ABT-263: A Potent and Orally Bioavailable Bcl-2 Family Inhibitor

ABT-263 utrzymuje wysokie powinowactwo do Bcl-xL, Bcl-2, i Bcl-w, które jest poniżej granicy wykrywalności testu polaryzacji fluorescencji (Ki ≤1 nmol/L), ale wiąże się słabiej z Mcl-1 i A1 (Tabela 1). Ten wzorzec selektywności jest podobny do tego, jaki wykazuje jego poprzednik ABT-737 i białko BH3-only Bad (12). Subnanomolarne powinowactwo ABT-263 do Bcl-xL zostało potwierdzone przez bardziej czułą, czasowo rozdzielczą analizę transferu energii rezonansu fluorescencji, która wykazała, że enancjomer (stereoizomer o przeciwnej konfiguracji grupy morfolinoetylowej, używany jako mniej aktywna kontrola) jest ∼40-krotnie mniej silny.

Profil farmakokinetyczny ABT-263 charakteryzuje się niskimi wartościami klirensu osoczowego i niską objętością dystrybucji u myszy, szczurów, psów i małp, z okresami półtrwania eliminacji w osoczu po podaniu dawki i.v. wynoszącymi od 4,6 do 8,4 godzin (Tabela uzupełniająca S1). Dostępność biologiczna po podaniu doustnym wynosiła ∼20% u wszystkich czterech gatunków. Ze względu na niską rozpuszczalność w wodzie, ABT-263 wykazuje przedłużone, ograniczone szybkością rozpuszczania wchłanianie doustne. Podanie doustne w postaci preparatów na bazie lipidów, w których związek jest znacznie lepiej rozpuszczalny, powoduje zwiększenie wchłaniania z biodostępnością bliską 50% i okresem półtrwania w fazie eliminacji doustnej wynoszącym 8,9 godziny u psów. Reprezentatywna krzywa stężenia leku w osoczu po podaniu i.v. lub p.o. u psa jest przedstawiona na Supplementary Fig. S1.

ABT-263 wykazuje cytotoksyczność opartą na mechanizmie. Wiele małych cząsteczek mimetycznych BH3 zostało zgłoszonych, aby wiązać członków rodziny Bcl-2 z umiarkowanym powinowactwem i indukować apoptozę w liniach komórek nowotworowych (21-23). Jednakże, wiele z tych czynników zostało ostatnio wykazanych jako zabijające komórki w sposób niezależny od Bax/Bak, co stawia pod znakiem zapytania funkcjonalne znaczenie ich słabego powinowactwa do białek Bcl-2 i prawdziwe mechanizmy działania tych cząsteczek (14). Dlatego uznaliśmy, że ważne jest, aby solidnie wykazać, że apoptoza indukowana przez ABT-263 była bezpośrednim wynikiem hamowania białek rodziny Bcl-2. Po pierwsze, aktywność komórkowa ABT-263 została oceniona w zależnej od interleukiny-3 (IL-3) prolimfocytarnej linii komórkowej FL5.12 u myszy. Odstawienie IL-3 indukuje apoptozę FL5.12, częściowo poprzez wzrost regulacji proapoptotycznych czynników Bim i Puma (24, 25). Nadekspresja Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) lub Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) chroni przed skutkami odstawienia IL-3 poprzez sekwestrację Bim i Puma (25). ABT-263, ale nie enancjomer, odwrócił ochronę zapewnioną przez nadekspresję Bcl-2 lub Bcl-xL (EC50 = 60 i 20 nmol/L, odpowiednio; Figura 2A). ABT-263 był nieskuteczny w wywoływaniu śmierci komórek w obecności IL-3, gdzie komórki FL5.12 nie podlegały bodźcom proapoptotycznym. Zdolność ABT-263 do zabijania komórek FL5.12-Bcl-2 lub FL5.12-Bcl-xL w warunkach wycofania IL-3 była znacznie osłabiona w obecności inhibitora kaspazy ZVAD, wskazując, że zabijanie komórek jest zależne od kaspaz (Supplementary Fig. S2).

Aby ustalić, czy cytotoksyczność wywołana ABT-263 może być przypisana do zakłócenia wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko rodziny Bcl-2, wykonano badania koimmunoprecypitacji. ABT-263 wywołał zależny od dawki spadek interakcji Bim:Bcl-xL w ciągu 2 godzin po leczeniu w komórkach FL5.12-Bcl-xL (Supplementary Fig. S3). Podobne wzorce obserwowano również w przypadku zaburzeń kompleksów Bim:Bcl-2 w komórkach FL5.12-Bcl-2 (dane nie pokazane), wskazując, że ABT-263 przywraca śmierć komórek zależną od IL-3 poprzez osłabienie zdolności Bcl-xL i Bcl-2 do sekwestracji czynników proapoptotycznych, takich jak Bim. Zdolność ABT-263 do zakłócania interakcji białko-białko z rodziny Bcl-2 została potwierdzona w systemie hybrydowym u ssaków (Fig. 2B). ABT-263 hamował interakcję VP16-Bcl-xS z Gal4-Bcl-xL (pozorne EC50 ∼50 nmol/L), podczas gdy enancjomer był znacznie mniej skuteczny.

Aby dokładniej zbadać mechanizm działania, aktywność ABT-263 oceniano w serii komórek mysich fibroblastów embrionalnych (MEF), które obejmowały komórki typu dzikiego (WT), jak również komórki z niedoborem Bcl-x, Mcl-1 i Bax/Bak (DKO). ABT-263 silnie indukował śmierć komórek w komórkach MEF Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/L), ale nie Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/L) (Supplementary Fig. S4A). Potwierdza to zdolność ABT-263 do funkcjonalnego hamowania Bcl-xL, ale nie Mcl-1, w kontekście komórkowym i jest zgodne z wcześniejszymi obserwacjami z ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). Enancjomer był nieskuteczny w obu systemach. ABT-263 był również nieskuteczny (EC50 ≥10 μmol/L) w zabijaniu komórek WT lub DKO MEF, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (14). W przeciwieństwie do tego, etopozyd, ogólny środek cytotoksyczny, jak również dwa zgłoszone małocząsteczkowe mimetyki BH3 , indukowały śmierć komórek z podobnymi EC50 we wszystkich czterech typach komórek MEF, co sugeruje, że związki te indukują śmierć komórek, przynajmniej częściowo, przez mechanizmy niezależne od rodziny Bcl-2 (Supplementary Fig. S4C).

Aby ocenić zdolność ABT-263 do bezpośredniego indukowania apoptozy w ludzkiej nowotworowej linii komórkowej, monitorowano translokację Bax i uwalnianie cytochromu c w linii komórkowej SCLC H146. Wykazano, że H146 jest zależny od Bcl-2 dla przeżycia (25). ABT-263 indukował zależne od dawki zmniejszenie cytozolowego Bax w połączeniu ze wzrostem cytozolowego cytochromu c w ciągu 2 godzin po leczeniu (Fig. 2C-i). Enancjomer nie był w stanie wywołać podobnej odpowiedzi. Aktywacja Bax i uwalnianie cytochromu c zostały potwierdzone mikroskopowo (Fig. 2C-ii). Przeciwciało 6A7 anty-Bax, które specyficznie rozpoznaje konformacyjnie aktywną formę Bax, zostało użyte do wykrycia aktywowanego Bax w komórkach H146. Zgodnie z badaniami frakcjonowania, leczenie ABT-263 było związane ze znacznym wzrostem aktywowanej Bax. Odpowiadało to uwolnieniu cytochromu c z mitochondriów do cytozolu, o czym świadczą zmniejszone struktury punkcikowe i zwiększone barwienie cytosolu. ABT-263, ale nie jego enancjomer, indukował również zależny od czasu wzrost aktywności kaspazy-3, który był wykrywalny po 2 godzinach i który osiągnął szczyt po ∼ 6 godzinach (Fig. 2D). Efekt ten był zależny od stężenia, z EC50 ∼ 100 nmol/L w 6-godzinnym punkcie czasowym (Rys. 2D, inset). W przeciwieństwie do tego, kamptotecyna, inhibitor topoizomerazy I, o którym donoszono, że indukuje apoptozę mitochondrialną i następczą aktywację kaspaz (27, 28), była w stanie wywołać wzrost aktywności kaspazy-3 dopiero po 24 godzinach (dane nie pokazane). Dane te wskazują, że ABT-263 działa bezpośrednio w celu zahamowania Bcl-2 i Bcl-xL, uwalniając czynniki proapoptotyczne, takie jak Bim, aby wywołać szybką aktywację mitochondrialnego szlaku apoptotycznego.

Aby ocenić zakres aktywności komórkowej ABT-263, zbadano panel ludzkich linii komórkowych nowotworów obejmujący szereg typów nowotworów. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami na temat ABT-737 (12), ABT-263 wykazywał aktywność pojedynczego agenta w SCLC i nowotworach hematologicznych, ale nie w większości innych typów nowotworów (dane nie pokazane). Aby dokładniej zbadać aktywność w tych wrażliwych typach nowotworów, ABT-263 był badany w panelach linii komórkowych pochodzących z SCLC (n = 22) i nowotworów złośliwych hematologicznych (n = 23). W każdym panelu ABT-263 wykazywał zakres siły działania, przy czym 32% (SCLC) i 48% (hematologiczna) linii komórkowych było wysoce wrażliwych (EC50 <1 μmol/L; Ryc. 3). Enancjomer był >20-krotnie mniej aktywny w tych wrażliwych komórkach (Tabela uzupełniająca S2).

Oralne podawanie ABT-263 powoduje regresję guzów ksenograftowych SCLC i ALL in vivo. W celu rozszerzenia tych obserwacji in vivo, ABT-263 był oceniany w modelach ksenograftów bocznych utworzonych z niektórych wrażliwych linii komórkowych SCLC i hematologicznych. Po podaniu p.o., raz dziennie w dawce 100 mg/kg przez 21 kolejnych dni, ABT-263 wywołał szybką i całkowitą odpowiedź nowotworową (CR), która utrzymywała się przez kilka tygodni po zakończeniu leczenia u wszystkich zwierząt z guzami H889 (SCLC) lub RS4;11 (ALL) (ryc. 4A). Podobne leczenie myszy noszących guzy H146 SCLC wywołało szybką regresję, skutkującą CR u 60% i PR u 40% zwierząt (ryc. 4A). W tym modelu obserwowano stopniową odbudowę guza rozpoczynającą się kilka tygodni po zakończeniu dawkowania. Aktywność była zależna od dawki w modelu ksenograftów H146. Leczenie ABT-263 w dawce 50 mg/kg przez 21 kolejnych dni spowodowało CR u 22% i PR u 44% zwierząt, podczas gdy dawka 25 mg/kg spowodowała statystycznie istotne, ale umiarkowane zahamowanie wzrostu guza, bez obserwowanej regresji guza. ABT-263 był dobrze tolerowany (<5% utrata masy ciała) we wszystkich dawkach.

Aby skorelować ekspozycję na ABT-263 ze skutecznością przeciwnowotworową, przeprowadzono badanie farmakokinetyczne w stanie stacjonarnym, w którym myszom nie noszącym guza podawano lek p.o. raz na dobę przez 3 dni, a stężenie leku w osoczu oznaczano po podaniu trzeciej dawki. Zarówno szczytowe stężenie w osoczu (Cmax), jak i pole powierzchni pod krzywą stężenia w osoczu (AUC) były proporcjonalne do dawki i zwiększały się w przybliżeniu liniowo (tabela uzupełniająca S3). Dawka 100 mg/kg, która spowodowała 100% ogólny wskaźnik odpowiedzi (ogólny wskaźnik odpowiedzi = CR + PR), dała wartości Cmax i AUC wynoszące odpowiednio 7,7 μmol/L i 90 μmol/L h. Ekspozycja wynikająca z podania dawki 50 mg/kg, która wywołała 66% ogólny wskaźnik odpowiedzi, wynosiła 5,4 μmol/L (Cmax) i 54 μmol/L h (AUC). Dane te wskazują, że szczytowe stężenia leku w osoczu w zakresie od ∼ 5,4 do 7,7 μmol/L są wysoce skuteczne.

ABT-263 zwiększa aktywność środków chemioterapeutycznych in vivo. Skuteczność in vivo ABT-263 była badana w połączeniu z powszechnie stosowanymi środkami terapeutycznymi w kilku agresywnych modelach nowotworów złośliwych układu krwiotwórczego. ABT-263 i rytuksymab były badane w modelu ksenograftowym chłoniaka B-komórkowego DoHH2 (ryc. 4B). Przy codziennym podawaniu dawki 100 mg/kg p.o. przez 17 dni, ABT-263 wykazywał 44% inhibicję wzrostu guza. Pojedyncza dawka 10 mg/kg rytuksymabu spowodowała zahamowanie wzrostu guza o 84%. Ani ABT-263 ani rytuksymab same w sobie nie osiągnęły trwałej regresji guza; jednakże kombinacja wykazała lepszy efekt, osiągając 70% CR i 10% PR. Połączenie to spowodowało również znaczącą poprawę opóźnienia wzrostu guza (>700%) w porównaniu z samym rytuksymabem (300%).

Skuteczność ABT-263 samego i w połączeniu ze zmodyfikowanym schematem R-CHOP oceniano również w modelu GRANTA-519 ksenograftów bocznych chłoniaka z komórek płaszcza (ryc. 4B). ABT-263 podawany w dawce 100 mg/kg p.o. przez 21 kolejnych dni powodował zahamowanie wzrostu guza o 40%. Dla porównania, schemat R-CHOP hamował wzrost guza o 68% przy 20% CR. Połączenie to spowodowało dramatyczne regresje guza i całkowite odpowiedzi nowotworowe u wszystkich badanych zwierząt, bez dowodów na wzrost guza w czterech z dziewięciu ocenianych guzów.

Na koniec zbadaliśmy zdolność ABT-263 do potęgowania efektów chemioterapii w modelu opornym na ABT-263. W modelu OPM-2 flank xenograft szpiczaka mnogiego (in vitro EC50 = 6,7 μmol/L), ABT-263 podawany codziennie przez 21 dni w dawce 100 mg/kg nie hamował znacząco wzrostu guza (ryc. 4B). Bortezomib podawany w maksymalnej tolerowanej dawce (1 mg/kg i.v., qd ×3) hamował wzrost guza o 70%, bez CRs. ABT-263 zwiększył skuteczność bortezomibu, a jego połączenie dało 95% zahamowanie wzrostu guza i 40% CR.

ABT-263 wywołuje szybką, ale odwracalną małopłytkowość. Niedawno donieśliśmy, że ABT-737 wywołuje szybką i odwracalną trombocytopenię u zwierząt, wynikającą z hamowania białek rodziny Bcl-2 i indukcji apoptozy w krążących płytkach krwi bez toksyczności dla szpiku kostnego (29). Zgodnie z oczekiwaniami ABT-263 również indukuje trombocytopenię. Po podaniu pojedynczej dawki p.o. u psów, liczba krążących płytek krwi zmniejszyła się w ciągu 2 godzin z nadirem płytek w ciągu 6 godzin i dowodami na ponowne pojawienie się w ciągu 24 godzin (ryc. 5A). Aby określić wpływ przedłużonego dawkowania, zbadano zależność farmakokinetyczno-farmakodynamiczną po podaniu wielokrotnych dawek dobowych u psów (ryc. 5B). ABT-263 podawano p.o. w dawce 2 mg/kg/d przez 6 dni, a następnie zwiększono do 6 mg/kg/d przez dodatkowe 6 dni. Liczbę płytek krwi i stężenie leku w osoczu oceniano 6 godzin po leczeniu, aby uchwycić prawdopodobne nadiry płytek krwi w dniach od 1 do 4 i od 7 do 11. Przy dawce 2 mg/kg liczba płytek krwi zmniejszyła się z początkowej wartości ∼ 250 000/μL do ∼ 125 000/μL po drugiej dawce, a następnie utrzymywała się na stałym poziomie przez pozostałe dawki. Stężenie leku w osoczu uzyskane po 6 godzinach od podania (C6h) pozostawało stałe i wynosiło od 3,6 do 4,2 μmol/l. Na podstawie profilu farmakokinetycznego produktu ABT-263 (Supplementary Fig. S1), C6h jest około 2-krotnie niższe niż Cmax, co wskazuje, że szczytowe stężenia leku w osoczu osiągane po podaniu wielokrotnych dawek 2 mg/kg wynoszą ∼7 do 8 μmol/L. Poziomy te są podobne do tych uzyskanych po podaniu dawki 100 mg/kg p.o. u myszy. Kiedy dawka ABT-263 została zwiększona do 6 mg/kg/d, liczba płytek krwi zmniejszyła się do ∼50,000/μL w drugim dniu stosowania tej wyższej dawki i pozostała względnie stała przez cały czas trwania badania. Wartości C6h przy tym poziomie dawki wynosiły od 10,2 do 14,8 μmol/l (Cmax, 20-30 μmol/l). ABT-263 był dobrze tolerowany w tym badaniu, bez śmiertelności i niepożądanych objawów klinicznych. Jednakże w miejscu wkłucia do żyły widoczne były krwiaki, co jest zgodne ze zmianami w hemostazie. Dane te wskazują, że powtarzana codziennie ekspozycja na ABT-263 w stężeniach, które okazały się wysoce skuteczne w modelach na myszach, powoduje zmniejszenie liczby krążących płytek krwi u psów o ∼50%. Ponadto, stężenia w osoczu kilkakrotnie wyższe niż poziom skuteczny są dobrze tolerowane, a liczba krążących płytek krwi zmniejsza się do ∼50,000/μL.