4-1BB/4-1BBL Interaction Promotes Obesity-Induced Adipose Inflammation by Triggering Bidirectional Inflammatory Signaling in Adipocytes/Macrophages

Abstract

Zapalenie tkanki tłuszczowej wywołane otyłością charakteryzuje się rekrutacją makrofagów do tkanki tłuszczowej i uwalnianiem cytokin zapalnych. 4-1BB, receptor kostymulacyjny, moduluje procesy zapalne poprzez interakcję z ligandem 4-1BBL na powierzchniach komórek odpornościowych. W niniejszej pracy badano, czy interakcja 4-1BB/4-1BBL pomiędzy adipocytami i makrofagami bierze udział w indukowanym otyłością zapaleniu tkanki tłuszczowej. Stwierdzono, że 4-1BB ulega ekspresji na adipocytach i jest zwiększona przez czynniki związane z otyłością, co również zwiększa ekspresję 4-1BBL na makrofagach. Agoniści 4-1BB i/lub 4-1BBL, odpowiednio, aktywowali zapalne cząsteczki sygnalizacyjne (MAPK/IκBα i MAPK/Akt) w adipocytach i makrofagach oraz zwiększali uwalnianie cytokin zapalnych (MCP-1, TNF-α i IL-6). Co więcej, przerwanie interakcji 4-1BB/4-1BBL zmniejszało uwalnianie cytokin zapalnych z kontaktowo hodowanych adipocytów/makrofagów. Wyniki te wskazują, że dwukierunkowa sygnalizacja 4-1BB/4-1BBL w adipocytach/makrofagach promuje zapalenie tkanki tłuszczowej. 4-1BB i 4-1BBL mogą być użytecznymi celami dla ochrony przed wywołanym otyłością zapaleniem tkanki tłuszczowej.

1. Introduction

Obesity-induced inflammation is considered to be a potential cause of metabolic disorders such as insulin resistance, type 2 diabetes, and cardiovascular diseases . Tkanka tłuszczowa aktywnie uczestniczy w zapaleniu indukowanym otyłością poprzez rekrutację makrofagów i limfocytów T oraz uwalnianie cytokin zapalnych (białko chemotaktyczne monocytów-1, MCP-1; czynnik martwicy nowotworów alfa, TNF-α; interleukina-6, IL-6), które modulują różnicowanie adipocytów, metabolizm oraz lokalne/systemowe odpowiedzi zapalne, powodując niepożądane zaburzenia równowagi metabolicznej. Co ciekawe, ostatnie badania wykazały, że bezpośredni kontakt kokultury adipocytów i makrofagów skutkuje znacznie zwiększonym uwalnianiem cytokin zapalnych, wskazując, że interakcja między cząsteczkami powierzchni komórkowej tych komórek jest ważna dla promowania ich odpowiedzi zapalnej.

4-1BB (znany również jako CD137 i TNFRSF9) jest klasycznym przykładem cząsteczki kostymulującej i dobrze znanym receptorem zapalnym, który jest wyrażany przez aktywowane komórki T w miejscach zapalenia. Stymulacja 4-1BB na limfocytach T prowadzi do ekspansji komórek, produkcji cytokin i rozwoju cytolitycznych funkcji efektorowych. Ligand 4-1BB (4-1BBL, znany również jako CD137L i TNFSF9) jest w wysokim stopniu wyrażany przez większość komórek immunologicznych i wiele nieimmunologicznych i może odbierać i przekazywać sygnały zwrotne do komórek takich jak makrofagi. Gromadzące się dowody wskazują, że dwukierunkowe interakcje na powierzchni komórki 4-1BB/4-1BBL w komórkach układu odpornościowego są krytyczne w inicjowaniu i modulowaniu różnych odpowiedzi zapalnych (np. reumatoidalne zapalenie stawów, autoimmunologiczne zapalenie mięśnia sercowego i nowotwory układu krwiotwórczego). Co więcej, interakcje 4-1BB/4-1BBL zachodzą również pomiędzy komórkami immunologicznymi i nieimmunologicznymi, ponownie wpływając na reakcje zapalne. Na przykład, interakcja pomiędzy 4-1BB i 4-1BBL na komórkach śródbłonka i makrofagach jest zaangażowana w zapalenie naczyń krwionośnych, a interakcja pomiędzy tymi dwoma cząsteczkami na komórkach nabłonka i komórkach naturalnych zabójców jest zaangażowana w uszkodzenie niedokrwienia-reperfuzji nerek. Wcześniej wykazaliśmy, że ekspresja 4-1BB i 4-1BBL była zwiększona w tkance tłuszczowej, która uległa zapaleniu z powodu otyłości, oraz że ablacja 4-1BB zmniejszyła zapalenie tkanki tłuszczowej. W związku z tym wysunęliśmy hipotezę, że interakcja między 4-1BB i 4-1BBL na komórkach tłuszczowych i komórkach odpornościowych, takich jak makrofagi, odgrywa rolę w zapaleniu tkanki tłuszczowej w otyłości.

W niniejszym opracowaniu po raz pierwszy wykazujemy, że 4-1BB ulega ekspresji na adipocytach i jest pobudzany przez czynniki związane z otyłością, a także wykazujemy, że dwukierunkowa sygnalizacja 4-1BB/4-1BBL w adipocytach/makrofagach odgrywa kluczową rolę w inicjowaniu i promowaniu kaskady zapalnej w tkance tłuszczowej wywołanej otyłością.

2. Materiały i metody

2.1. Zwierzęta

Myszy C57BL/6 (samce, w wieku 8 tygodni) (Orient Ltd., Busan, Korea) karmiono dietą wysokotłuszczową (HFD, 60% kalorii z tłuszczu (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); myszy otyłe) lub dietą niskotłuszczową (LFD; 10% kalorii z tłuszczu (Research Diets); myszy nieotyłe) przez 9 tygodni. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet etyczny ds. zwierząt Uniwersytetu w Ulsan i były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health.

2.2. Przeciwciała

Nagie myszy zagruntowano prystanem i wstrzyknięto dootrzewnowo subklonowaną hybrydomę wytwarzającą agonistyczne przeciwciało monoklonalne (Ab) przeciwko 4-1BB (3E1), aby wywołać tworzenie się wodobrzusza. Monoklonalne Ab zostało oczyszczone z płynu z wodobrzusza przez chromatografię kolumnową powinowactwa z białkiem G-Sepharose (Sigma-Aldrich). Rekombinowany 4-1BB Fc (r4-1BB Fc) został zakupiony od Adipogen (Seul, Korea). Antagonistyczne monoklonalne Ab przeciwko 4-1BBL (TKS-1) zostało zakupione od e-Bioscience (San Diego, CA, USA). Szczurzą immunoglobulinę G (Rat IgG) i ludzką IgG1 zakupiono w firmie Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) i wykorzystano jako kontrolę.

2.3. Cell Cultures and Treatments

Murzyńska linia komórkowa makrofagów Raw264.7 została uzyskana z Korean Cell Line Bank (KCLB40071, Seul, Korea). Ta linia komórkowa była utrzymywana w RPMI1640 (Gibco BRL, NY, USA) zawierającym 10% (vol/vol) FBS (płodowa surowica bydlęca) (Gibco BRL, NY, USA) i inkubowana w temperaturze 37 ° C w nawilżonym 5% CO2. Preadipocyty 3T3-L1 były utrzymywane w DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) o wysokiej zawartości glukozy (Gibco BRL, NY, USA) zawierającym 10% FBS. Konfluentne preadipocyty 3T3-L1 (dzień 0) inkubowano w DMEM zawierającym 10 μg/mL insuliny (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (deksametazon, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (3-izobutylo-1-metyloksantyna, Sigma-Aldrich) i 10% FBS przez 2 dni. W skrócie, komórki 3T3-L1 były różnicowane do dojrzałych adipocytów przez inkubację w DMEM z 10% FBS i 5 μg/mL insuliny przez 2 dni. Dojrzałe adipocyty były utrzymywane w tym medium, a medium hodowlane było wymieniane na świeże co 2 dni. Wolny kwas tłuszczowy (FFA, mieszanina kwasu palmitynowego, Sigma-Aldrich) rozpuszczono w etanolu zawierającym surowiczą albuminę bydlęcą (BSA, 25 μM) i sprzężono z BSA w stosunku molowym 10 : 1 przed użyciem. Adipocyty 3T3-L1 (3 × 105 komórek/basenik) lub makrofagi Raw264.7 (3 × 105 komórek/basenik) na płytkach 24-dołkowych poddano działaniu czynników związanych z otyłością (kwas palmitynowy : pal, lipopolisacharyd : LPS) odpowiednio przez 24 h lub 4 h. Aby pobudzić 4-1BB na adipocytach, adipocyty 3T3-L1 na płytkach 24-dołkowych inkubowano z agonistyczną 4-1BB Ab (3E1, 1 μg/mL) lub szczurzą IgG przez 48 h w pożywce bez surowicy. W celu unieruchomienia r4-1BB Fc lub ludzkiej IgG1 na płytkach hodowlanych, r4-1BB Fc lub ludzką IgG1 inkubowano na płytkach 24-dołkowych w temperaturze 37°C przez 1 h w inkubatorze CO2, a dołki przepłukiwano buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS). Następnie płytki inkubowano z RPMI (10% FBS) w temperaturze 37°C przez 1 h w inkubatorze CO2, a studzienki płukano PBS. Makrofagi Raw264.7 inkubowano w ilości 5 × 105 komórek/studzienkę w 24-studzienkowych płytkach płaskodennych wstępnie pokrytych 100 ng/mL r4-1BB Fc lub ludzką IgG1 przez 24 h.

2.4. Isolation of Stromal Vascular Cells from Adipose Tissue

W celu wyizolowania frakcji zrębu naczyniowego (SVF) tkanki tłuszczowej, najądrza myszy C57BL/6 (samce, 8 tygodni) zostały rozdrobnione i trawione przez 30 minut w temperaturze 37°C kolagenazą typu 2 (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) w DMEM (pH 7,4). Powstałe zawiesiny odwirowywano przy 500 g przez 5 minut. Osad ponownie zawieszano w buforze do lizy erytrocytów, zawiesiny inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie odwirowywano przy 500 g przez 5 minut. Po płukaniu w DMEM, zawiesiny przepuszczano przez sterylne siatki nylonowe 100 μm (SPL Lifescience, Pocheon, Korea). Przesączone komórki przenoszono do szalek o powierzchni 100 mm2 zawierających DMEM uzupełniony o 10% FBS i 0,4% Fungizone i utrzymywano w inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% CO2. Pozwolono komórkom przylgnąć, a pływające komórki usuwano przez aspirację i codziennie uzupełniano podłoże hodowlane. Komórki SVF były zbierane po 2 dniach. Komórki SVF były umieszczane w liczbie 5 × 105 komórek/basenik na płytkach 24-dołkowych. Konfluentne preadipocyty pochodzące z SVF różnicowano w adipocyty przez traktowanie DMEM zawierającym 10 μg/mL insuliny (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (Sigma-Aldrich) i 10% FBS przez 2 dni. Dojrzałe adipocyty utrzymywano w podłożu hodowlanym, które wymieniano na świeże co 2 dni. Aby wykryć ekspresję 4-1BB i 4-1BBL na adipocytach pochodzących z SVF narażonych na czynniki otyłości, komórki te inkubowano z kwasem palmitynowym 250 μM, LPS 100 ng/mL przez 24 h.

2.5. Izolacja makrofagów otrzewnowych

Myszy C57BL/6 (samce, 8 tygodni życia) wstrzykiwano dootrzewnowo 3 ml 3% bulionu tioglikolowego (Difco, Detroit, MI, USA) na 4 dni przed uśmierceniem. Makrofagi otrzewnowe zbierano przez odwirowanie w podłożu MEM (Minimum Essential Medium, Gibco), a otrzymany osad płukano i ponownie zawieszano w podłożu hodowlanym MEM z 10% FBS. Makrofagi otrzewnowe oczyszczano przez przyleganie do płytek hodowli tkankowej przez 2 godziny. Aby wykryć ekspresję 4-1BB i 4-1BBL na makrofagach otrzewnowych narażonych na czynniki otyłości, komórki te inkubowano z kwasem palmitynowym 250 μM, LPS 100 ng/mL przez 4 h.

2.6. Coculture of Adipocytes and Macrophages

3T3-L1 adipocyty były hodowane i różnicowane przez 6 dni. Kokulturę adipocytów i makrofagów prowadzono dwiema metodami: kokulturą w kontakcie bezpośrednim i kokulturą transwelacyjną. W systemie bezpośredniego kontaktu makrofagi Raw264.7 (3 × 105 komórek: 50% makrofagów, 3 × 104 komórek: 10% makrofagów) lub makrofagi otrzewnowe (3 × 105 komórek) umieszczano na płytkach 24-dołkowych zawierających adipocyty 3T3-L1 (3 × 105 komórek). Komórki hodowano przez 24 h w kontakcie ze sobą i zbierano. Jako kontrola, adipocyty i makrofagi były również hodowane oddzielnie, z liczbą komórek na studzienkę równą liczbie komórek w systemie kontaktowym i wymieszane po zbiorze. W systemie trans-dołkowym komórki były hodowane w kokulturze przy użyciu wkładek trans-dołkowych z porowatą membraną 0,4 μm (Corning, NY, USA) w celu oddzielenia adipocytów (3 × 105 komórek, dolna studzienka) od makrofagów (3 × 105 komórek, górna studzienka). Po inkubacji przez 4 h, 8 h i 12 h zbierano supernatanty.

2.7. Pomiar poziomów cytokin

Poziomy cytokin w supernatantach hodowli mierzono przy użyciu testów immunosorbcyjnych łączonych enzymem (ELISA). Testy przeprowadzono przy użyciu zestawu OptEIA mysiego TNFα, mysiego MCP-1 (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) oraz zestawu mysiej IL-6 i adiponektyny (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), a także zestawu IL-10 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Wartości poziomów cytokin uzyskano z krzywych standardowych przy użyciu programu do dopasowywania krzywych SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

2.8. Ilościowy Real-Time PCR (qRT-PCR)

Totalne RNA wyekstrahowane z komórek hodowlanych poddano odwrotnej transkrypcji w celu wygenerowania cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy M-MLV (Promega, Madison, WI, USA). Amplifikację cDNA metodą Real-time PCR przeprowadzono w dwóch powtórzeniach przy użyciu zestawu SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) z użyciem Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Japonia). Wszystkie reakcje przeprowadzono według tej samej procedury: wstępna denaturacja w 95°C przez 10 s, a następnie 45 cykli w 95°C przez 5 s i 60°C przez 30 s. Wszystkie wartości dla interesujących nas genów znormalizowano do wartości dla genów housekeeping (36B4 dla adipocytów; β-aktyna dla makrofagów i kokultur). Sekwencje użytych starterów mysich przedstawiono w Tabeli 1.

Dane analizowano przy użyciu oprogramowania Thermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.). Względne krzywe standardowe zostały wygenerowane poprzez wykreślenie wartości progu cyklu (Ct). Na podstawie wartości Ct uzyskanych z każdej próbki obliczono względne ilości genów docelowych, używając krzywych standardowych z oprogramowaniem dostarczonym przez Takara Thermal Cycler Dice Real Time System.

2.9. Separation of Adipocytes and Macrophages

Kokulowane adipocyty 3T3-L1 i makrofagi Raw264.7 w równej liczbie (jak opisano wcześniej) rozdzielono zgodnie z protokołem producenta, używając systemu CD11b MicroBeads (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA). Krótko mówiąc, zbierano komórki ko-kultury, przemywano je dwukrotnie buforem (PBS uzupełnionym 2 mM EDTA i 0,5% surowiczą albuminą bydlęcą-BSA) i inkubowano z mikroperełkami CD11b przez 15 min w 4°C. Wypłukane i ponownie zawieszone komórki nanoszono na kolumnę MACS, która zatrzymywała komórki CD11b+ i przepuszczała komórki ujemne (adipocyty). Kolumna została następnie usunięta z separatora i umieszczona na odpowiedniej probówce zbierającej. Odpowiednie ilości buforu kolumnowego były nanoszone pipetą na kolumnę w celu wypłukania komórek pozytywnych (makrofagów) przy użyciu tłoka dostarczonego wraz z kolumną. W wyniku zastosowania tej metody otrzymano 90% do 95% czystych komórek CD11b+, jak oceniono za pomocą cytometrii przepływowej.

2.10. Analiza cytometrii przepływowej (FACS)

3T3-L1 adipocyty i Raw264.7 makrofagi poddane działaniu czynników związanych z otyłością (jak opisano wcześniej) delikatnie trypsynizowano, przemyto dwukrotnie w PBS i inkubowano z przeciwciałami blokującymi receptory Fcγ (24G2) przez 10 minut na lodzie, a następnie barwiono fikoerytryną (PE) sprzężoną z anty-4-1BB (eBioscience, San Diego, CA, USA), anty-4-1BBL (eBioscience) lub anty-kozem (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) i anty-CD11b (eBioscience) jako kontrolą w celu określenia bramy dla adipocytów/makrofagów. Następnie komórki przemywano buforem FACS i analizowano na aparacie FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) z oprogramowaniem CellQuest (BD Biosciences). Liczba na wykresach wskazuje procent komórek pozytywnych.

2.11. Analiza Western Blot

Adipocyty 3T3-L1 umieszczano w liczbie 1 × 106 komórek/basenik na płytkach 6-dołkowych i inkubowano z 3E1 (1 μg/mL) lub szczurzą IgG przez 3 h. Makrofagi raw264.7 umieszczano w liczbie 1 × 106 komórek/basenik na płytkach 6-dołkowych pokrytych r4-1BB Fc lub ludzką IgG przez 1 h. Adipocyty poddane działaniu 3E1 i makrofagi poddane działaniu r4-1BB Fc płukano PBS, ponownie zawieszano przez zeskrobanie w buforze do lizy (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5% deoksycholan, 1% IGEPAL i koktajl inhibitorów proteazy) i odwirowywano przy 3000 rpm przez 5 minut. Próbki zawierające 10-30 μg białka całkowitego poddawano analizie western blot z użyciem przeciwciał poliklonalnych przeciwko fosforylowanej IKK (I kappa B kinase alpha/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), całkowitej IKKβ, p-p38 MAPK (mitogen-activated-protein kinase), p-JNK (c-Jun amino-terminal kinase), całkowitej JNK, p-Akt (protein kinase B; Ser473), całkowity Akt (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), i IκBα (inhibitor czynnika jądrowego-κB alfa; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), i β-aktyna (Sigma).

2.12. Statistical Analysis

Results are presented as means ± SEM of three independent performed in duplicate. Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu Studenta lub ANOVA z testem wielokrotnych zakresów Duncana. Różnice uznawano za istotne przy poziomie .

3. Wyniki

3.1. Ekspresja 4-1BB i 4-1BBL w adipocytach/makrofagach i tkance tłuszczowej

Początkowo zmierzyliśmy ekspresję 4-1BB podczas adipogenezy na poziomie mRNA za pomocą qRT-PCR. Stwierdziliśmy, że poziomy transkryptów 4-1BB były większe w adipocytach pochodzących z SVF po zróżnicowaniu (Figura 1(a)). Co ważne, substancje związane z otyłością, takie jak kwas palmitynowy i LPS, znacząco zwiększały poziom transkryptów 4-1BB w adipocytach pochodzących z SVF i transkryptów 4-1BBL w makrofagach otrzewnowych (Figura 1(b)). Wzrost transkryptów został potwierdzony w adipocytach 3T3-L1 i/lub makrofagach Raw264.7 (Figura 1(c)). Analiza FACS wykazała również, że białko 4-1BB na adipocytach 3T3-L1 i białko 4-1BBL na makrofagach Raw264.7 (Figura 1(d)) były zwiększone przez te czynniki związane z otyłością. Ponadto, transkrypty 4-1BB i 4-1BBL wzrosły w kokulturowych adipocytach/makrofagach (Figura 1(e)), jak również w najądrzowej tkance tłuszczowej otyłych myszy karmionych HFD (Figura 1(f)).

3.2. Release of Inflammatory Cytokines and Activation of Inflammatory Signaling Molecules by 4-1BB and 4-1BBL Stimulation in Adipocytes and Macrophages, Respectively

Aby zbadać, czy 4-1BB na adipocytach lub 4-1BBL na makrofagach dostarczają sygnału zapalnego, potraktowaliśmy każdy typ komórek agonistami, którzy specyficznie stymulują te cząsteczki; Adipocyty 3T3-L1 były traktowane agonistycznym przeciwciałem 4-1BB (3E1) przez 48 h, a makrofagi Raw264.7 makrofagi z r4-1BB-Fc przez 24 h, a następnie zmierzyliśmy poziomy cytokin zapalnych w odpowiednich komórkach. Zarówno stymulacja adipocytów 4-1BB, jak i makrofagów 4-1BBL wyraźnie zwiększała produkcję cytokin prozapalnych, takich jak MCP-1, TNF-α i IL-6 na poziomie mRNA (ryc. 2(a) i 2(c)) oraz białka (ryc. 2(b) i 2(d)). Wydzielanie adiponektyny z adipocytów nie było zmienione przez stymulację 4-1BB (dane nie pokazane). Stymulacja makrofagów 4-1BBL zmniejszyła transkrypty IL-10 (Figura 2(c)), ale nie zaobserwowano zmian w uwalnianiu białka IL-10 (Figura 2(d)).

Rycina 2

4-.Stymulacja 1BB lub 4-1BBL zwiększa uwalnianie różnych cytokin zapalnych z adipocytów lub makrofagów. Adipocyty 3T3-L1 i makrofagi Raw264.7 traktowano odpowiednio 1 μg/mL 3E1 i 100 ng/mL r4-1BB Fc przez 48-24 h. Transkrypty i białka MCP-1, TNF-α, IL-6 i IL-10 były następnie mierzone w adipocytach 3T3-L1 (a-b) i makrofagach Raw264.7 (c-d). Fosforylację IKKα/β (p-IKKα/β)/IKKβ, IκBα, p-p38, p-JNK/JNK, pAkt/Akt i β-aktynę mierzono metodą western blotting. Adipocyty 3T3-L1 inkubowano z 1μg/mL 3E1 przez 3 h (e), a makrofagi Raw264.7 z 100 ng/mL r4-1BB Fc przez 1 h (f). Wyniki densytometrii przedstawiono jako procent kontroli. Dane są średnią ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w duplikacie. ; ; ; (w porównaniu z kontrolą).

Aby zrozumieć mechanizmy molekularne, za pomocą których 4-1BB i / lub 4-1BBL aktywują sygnalizację zapalną w adipocytach i / lub makrofagach, zbadaliśmy wpływ stymulacji 4-1BB/4-1BBL na wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnalizacyjne. Stymulacja 4-1BB na adipocytach zwiększała fosforylację p38 MAPK i JNK, jak również fosforylację IKK, cząsteczki upstream NF-κB, i indukowała degradację IκBα (Figura 2(e)), podczas gdy stymulacja 4-1BBL zwiększała fosforylację Akt i p38 MAPK oraz JNK (Figura 2(f)), ale nie miała wpływu na degradację białka IκBα (Figura 2(f)) i fosforylację IKK (dane nie pokazane). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, sygnalizacja 4-1BBL nie tylko aktywowała p38 MAPK, ale także indukowała aktywację Akt w makrofagach, prowadząc do zwiększonej ekspresji cytokin zapalnych.

3.3. Release of Inflammatory Cytokines in a Contact Coculture System

Because 4-1BB/4-1BBL stimulation enhanced the release of inflammatory cytokines from adipocytes and/or macrophages, respectively, we investigated whether cell-cell interaction via surface molecules, presumably 4-1BB/4-1BBL, has a role in initiating and triggering inflammatory responses. Najpierw hodowaliśmy adipocyty 3T3-L1 i makrofagi Raw264.7 w systemie bezpośredniego kontaktu i stwierdziliśmy, że produkcja cytokin zapalnych IL-6, MCP-1 i TNF-α była skorelowana z liczbą makrofagów w hodowli (ryc. 3(a)-3(c)) i wzrastała z czasem (ryc. 3(d)-3(f)).

3.4. Effect of Disruption of the Interaction between 4-1BB and 4-1BBL on Release of Inflammatory Cytokines in a Contact Coculture System

Aby sprawdzić, czy interakcja 4-1BB/4-1BBL pomiędzy adipocytami i makrofagami bierze udział w odpowiedzi zapalnej w kontaktowej kokulturze adipocytów 3T3-L1 i makrofagów Raw264.7, zablokowaliśmy interakcję przy użyciu przeciwciała neutralizującego (TKS-1). Neutralizujące przeciwciało monoklonalne reaguje swoiście z mysim 4-1BBL, przez co 4-1BBL nie może wiązać się z receptorem 4-1BB i może przerwać interakcję między 4-1BBL i 4-1BB. Stąd, zarówno sygnał 4-1BB-mediowany w adipocytach, jak i sygnał 4-1BBL-mediowany w makrofagach może być stłumiony przez leczenie TKS-1. Stwierdziliśmy, że leczenie TKS-1 znacznie zmniejszyło poziomy IL-6, MCP-1 i TNF-α mRNA w kontaktowych kokulturowych adipocytach/makrofagach (Figura 4(a)). Zmniejszenie ekspresji tych cytokin zapalnych zostało potwierdzone na poziomie białka (Figura 4(b)). Ponadto stwierdziliśmy również, że przerwanie interakcji między 4-1BB i 4-1BBL zmniejszyło uwalnianie cytokin zapalnych z makrofagów otrzewnowych hodowanych z adipocytami (Figura 4(c)). Aby zbadać względny udział sygnalizacji 4-1BB i 4-1BB w ekspresji genów zapalnych w kokulturowanych adipocytach/makrofagach, oddzieliliśmy makrofagi od adipocytów i zmierzyliśmy poziomy transkryptów cytokin zapalnych w dwóch typach komórek (Figura 4(d)). Przeciwciało neutralizujące znacząco zmniejszyło wzrost poziomów IL-6, MCP-1 i TNF-α mRNA zarówno w adipocytach, jak i w makrofagach (rysunki 4(e) i 4(f)).

4. Dyskusja

Zapalenie tkanki tłuszczowej wywołane otyłością charakteryzuje się rekrutacją makrofagów do tkanki tłuszczowej, a makrofagi są ważnym źródłem odpowiedzi zapalnej. Kontakt komórka-komórka między adipocytami i makrofagami jest uważany za ważny dla wyzwalania szlaków zapalnych w tkance tłuszczowej, chociaż nie jest jasne, które cząsteczki są zaangażowane. Ostatnie badania wykazały, że zaangażowanie receptora ko-stymulacyjnego 4-1BB z jego ligandem 4-1BBL poprzez kontakt komórka-komórka moduluje różne odpowiedzi zapalne. W poprzednich pracach stwierdziliśmy, że niedobór 4-1BB zmniejsza zapalenie tkanki tłuszczowej poprzez zmniejszenie rekrutacji makrofagów i uwalniania cytokin zapalnych. Na podstawie tych wyników wysunęliśmy hipotezę, że 4-1BB/4-1BBL-mediowana interakcja komórka-komórka między komórkami tłuszczowymi a makrofagami może być istotna w rozpoczęciu i / lub utrzymaniu zapalenia tkanki tłuszczowej indukowanego otyłością. Co ciekawe, transkrypty 4-1BB w adipocytach i 4-1BBL w makrofagach były znacznie podwyższone przez czynniki związane z otyłością (np. FFA i LPS), a ich ekspresja była również silnie zwiększona w kontaktowych kokulturach adipocytów/makrofagów. Co więcej, wzrostowi ekspresji tych cząsteczek towarzyszyło zwiększone uwalnianie cytokin zapalnych z komórek. Te odkrycia wraz z podwyższoną regulacją w otyłej tkance tłuszczowej i zmniejszeniem zapalenia tkanki tłuszczowej u myszy otyłych pozbawionych 4-1BB sugerują, że 4-1BB i 4-1BBL uczestniczą w zapoczątkowaniu i/lub promowaniu odpowiedzi zapalnej indukowanej przez adipocyty/makrofagi.

Aby sprawdzić, czy 4-1BB na adipocytach lub 4-1BBL na makrofagach był odpowiedzialny za sygnały zapalne, które wywołały odpowiedzi zapalne, stymulowaliśmy komórki agonistami, którzy wiążą się specyficznie z 4-1BB lub 4-1BBL. Stwierdzili¶my, po raz pierwszy, że stymulacja 4-1BBL na adipocytach znacznie zwiększyła uwalnianie cytokin zapalnych MCP-1, TNF-α i IL-6. Stymulacja odwrotnej sygnalizacji 4-1BBL, która jest znana z aktywacji makrofagów, również zwiększyła poziom cytokin zapalnych. Ostatnie dowody wskazują, że sygnalizacja 4-1BB prowadzi do aktywacji szlaku MAPK/NF-κB, który jest zależny od czynnika związanego z receptorem TNF (TRAF)-2 w limfocytach. W adipocytach stwierdzono, że stymulacja 4-1BB aktywuje p38 MAPK, JNK, IKK i indukuje degradację białka IκBα. Z drugiej strony, stymulacja 4-1BBL prowadziła do aktywacji zapalnych cząsteczek sygnalizacyjnych, takich jak Akt i p38 MAPK w makrofagach, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami. Co ważniejsze, stwierdziliśmy, że leczenie przeciwciałem neutralizującym 4-1BBL zmniejszyło uwalnianie cytokin zapalnych w kokulturach zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Te odkrycia łącznie sugerują, że interakcja 4-1BB/4-1BBL-mediowana między adipocytami i makrofagami wyzwala dwukierunkową sygnalizację zapalną i jest silnym induktorem odpowiedzi zapalnej w otyłej tkance tłuszczowej (Figura 5).

Rycina 5

Schematyczne przedstawienie dwukierunkowej transdukcji sygnału indukowanej przez 4-1BB/4-1BBL-mediowaną interakcję między adipocytami i makrofagami. Uwalnianie cytokin zapalnych (MCP-1, TNF-α i IL-6) w odpowiedzi na dwukierunkow± sygnalizację wydaje się uczestniczyć w zapaleniu tkanki tłuszczowej.

Co ciekawe, przerwanie interakcji 4-1BB/4-1BBL nie spowodowało całkowitego zahamowania uwalniania cytokin zapalnych z kokulturowanych adipocytów i makrofagów. Może to być spowodowane obecnością innych cząsteczek powierzchni komórek, które uczestniczą w interakcjach komórka-komórka i pośredniczą w odpowiedzi zapalnej. Istotnie, adipocyty i makrofagi wykazują na swoich powierzchniach ekspresję wielu receptorów i ligandów zapalnych. Na przykład, CD40 i mediator wejścia wirusa opryszczki (HVEM), które są wyrażane na adipocytach, są uważane za mediatory zależnej od kontaktu sygnalizacji makrofagów, a ablacja tych receptorów zmniejsza indukowane otyłością odpowiedzi zapalne. Tak więc można sobie wyobrazić, że inne receptory i ligandy oprócz 4-1BB i 4-1BBL są również zaangażowane w interakcję między adipocytami i makrofagami, która prowadzi do inicjacji i utrzymania odpowiedzi zapalnej.

W podsumowaniu wykazaliśmy po raz pierwszy, że zależna od kontaktu interakcja między adipocytami i makrofagami mediowana przez 4-1BB i 4-1BBL, która generuje dwukierunkowe sygnały, odgrywa kluczową rolę w uwalnianiu cytokin zapalnych tkanki tłuszczowej z tych komórek. 4-1BB i 4-1BBL, wraz z innymi cząsteczkami zaangażowanymi w interakcję komórka-komórka między adipocytami i makrofagami, mogą być cennymi celami w zapobieganiu indukowanemu otyłością zapaleniu tkanki tłuszczowej.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez program badawczy Midcareer poprzez National Research Foundation (NRF) Grant KOSEF (2009-0079485), finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (MEST), oraz program Science Research Center (Center for Food & Nutritional Genomics) Grant (2012-0000643) NRF Korei, finansowany przez MEST.

.