Koronawirusowa choroba 2019 (COVID-19) jest chorobą zakaźną, która spowodowała globalną pandemię z ponad 36 milionami zakażonych osób z około 200 krajów lub terytoriów, z ponad 1 milionem zgonów do dnia dzisiejszego (Światowa Organizacja Zdrowia (WHO), 2020). Zakłada się, że czynnik wywołujący COVID-19, koronawirus 2 zespołu ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2), pochodzi od nietoperzy, ponieważ koronawirus RaTG13 przenoszony przez nietoperze jest jak dotąd najbliższym genetycznym krewnym (Andersen i in., 2020; Zhou i in., 2020). Kilka gatunków zostało przebadanych w celu określenia ich potencjalnej roli jako żywicieli pośrednich (Shi i in., 2020). Ponadto, modele zwierzęce do odtworzenia choroby podobnej do COVID-19 są uważane za główny kierunek badań i wymagane do opracowania leków terapeutycznych i związków profilaktycznych.
Poza kilkoma badaniami modelowania, w których zaproponowano potencjalne gatunki zwierząt podatne na SARS-CoV-2 (Damas i in., 2020; Qiu i in., 2020; Veljkovic i in., 2020), liczne zakażenia doświadczalne wykazały już szeroki zakres podatnych zwierząt. W szczególności egipski nietoperz owocożerny, fretka, złoty chomik syryjski, kot, myszy z ekspresją humanizowanego enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2), myszy BALB/c (wykorzystujące zmutowany SARS-CoV-2 w kilku pasażach hodowli komórkowej) i niektóre gatunki zwierząt naczelnych są podatne na zakażenie wirusem, rozwijając się od subklinicznej do łagodnej lub umiarkowanej choroby układu oddechowego (Bao i in., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Z eksperymentalnego punktu widzenia, wrażliwość psów na SARS-CoV-2 jest ograniczona, ponieważ zaszczepione zwierzęta mogą częściowo ulec serokonwersji (Shi i in., 2020). W przeciwieństwie do tego, inokulacja donosowa kurczaka, kaczki i świni nie skutkowała żadnymi dowodami zakażenia (Schlottau i in., 2020; Shi i in., 2020).
Świnia jest powszechnie wykorzystywana w badaniach z powodu podobieństw istniejących z ludźmi w zakresie anatomii, genetyki, fizjologii, a także immunologii. Rzeczywiście, eksperymenty na świniach mogą być bardziej przewidywalne dla terapeutycznych i zapobiegawczych zabiegów u ludzi niż eksperymenty na gryzoniach (Meurens i in., 2012). Jednakże, ponieważ świnie nie są podatne na zakażenie SARS-CoV-2 w przypadku inokulacji donosowej (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), możliwość opracowania modelu zakażenia świń tym wirusem przy użyciu innych potencjalnych dróg inokulacji zasługuje na zbadanie. Główną przesłanką do badania świń jest fakt, że receptor ACE2 tego gatunku jest funkcjonalny albo poprzez transfekcję świńskiego ACE2 w komórkach HeLa (które nie wykazują konstytutywnej ekspresji ludzkiego ACE2) (Zhou i in., 2020), albo że pseudocząsteczki z białkiem S SARS-CoV-2 są zdolne do infekowania komórek nerek świń (Letko i in., 2020). Ponadto, białko ACE2 ulega ekspresji we wszystkich głównych tkankach świń, jak oceniono metodą immunohistochemiczną (Xiao i in., 2020). W konsekwencji, w celu stworzenia przypuszczalnego modelu COVID-19 u świń, zbadaliśmy wpływ różnych naturalnych i nienaturalnych dróg inokulacji SARS-CoV-2 u świń domowych (Sus scrofa domesticus).
W tym celu wybrano cztery grupy pięciu 5- do 6-tygodniowych konwencjonalnych prosiąt (Landrace × Large White) i zaszczepiono je różnymi drogami: donosowo (IN, 1,5 ml/nostril; całkowita objętość 3 ml), wewnątrztchawiczo (IT, 3 ml), jak wcześniej opisano (Garcia-Morante i in, 2016), domięśniowo (IM, 1 ml w każdą stronę mięśni szyi; całkowita objętość 2 ml) lub dożylnie (IV, 2 ml), z końcową dawką 105,8 dawki zakaźnej hodowli tkankowej (TCID50) izolatu SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_510689) na każde zwierzę. Grupy IT i IV zostały znieczulone 10 mg/kg ketaminy i 0,8 mg/kg ksylazyny przed inokulacją. Pasaż-2 SARS-CoV-2 namnażano i miareczkowano w komórkach Vero E6 (ATCC CRL-1586), zgodnie z tym samym protokołem, co w przypadku innych koronawirusów (Rodon et al., 2019). Dwie dodatkowe świnie były używane jako kontrole negatywne.
Wszystkie zwierzęta były seropozytywne przeciwko koronawirusowi oddechowemu świń, jak określono za pomocą komercyjnego testu ELISA (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Biorąc pod uwagę, że nie opisano krzyżowej reaktywności przeciwciał pomiędzy alfa- i beta-koronawirusami (Okba et al., 2020), zwierzęta zostały zatrzymane do badania. Oczekiwano początkowej reaktywności przeciwko PRCV, ponieważ wirus ten jest wszechobecny w europejskim inwentarzu świń (Saif i in., 2012; Vidal i in., 2019).
Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Welfare Committee of the Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) oraz przez Komisję Etyczną Doświadczeń na Zwierzętach Autonomicznego Rządu Katalonii i przeprowadzone przez certyfikowany personel. Eksperymenty z SARS-CoV-2 przeprowadzano w pomieszczeniach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3) jednostki kontroli biologicznej IRTA-CReSA (Barcelona, Hiszpania).
W 2 i 22 dniu po inokulacji (dpi), dwa i trzy zwierzęta/grupę (IT, IM i IV), odpowiednio, poddano eutanazji. Ponieważ inokulacja IN została już wykazana jako nieskuteczna do wywołania infekcji SARS-CoV-2 (Shi et al., 2020), świnie inokulowane tą drogą poddano eutanazji w dniach 1 i 2 pi w celu oceny dowodów możliwej przemijającej wczesnej infekcji w tkankach. Zwierzęta kontroli ujemnej zostały poddane eutanazji przed rozpoczęciem doświadczenia. Próbki pobierano i przetwarzano zgodnie z wcześniejszym opisem (Vergara-Alert i in., 2017). Krótko mówiąc, kompletne nekropsje przeprowadzono u wszystkich zwierząt. Pobrano kilka tkanek (przednie, przyśrodkowe i ogonowe turbinaty; proksymalną, przyśrodkową i dystalną tchawicę; duże i małe oskrzela, lewe czaszkowe, przyśrodkowe i ogonowe obszary płuc; nerki; wątrobę; serce; i śledzionę), utrwalono przez zanurzenie w 10% obojętnie zbuforowanej formalinie, zatopiono w parafinie i wykonano sekcję o grubości 3 µm w celu przygotowania szkiełek. Szkiełka histologiczne barwiono hematoksyliną i eozyną (HE) w celu oceny ewentualnych zmian mikroskopowych. Poza tym, te same tkanki oraz jelito kręte, węzeł chłonny szyjny (LN), węzeł chłonny śródpiersia (LN), węzeł chłonny krezkowy, opuszka węchowa, migdałek, grasica, ślinianka przyuszna, nadnercza, trzustka, pień mózgu, powieki i szpik kostny były również pobierane w pożywce Dulbecco’s modified Eagle (DMEM) w probówkach z kulkami w celu przeprowadzenia detekcji genu SARS-CoV-2 upE metodą RT-qPCR (Corman i in., 2020). Pobrano również wymazy z nosa i odbytnicy (codziennie w pierwszym tygodniu oraz w 14 i 22 dpi) w celu ich analizy na obecność wirusowego RNA za pomocą wspomnianego wyżej RT-qPCR. Próbki surowicy pobrane w dniach 0, 14 i 22 pi badano na obecność przeciwciał przeciwko białkom krętka S1 + S2 i nukleokapsydu (N) wirusa SARS-CoV-2 za pomocą własnych testów ELISA (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Przeprowadzono również test neutralizacji wirusa zgodnie z poprzednim protokołem z niewielką modyfikacją (Rodon et al., 2020), seryjne rozcieńczenia surowic i SARS-CoV-2 były inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze 37°C przed wykonaniem testu płytkowego.
Wszystkie zwierzęta były codziennie monitorowane, ale żadne z nich nie wykazywało objawów klinicznych po inokulacji SARS-CoV-2. Również u żadnego z badanych zwierząt ze wszystkich grup inokulacyjnych, jak również kontrolnych, nie stwierdzono żadnych zmian brutto lub mikroskopowych, które można by przypisać infekcji SARS-CoV-2 (dane nie pokazane).
Żadna ze świń nie miała nosowego lub odbytniczego rozsiewu wirusowego RNA. Proksymalna tchawica od jednego zaszczepionego zwierzęcia IN była pozytywna w 1 dpi dla wirusowego RNA (Cq = 24.36). Pozostałe tkanki od tego zwierzęcia i pozostałych świń dały wynik negatywny dla RT-qPCR (granica wykrywalności qPCR 38,6 cykli).
W 14 i 22 dpi, niskie poziomy przeciwciał skierowanych przeciwko białku Spike można było wykryć u wszystkich zwierząt z grup IM i IV (Figura 1a). Ponadto, świnie te wykazywały również neutralizujące miana przeciwciał w 22 dpi (wahające się od 74 do 317 miana SNT50 we wzajemnym rozcieńczeniu) (Figura 1b). Ponadto, niski poziom przeciwciał skierowanych przeciwko białku N stwierdzono u jednego z trzech zaszczepionych zwierząt IM i u wszystkich zaszczepionych dożylnie do końca doświadczenia (dane nie pokazane). Co ważne, jedno zwierzę z grupy IT nie wykazało przeciwciał przeciwko białku S, ale miało przeciwciała przeciwko białku N, jak również miano neutralizujące (miano rozcieńczenia wzajemnego SNT50 równe 29) w dniu 0 pi, co może sugerować potencjalną reakcję krzyżową z innym koronawirusem zakażającym świnie. Należy zauważyć, że te przeciwciała przeciwko białku N zmniejszyły się do czasu zakończenia eksperymentu, co sugeruje, że były one pochodzenia matczynego. Ponadto, to zwierzę nie wykazało przeciwciał seroneutralizujących w 22 dpi (Figura 1b).
Prezentowane dane wskazują, że SARS-CoV-2 nie był w stanie zainfekować świń żadną z badanych dróg, a mianowicie IN, IT, IM i IV. Dlatego nasze wysiłki potwierdzają wcześniejsze eksperymenty wskazujące na brak podatności na zakażenie przez świnię (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), chociaż może być wykorzystany do oceny immunogenności nadchodzących kandydatów na szczepionki.
Co ważne, obecne badanie wykracza poza inne badania z SARS-CoV-2 i świniami, ponieważ przetestowaliśmy szerszą liczbę dróg inokulacji. Jednakże, żadna z nich nie spowodowała produktywnej infekcji u prosiąt. Istotnym wynikiem tego badania było wykazanie serokonwersji przeciwko glikoproteinie Spike w dniach 14 i 22 pi oraz obecności przeciwciał neutralizujących w dniu 22 pi u świń zaszczepionych drogą parenteralną (IM i IV). Biorąc pod uwagę krótki czas trwania eksperymentu (22 dni), taka serokonwersja podkreśla potencjalne zainteresowanie świni do wykorzystania w badaniach immunogenności dla SARS-CoV-2. W rzeczywistości, zainteresowanie świnią jako odpowiednim modelem zwierzęcym dla immunologii, jak również fizjologii, farmakologii i chirurgii, mających zastosowanie w medycynie ludzkiej jest powszechnie uznawane (Rothkötter, 2009).
W podsumowaniu, obecne badanie potwierdza, że prosięta nie są odpowiednim modelem zwierzęcym dla COVID-19, ale ich potencjalna przydatność jako model immunogenności w badaniach przedklinicznych nad rozwojem szczepionki zasługuje na dalsze badania.
.