Summary
Wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy jest potężną techniką frakcjonowania makrocząsteczek takich jak DNA, RNA i białka. W tym celu, próbka zawierająca mieszaninę różnej wielkości makrocząsteczek jest układana na powierzchni gradientu, którego gęstość wzrasta liniowo z góry na dół. Podczas wirowania, różnej wielkości makrocząsteczki sedymentują przez gradient z różną szybkością. Szybkość sedymentacji zależy, oprócz siły odśrodkowej, od wielkości, kształtu i gęstości makrocząsteczek, jak również od gęstości i lepkości gradientu. W ten sposób makromolekuły są rozdzielane według wielkości, przy czym większe z nich sedymentują w kierunku dna, a lżejsze pozostają w pobliżu górnej części gradientu. Metoda ta okazała się szczególnie skuteczna we frakcjonowaniu dużych cząsteczek DNA i była szeroko stosowana do pomiaru indukcji i naprawy pęknięć DNA po ekspozycji na czynniki klastogenne. Tutaj opisujemy adaptację tej metody, która może być wykorzystana do analizy nowo zsyntetyzowanego DNA powstałego podczas replikacji DNA. Poprzez analizę wielkości powstającego DNA w alkalicznych gradientach sacharozy, można zmierzyć zmiany w aktywności replikacji po ekspozycji komórek na czynniki uszkadzające DNA. Metoda ta jest szczególnie użyteczna, ponieważ pozwala na rozróżnienie pomiędzy wpływem uszkodzeń DNA na wydłużanie łańcucha a inicjacją replikonu, co jest niezbędne do dogłębnej analizy punktu kontrolnego wewnątrz fazy S. Ta zdolność czyni tę technikę unikalną i usprawiedliwia jej nieco pracochłonny charakter.
.