A RNA producing DNA hydrogel as a platform for a high performance RNA interference system

Synteza i charakterystyka I-gel

Cztery oligonukleotydy X-DNA (X01-X04 DNA strands) zostały komercyjnie zsyntetyzowane przez Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). Sekwencje X-DNA (Tabela uzupełniająca 5) zostały zaprojektowane, przygotowane i scharakteryzowane zgodnie z procedurami opisanymi w literaturze z niewielkimi modyfikacjami10,13. Liofilizowane nici DNA w skali 1 μmol zebrano przez wirowanie przy 14,000 g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Każda nić DNA była ponownie zawieszana do stężenia 1,0 mM w 1x buforze TE (pH 8,0). Każda probówka była wytrząsana i mieszana przy użyciu MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) przy 1500 rpm przez ~3 h w celu całkowitego rozpuszczenia liofilizowanych oligonukleotydów. W sumie 0,05 μmol (50 μl) każdej nici DNA łączono w probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie dodawano wodę wolną od nukleaz, zwiększając całkowitą objętość mieszaniny oligonukleotydów do 500 μl. 100 μl mieszaniny oligonukleotydów rozdzielono do probówek o pojemności 0,5 ml. Probówki umieszczano w termocyklerze (Bio-Rad, CA, USA). Cztery rodzaje oligonukleotydów (X01 ~04) annektowano w następujących warunkach: wstępna denaturacja w 95 °C przez 10 min; oraz 65 °C przez 2 min, 60 °C przez 5,5 min, obniżenie o 1 °C utrzymując 1 min w tej temperaturze, 20 °C przez 30 s, oraz obniżenie do 4 °C w celu stabilizacji i przechowywania X-DNA. Następnie, w celu wymiany buforu, wyżarzony roztwór X-DNA (500 μl) w filtrze (3-kDa Mw cutoff) do mikrowirowania wirowano przez 6 h przy 15 000 g i 4 °C w celu zmniejszenia objętości rozpuszczalnika. Zespół filtracyjny przenoszono do świeżej probówki wirówkowej. W sumie do filtra dodano 100 μl wody pozbawionej nukleazy o temperaturze 4 °C. Jednostka filtracyjna była wirowana przez 4 h przy 15 000 g i 4 °C w celu wypłukania X-DNA z pozostałych soli. Odcięty moduł filtrujący należy umieścić w probówce do góry dnem i odwirowywać przy 2000 g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Dodanie wody wolnej od nukleaz oraz wirowanie przeprowadzono jeszcze dwukrotnie przy użyciu tej samej probówki wirowniczej w celu całkowitego usunięcia pozostałości soli z X-DNA. Końcowa objętość roztworu X-DNA będzie wynosić ~300 μl. Plazmid ekspresji siRNA (I-plasmid) został zakupiony i maksymalnie przygotowany przez Cosmo Genetech (Seul, Korea Południowa). Aby skonstruować I-plazmidy, były one linearyzowane przy użyciu enzymu restrykcyjnego BamHI. Wielkość genu siRNA wynosiła 66 bp z odstępem (lub 498 bp z promotorem T7) (patrz Rysunek 4 w celu zapoznania się z mapą plazmidu I). Ilości DNA w próbkach zostały określone na podstawie ich wartości absorpcji UV/Vis przy użyciu BioSpektrometru (Eppendorf, Hamburg, Niemcy). X-DNA i liniowe plazmidy były najpierw mieszane we wcześniej określonym stosunku molowym w obecności ligazy T4 DNA (Promega, Madison, WI, USA) w celu syntezy Dgel. Dla stosunku X-DNA:I-plazmid 1500:1, użyliśmy 10.5 μL 75 μM X-DNA i 5.25 μL 100 nM plazmidu w 30 μL objętości reakcyjnej. Do eksperymentu Blank-gel taką samą ilość materiału X-DNA jak w I-gelu ligowano ligazą T4 DNA. 10 µL każdej próbki mieszano z 2 µL buforu ładującego żel i poddawano elektroforezie na 0,7 lub 2% żelu agarozowym przy napięciu 100 V przez 60 min. Wszystkie DNA (X-DNA, I-plazmid, Blank-gel i I-gel) potwierdzono metodą elektroforezy na żelu agarozowym (ryc. 3, 11, 18). Zsyntetyzowane żele D były dwukrotnie odsalane przy użyciu mikrotubularnych filtrów wirówkowych Amicon 3-kDa Mw cutoff. Do obrazowania w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) próbki liofilizowano w liofilizatorze FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) do momentu usunięcia całej wody. Wysuszone próbki pękały, aby odsłonić ich świeże powierzchnie. Po napyleniu warstwą Pt o grubości 2~ 3-nm przez 100 s, morfologie tych hydrożelowych powierzchni obserwowano przy powiększeniu ~50 000× za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego S-3500N (Hitachi, Tokio, Japonia) przy napięciu przyspieszającym 15 kV (Supplementary Figure 19).

Test stabilności I-żelu

Siedem próbek przygotowano dla każdego wolnego I-plazmidu i I-żelu. W każdej próbce 2 µL wolnego I-plazmidu (57 ng) lub I-żelu (żel 1:1500 zawierający 57 ng I-plazmidu) rozcieńczano w 12 µL wody destylowanej, następnie dodawano 4 µL zoptymalizowanego buforu 5 × transkrypcyjnego i traktowano 3,33 × 10-5 jednostkami DNazy I (nr M6101; Promega) do 20 µL końcowej objętości, po czym inkubowano w temperaturze 37 °C odpowiednio przez 0, 1, 4, 12, 24 i 48 h. Po inkubacji próbki o objętości 20 µL rozdzielano na dwie 10 µL podwielokrotności, jedną do elektroforezy, a drugą do następującej po niej transkrypcji. W każdej z podwielokrotności kończono reakcję denaturacji przez dodanie 1 µl roztworu zatrzymującego DNazę RQ1 i inkubację przez 10 min w temp. 65 °C. Następnie 10 µL każdej próbki mieszano z 2 µL buforu do ładowania żelu i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym przy napięciu 100 V przez 60 min (Supplementary Figure 13). Kolejną porcję każdej próbki wykorzystano do reakcji transkrypcji w celu wykazania wydajności transkrypcji I-gel po reakcji trawienia. shRNA transkrybowano z szablonów I-gel lub wolnego plazmidu I (0, 24, 48 h) przy użyciu zestawu transkrypcyjnego (Riboprobe; Promega) zgodnie z instrukcją producenta. Uzyskane shRNA oznaczano ilościowo metodą RT-qPCR zgodnie z opisem w sekcjach Przygotowanie całkowitego RNA i odwrotna transkrypcja oraz Real-time PCR i analiza danych (Tabela uzupełniająca 4).

Analiza ekspresji i inhibicji białek

Zestawy do sprzężonej transkrypcji i translacji (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, nr katalogowy 88882) zakupiono w firmie Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), a reakcje przeprowadzono zgodnie z procedurami sugerowanymi przez producenta. W skrócie, lizat komórek HeLa, białka pomocnicze, mieszaninę reakcyjną i plazmid pcDNA3.1( + ) IRES GFP (0,5 μg/μL; nr 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) mieszano w roztworze 12,5:2.5:5:2 (v/v) i inkubowano w temperaturze 30 °C przez 1, 2, 4 i 6 h. Po podanych czasach reakcji roztwory próbek inkubowano przez 24 h w temperaturze 4 °C, aby zarówno zatrzymać reakcję, jak i zapewnić wystarczający czas składania białka. Aby ocenić wydajność interferencji, wolny I-plazmid lub I-żel dodawano do lizatu komórkowego w obecności 1000 ng plazmidu GFP. W eksperymentach kontrolnych dla zoptymalizowanych warunków I-gel zawierających 57 ng I-plazmidu (17,5 nmol), scrambled shRNA (17,5 nmol i 1,75 μmol; odpowiednio 1 eq i 100 eq do ilości I-plazmidu) (SN-1003; Bioneer, Seul, Korea), mieszaninę scrambled plazmidu (17.5 nmol; scrambled shRNA expression plasmid mixture; Cosmo Genetech), scrambled plasmid gel (scrambled plasmid mixture enzymatycznie usieciowany z X-DNA), składnik I-gel (tylko X-DNA, tylko I-plasmid, lub te mieszaniny bez enzymatycznego usieciowania; to jest bez tworzenia żelu), lub Blank-gel (enzymatyczne usieciowanie tylko X-DNA) dodawano bezpośrednio do roztworu reakcyjnego ekspresji GFP. Wszystkie reakcje przeprowadzono co najmniej trzykrotnie. Jeśli nie podano inaczej, objętość reakcji utrzymywano na poziomie 25 μL. Widma fluorescencji analizowano przy użyciu spektrofluorofotometru (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd.; Seul, Korea) w celu określenia poziomu fluorescencji, Seul, Korea) w celu określenia poziomu ekspresji GFP w roztworze lizatu komórkowego.

Przygotowanie całkowitego RNA i odwrotna transkrypcja

Jako kontrolę spike-in, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL; nr 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Kanada) dodano do wszystkich lizatów komórek poddanych wstępnej ekspresji (20 µL) przed ekstrakcją RNA. Następnie z 23 µL lizatu ekstrahowano całkowite RNA przy użyciu TRIzol Reagent (Ambion, Thermo Fisher Scientific) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowane całkowite RNA rozpuszczano w 10 µl wody nasyconej DEPC (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Następnie 2 µL całkowitego RNA poddawano poliadenylacji przy użyciu 1 mM ATP w 1 × buforze polimerazy poli(A) zawierającym 5 U polimerazy poli(A) Escherichia coli (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) w temperaturze 37 °C przez 30 min w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20 µL. W celu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji, 4 µL ogoniastego RNA mieszano z 1 pmol startera RT i 0,5 mM mieszaniny dNTP, a następnie uzupełniano do objętości 13 µL wodą nasyconą DEPC. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie szybko schładzano na lodzie. Następnie mieszaninę reakcyjną uzupełniano do końcowej objętości 20 µL przez dodanie 5 mM ditiothreitolu, 1 × buforu pierwszej nici, 40 U inhibitora RNaz i 200 U SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i inkubowano w temperaturze 50 °C przez 1 h, po czym inaktywowano enzym w temperaturze 70 °C przez 15 min. Sekwencje primerów RT (patrz Tabela 5) zostały zaprojektowane do syntezy cDNA z sekwencji RNA. Zastosowano starter z adapterem 3′ RACE, który jest dostarczany w zestawie FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Wszystkie primery zostały zsyntetyzowane przez firmę Cosmo Genetech, z wyjątkiem forward primera cel-miR-39 (Norgen Biotek Corp.). Stopień odzysku RNA w każdym roztworze lizatu oszacowano na podstawie różnicy między wartością CT uzyskanej kontroli spike-in a wartością CT referencyjnego cel-miR-39 (nie poddanego procesowi ekstrakcji).

Real-time PCR i analiza danych

Ilości shRNA i GFP mRNA określono ilościowo metodą qPCR przy użyciu StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qPCR każdej próbki przeprowadzono w 20 µL całkowitej objętości z 2 µL cDNA, 10 µL 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) i 10 pmol każdego primera. Amplifikację przeprowadzono w następujących warunkach: wstępna denaturacja w 95 °C przez 10 min; i 30 cykli w 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, i 72 °C przez 30 s. qPCR przeprowadzono również z cel-miR-39 jako referencyjnym RNA, aby uzyskać stopień odzysku całkowitego RNA w każdej próbce. Protokół qPCR był taki sam jak opisany powyżej w tej sekcji, z wyjątkiem użytych primerów, które stanowiły 10 pmol wspólnego primera odwrotnego (takiego samego jak primer odwrotny shRNA) i primera forward cel-miR-39. Krzywą topnienia każdego amplifikowanego produktu DNA uzyskiwano mierząc zmianę intensywności fluorescencji barwnika SYBR Green dla każdej próbki sześć razy, podczas zwiększania temperatury z 60 °C do 95 °C w tempie + 0,3 °C/s po zakończeniu qPCR. Specyficzne primery do qPCR zostały zaprojektowane przy użyciu programu Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (Tabela uzupełniająca 5). Względna ekspresja celów została określona przy użyciu metody porównawczej 2-ΔΔCT. Względna ilość mRNA GFP została również potwierdzona poprzez pomiar intensywności pasm na 2% żelu agarozowym. Amplifikację cDNA przeprowadzono przy użyciu tych samych warunków i programu PCR, jakie zastosowano do qPCR opisanego powyżej, z wyjątkiem liczby cykli PCR (20 dla GFP mRNA).

Kalibracja i kwantyfikacja bezwzględnej ilości RNA

Krzywe standardowe dla stężenia RNA i wartości CT uzyskano przy użyciu każdego materiału standardowego RNA. Dla shRNA, krzywą standardową uzyskano przy użyciu zsyntetyzowanych shRNA zakupionych od Integrated DNA Technologies. Dla GFP mRNA, krzywą uzyskano używając GFP mRNA wyekstrahowanego z zestawu transkrypcyjnego (Riboprobe; Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Ilość RNA dla standardowego shRNA została podana przez Integrated DNA Technologies, natomiast ilość wyekstrahowanego standardowego GFP mRNA określono na podstawie wartości absorpcji UV/Vis przy użyciu BioSpektrometru. Uzyskane standardowe RNA przekształcano do cDNA poprzez odwrotną transkrypcję, jak opisano powyżej w rozdziale „Przygotowanie całkowitego RNA i odwrotna transkrypcja”. Następnie cDNA rozcieńczano 10, 100, 1000 i 10 000 razy, po czym qPCR powtarzano trzykrotnie, a uzyskane wartości CT wykorzystywano do uzyskania krzywej standardowej. Wartości CT uzyskane z RT-qPCR zostały przeliczone na początkowe stężenia RNA w lizatach komórkowych poprzez proces kalibracji (Supplementary Figure 6). Ostateczna bezwzględna ilość RNA została określona przez pomnożenie każdego współczynnika odzysku RNA (%) i wartości ilości RNA z krzywej kalibracyjnej (Tabele uzupełniające 1, 2).

Cellular labeling with Cy5-I-gel

Komórki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) uzyskano z Korea Cell Line Bank (Seul, Korea) i utrzymywano w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną w nawilżanym i utrzymywanym w CO2 (5%) inkubatorze. Komórki MDCK wykazujące ekspresję GFP (MDCK-GFP) przygotowano poprzez transfekcję wektora pEGFP-N1 za pomocą odczynników Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific) zgodnie z protokołem producenta. Następnie sortowaliśmy komórki emitujące GFP przy użyciu systemu FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Przez cały czas trwania badań, komórki były badane negatywnie pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Wyhodowane komórki MDCK-GFP w 24-dołkowych płytkach z przykrywkami (50 000 komórek na każdą studzienkę) koinkubowano z żelem Cy5-I (Cy5-conjugated I-gel) zawierającym sprzężone z Cy5 nici sekwencji X01 DNA (odpowiadające 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) w podłożu wolnym od surowicy przez 4 h. W celu przygotowania plazmidu Cy5-I, Cy5-dsDNA (Cy5-koniugowany dsDNA) został najpierw przygotowany przez annealgację Cy5-koniugowanego X01 (z dodatkowym lepkim końcem 5′-p-GATC) i jego komplementarnej kontr- nici (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Następnie, Cy5-dsDNA i plazmid I zostały wymieszane i podligowane w stosunku molowym 5000:1. Nadmiar niezwiązanego Cy5-dsDNA usuwano przez wirowanie (12 400 g, 4 °C, 60 min) z użyciem mikrotubularnych filtrów wirówkowych Amicon (50 kDa Mw cutoff) przez 4-5 razy. Cy5-shRNA (Cy5-conjugated shRNA) został zsyntetyzowany komercyjnie (Integrated DNA Technologies). W przypadku zestawów Cy5-I-plasmid i Cy5-shRNA, komórki koinkubowano z 2,625 nM każdej próbki w podłożu wolnym od surowicy przez 4 h. W przypadku zestawów Lipofektamina-Cy5-I-plasmid i Lipofektamina-Cy5-shRNA, Lipofektaminę i próbkę sprzężoną z Cy5 kompleksowano elektrostatycznie poprzez zmieszanie ich w stosunku molowym 1:1 do końcowego stężenia roztworu 2,625 μM Lipofektaminy i 2,625 μM substratu. Następnie komórki koinkubowano z 2,625 μM Lipofectamine-Cy5-I-plasmid lub Lipofectamine-Cy5-shRNA w medium wolnym od surowicy odpowiednio przez 4 h. W przypadku kontroli cell-only, komórki były koinkubowane z DMEM bez surowicy zawierającym 1% (v/v) penicyliny (HyClone). Po 4 h koinkubacji wszystkie próbki przemyto dwukrotnie buforowanym buforem fosforanowym (PBS) buforem soli fizjologicznej (0,1 M, pH 7,4), a komórki były dalej inkubowane przez 6 h w podłożu wzrostowym zawierającym 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS; HyClone) i 1% penicyliny, aby zapewnić wystarczający czas odbudowy komórek i absorpcji. Wyhodowane komórki zostały utrwalone 4% formaldehydem na 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemyte buforem PBS (0,1 M, pH 7,4). Do obrazowania mikroskopowego, szkiełka nakrywkowe z przyłączonymi komórkami były montowane na szkiełkach szklanych przy użyciu wodnego medium montażowego ze środkiem przeciw odbarwianiu. Obrazy fluorescencji rejestrowano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioplan 2, a zdjęcia wykonywano przy użyciu kamery Zeiss Axiocam HR.

Doświadczenie wyciszania genu GFP przy użyciu I-gel

Najpierw I-gel zawierający 262,5 µM X-DNA i 175 nM I-plazmidu inkubowano z 300 U polimerazy T7 RNA (Thermo Fisher Scientific) przez 15 min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji próbkę I-gel rozcieńczano do 100 razy w DMEM wolnym od surowicy, zawierającym 1% penicyliny. Następnie, 1/6 objętości kompleksu I-gel/polimerazy dodawano do każdej studzienki płytki 24-dołkowej z szkiełkiem nakrywkowym, która została wstępnie pokryta komórkami MDCK-GFP (20 000 komórek na studzienkę) na 24 h. Dla zestawów żelu z plazmidem I, mieszaniny plazmidów scramblowanych i żelu z plazmidem scramblowanym, komórki MDCK-GFP były hodowane współbieżnie z taką samą ilością molową każdego plazmidu i polimerazy T7 RNA, jak w przypadku I-gel. Do pomiaru efektu RNAi nagiego shRNA i Lipofektaminy-shRNA użyto 100-krotnie więcej każdej próbki RNA w stosunku do liczby szablonu plazmidu I, biorąc pod uwagę szybkość ekspresji shRNA w I-żelu, jak obliczono na podstawie eksperymentu z lizatem komórkowym. Dla zestawów naked shRNA i scrambled shRNA, komórki MDCK-GFP były koinkubowane z 175 nM próbki RNA. Próbki sprzężone z lipofektaminą przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta. Dla zestawów Lipofectamine-I-plasmid i Lipofectamine-scrambled plasmid mixture, Lipofectamine i każdą próbkę plazmidu kompleksowano elektrostatycznie przez zmieszanie ich w stosunku molowym 5:1 w celu uzyskania końcowego stężenia roztworu 8,75 nM Lipofectamine i 1,75 nM substratu plazmidowego. W przypadku zestawu Lipofektamina-shRNA, Lipofektaminę i wolny shRNA kompleksowano elektrostatycznie mieszając je w stosunku molowym 5:1, aby uzyskać końcowe stężenie roztworu 875 nM Lipofektaminy i 175 nM shRNA. Komórki MDCK-GFP inkubowano z tak przygotowanymi próbkami skompleksowanymi Lipofektaminą w podłożu wolnym od surowicy przez 4 h. W przypadku zestawu tylko dla komórek, tylko komórki MDCK-GFP inkubowano w podłożu wolnym od surowicy przez 4 h, bez żadnych próbek. Wszystkie próbki zostały wypłukane po 4 h koinkubacji, a komórki dodatkowo inkubowano przez 48 h z podłożem wzrostowym (DMEM zawierającym 10% (v/s) FBS i 1% penicyliny) w celu oceny efektu wyciszania RNA w 37 °C pod 5% CO2. Komórki były następnie utrwalane 4% formaldehydem przez 10 min w temperaturze pokojowej i przemywane buforem PBS (0,1 M, pH 7,4). W celu obrazowania mikroskopowego, komórki mocowane na szkiełkach nakrywkowych montowano na szkiełkach szklanych przy użyciu wodnego medium montażowego ze środkiem przeciw odbarwianiu.

Analiza ekspresji genów metodą ilościowego PCR w żywych komórkach

Wszystkie próbki traktowano i inkubowano w każdym medium komórkowym w tej samej ilości i w tych samych warunkach, jakie stosowano we wcześniej opisanym eksperymencie wyciszania genów GFP przy użyciu sekcji I-gel. Po inkubacji, medium komórkowe zostało odessane z płytek do hodowli komórkowych, a komórki MDCK-GFP zostały przemyte raz buforem PBS i trypsynizowane w celu odłączenia komórek w każdej studzience płytki. Oderwane komórki rozcieńczano buforem PBS w celu dezaktywacji trypsyny, a następnie zbierano do mikrotubki o pojemności 1,5 mL i granulowano przez wirowanie (180 g, 5 min). Supernatant usuwano, a komórki rozcieńczano 20 µL buforu PBS. Do roztworu zawiesiny komórkowej (20 µL) dodawano 1 mL odczynnika TRIzol, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL) i 200 µL roztworu chloroformu. Kolejną ekstrakcję RNA przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. W celu ilościowego określenia względnej ilości GFP mRNA i shRNA na poziomie komórkowym, wszystkie qPCR preparatów próbek przeprowadzono tą samą metodą, jak opisano w sekcjach „Przygotowanie całkowitego RNA i odwrotna transkrypcja” oraz „Real-time PCR i analiza danych”.

Analiza obrazowania komórek w celu kwantyfikacji intensywności pikseli

Przetwarzanie obrazu komórek, dane przeprowadzono przy użyciu programu MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). Surowe obrazy fluorescencji zostały zaimportowane do MATLABa, a każdy piksel w obrazach został przekonwertowany na każdy składnik macierzy. Rozkład intensywności fluorescencji każdej składowej był przedstawiany graficznie w postaci histogramu. Cały zbiór danych został podzielony na 256 przedziałów.

Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek

Komórki przemywano jednokrotnie 1 mL PBS, po czym aspirowano medium wzrostowe z płytek do hodowli komórkowych. Następnie komórki były odrywane od płytki przez potraktowanie trypsyną. Oderwane komórki zbierano do 15-ml probówki, a następnie odwirowywano, uzyskując w ten sposób osad (180 g, 3 min). Supernatant roztworu trypsyny został usunięty, a osad komórkowy przepłukano dwukrotnie przy użyciu 2 mL PBS. Komórki zostały ponownie zawieszone w PBS do stężenia 50 000 komórek/mL. Następnie przygotowano próbki poprzez utrwalenie komórek w 1% roztworze formaldehydu przez 10 min w temperaturze pokojowej. Próbki analizowano pod kątem intensywności fluorescencji GFP przy użyciu systemu FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Relatywny poziom żywotności w warunkach ciemnych

Zawiesinę komórek MDCK-GFP (5000 komórek na studzienkę) dozowano na płytkę 96-dołkową (Corning Inc., Corning, NY, USA) i inkubowano przez 1 dzień w temperaturze 37 °C pod wpływem 5% CO2. Gdy komórki przylegały do płytki, były inkubowane z różnymi stężeniami I-żelu (odpowiadającymi stężeniu X-DNA) w podłożu wzrostowym (DMEM zawierającym 10% (v/v) FBS i 1% penicyliny) w ciemności. I-żel składał się ze stosunku molowego X-DNA:I-plazmid 1500:1. Próbki te inkubowano przez 6, 24 i 48 h w temperaturze 37 °C pod wpływem 5% CO2. Pod koniec każdego czasu inkubacji do próbek dodawano roztwór Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. Po dalszej inkubacji przez 1 h, absorbancję przy 450 nm mierzono przy użyciu czytnika mikropłytek. Wyniki tego pomiaru wyrażono jako stosunek absorbancji próbki do absorbancji komórek kontroli ujemnej bez inkubacji próbki.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania Prism 7.05 (GraphPad Software) dla testu t-Studenta, jednokierunkowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Bonferroniego. Holm-Bonferroni multiple comparisons post test przeprowadzono wykorzystując wyniki testu wielokrotnych porównań Bonferroniego z oprogramowania Prism 7.05 (GraphPad Software)30. Test normalności obliczono za pomocą testu Shapiro-Wilka. W wynikach testu Shapiro-Wilka dane miały w przybliżeniu rozkład normalny. Istotność statystyczną oznaczono jako *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

.