein monstervolume aangezien moderne spectrofotometers een monsterretentiesysteem gebruiken tijdens de meting.
Echter moet ervoor worden gezorgd dat het eiwitmonster geen niet-eiwitcomponenten (b.v. nucleïnezuren) bevat met hetzelfde absorptiespectrum aangezien dit tot foutieve resultaten kan leiden. Naast het bepalen van eiwitconcentraties kunnen absorptiewaarden ook worden gebruikt bij het detecteren van conformatieveranderingen en ligandbinding en voor het volgen van enzymreacties.
Het effect van tryptofaan en tyrosine in eiwitkwantificering
Door de aanwezigheid van tyrosine en tryptofaan absorberen eiwitten en peptiden die deze aromatische aminozuren bevatten UV-licht bij een golflengte van 280 nm. Elk van deze residuen heeft afzonderlijke absorptie- en emissiegolflengten en varieert in kwantumrendement. Fenylalanine en disulfidebindingen dragen ook bij tot de absorptie bij deze golflengte, maar aangezien deze relatief onbeduidend is, kan zij alleen worden waargenomen bij afwezigheid van zowel tryptofaan als tyrosine.
Veel enzymatische cofactoren die aromatische ringstructuren bevatten (b.v. FMN, FAD, NAD en porfyrines) absorberen ook UV-licht voor excitatie en dragen derhalve bij tot de intensiteit van de resulterende fluorescentie. Speciale proteïnen zoals Groen Fluorescerend Eiwit hebben ook een interne serinetyrosine-glycine sequentie die post-translationeel wordt gemodificeerd en fluorescerend is in het zichtbare lichtgebied.
Tryptofaan
Tryptofaan is aanzienlijk fluorescenter dan tyrosine en fenylalanine. Zijn fluorescente eigenschappen zijn echter oplosmiddelafhankelijk, d.w.z. het spectrum verschuift naar kortere golflengten en neemt in intensiteit toe naarmate de polariteit van het oplosmiddel afneemt. Als zodanig vertonen tryptofaanresiduen, begraven in hydrofobe domeinen van gevouwen eiwitten, een spectrale verschuiving van 10 tot 20 nm.
Door zijn grotere absorptiviteit, hogere quantumopbrengst, en resonantie-energieoverdracht, lijkt het fluorescentiespectrum van een eiwit dat de drie aminozuren bevat, gewoonlijk op dat van tryptofaan.
Tyrosine
Tyrosine kan worden geëxciteerd bij golflengten die vergelijkbaar zijn met die van tryptofaan, maar zal uitzenden bij een duidelijk andere golflengte. Hoewel het waar is dat tyrosine minder fluorescent is dan tryptofaan, kan het een belangrijk signaal geven omdat het vaak in grote aantallen aanwezig is in veel eiwitten. Tyrosine fluorescentie is waargenomen te worden gedoofd door de aanwezigheid van nabijgelegen tryptofaan moieties hetzij door resonantie-energie-overdracht of de ionisatie van de aromatische hydroxylgroep.
Hier zijn enkele belangrijke punten om te onthouden bij het meten van peptiden met behulp van de A280 methode.
- Eiwitten van gelijk molecuulgewicht kunnen verschillende extinctiewaarden hebben door het verschil in tryptofaan- en tyrosinegehalte.
- UV-absorptie wordt ook beïnvloed door de eiwitstructuur. Zo kunnen omstandigheden die de structuur beïnvloeden (zoals temperatuur, pH, ionensterkte, of de aanwezigheid van detergenten) het vermogen van aromatische residuen beïnvloeden om licht te absorberen bij 280 nm, en de waarde van de extinctiecoëfficiënt van het eiwit veranderen.
- De lokale omgeving van de aromatische aminozuren kan een effect hebben op hun spectra. Dit betekent dat tryptofaan een emissiepiek zal hebben bij lagere golflengten wanneer het begraven is in de hydrofobe binnengebieden van een proteïne, terwijl tyrosine vaak zijn energie zal overdragen aan aangrenzende tryptofaan-aminozuren. Geïoniseerd tyrosinaat, dat ontstaat wanneer protonen van tyrosine verloren gaan als gevolg van een toenemende pH, zal golflengten vertonen die vergelijkbaar zijn met die van tryptofaan.