Assembly Principles Learned from In Vitro Studies
Funkcjonalne bakteryjne podjednostki rybosomalne 30S i 50S mogą być odtworzone in vitro z rRNA i każdego z białek rybosomalnych. Szczegółowe badania biochemicznych i biofizycznych zasad leżących u podstaw montażu rybosomów in vitro dostarczyły użytecznych paradygmatów do kierowania badaniami biogenezy rybosomów in vivo.
Jedną z pierwszych zasad ujawnionych przez te eksperymenty jest to, że montaż białek r w podjednostki rybosomalne zachodzi w sposób hierarchiczny. Badania nad rekonstytucją bakteryjnych podjednostek rybosomalnych 30S określiły „mapę montażu” dla kolejności asocjacji każdego białka r z rRNA. W oparciu o ich kolejność w hierarchii wiązania, białka r są oznaczone jako pierwszorzędowe (wiążące się bezpośrednio do rRNA), drugorzędowe (wiążące się zależnie od białek pierwszorzędowych) lub trzeciorzędowe (wiążące się zależnie od białek drugorzędowych). Chociaż taka mapa zależności okazała się bardzo użytecznym punktem wyjścia, nie dostarcza ona żadnych informacji o kinetyce wiązania białek. Ścieżka montażu może raczej w dużym stopniu odzwierciedlać kolejność, w jakiej każde białko r jest najbardziej stabilnie związane z rRNA. Dodatkowo, mapa składania nie uwzględnia ani ścieżki składania 16S rRNA niezależnej od białek r, ani roli, jaką w składaniu rybosomów odgrywa nukleolityczne przetwarzanie prekursorów rRNA, które zachodzi in vivo. Ostatnio, te aspekty składania podjednostki 30S zostały zbadane bardziej szczegółowo przy użyciu technik takich jak sondowanie konformacji RNA za pomocą rodników chemicznych i hydroksylowych w celu oceny zmian konformacji rRNP w czasie, oraz spektrometrii masowej z impulsem (PC/MS) w celu określenia kinetyki wiązania białka r do rRNA.
Możliwym wyjaśnieniem obserwacji pierwotnie wiążących r-protein na mapie montażowej jest to, że ich miejsca wiązania są tworzone przynajmniej częściowo przez konformację przyjętą przez 16S rRNA niezależnie od r-protein. W rzeczywistości, zgodnie z tą koncepcją i poglądem, że rybosomy wyewoluowały z katalizatora RNA, wykazano, że 5′ domena 16S rRNA może się składać i tworzyć kontakty trzeciorzędowe przy nieobecności wszystkich r-białek. Ta trzeciorzędowa struktura przypuszczalnie nie jest całkowicie stabilna przy braku kontaktów białkowych, a zatem jest najprawdopodobniej stabilizowana przez wiązanie r-białek do miejsc, które powstają w wyniku przejściowych konformacji przyjmowanych przez rRNA w trakcie jego fałdowania. Dlatego druga zasada sugeruje, że składanie rRNA stanowi podstawę wiązania r-białek podczas montażu rybosomu.
Trzecia zasada, która wyłoniła się z badań in vitro rybosomów bakteryjnych jest taka, że wzmocnienie wiązania r-białek z rRNA występuje w miarę postępu montażu rybosomu. Wiele białek r kontaktuje się z wieloma nukleotydami na rRNA. Rozpoznawanie śladów rodników hydroksylowych w czasie ujawniło, że niektóre z tych nukleotydów są chronione przed innymi, co sugeruje, że w miarę postępu biogenezy rybosomów, r-proteiny nawiązują więcej kontaktów z rRNA, stając się w ten sposób bardziej stabilnie zintegrowane z rybosomami.
Początkowe ustanowienie kilku kontaktów między r-proteinami a rRNA potencjalnie stabilizuje pewne konformacje RNA i wywołuje zmiany w konformacji rRNA, aby zapewnić miejsca wiązania dla dodatkowych (drugorzędowych lub trzeciorzędowych) r-protein. Zatem, wi±zanie r-białek konsoliduje zyski z fałdowania RNA i nadaje kierunek procesowi składania. Sugeruje to model, w którym asocjacja przebiega poprzez naprzemienną serię zmian konformacyjnych RNA i wiązania białek, które kolejno stabilizują ostateczną strukturę RNA. Dane kinetyczne ujawniły, że składanie dojrzałych podjednostek 30S zachodzi poprzez wiele równoległych ścieżek składania RNA, z których wszystkie zbiegają się do produktu końcowego. Doprowadziło to do koncepcji krajobrazu składania, w przeciwieństwie do unikalnej ścieżki, na której zachodzi składanie podjednostek rybosomalnych.
Wreszcie, badania in vitro ujawniły, że składanie rybosomów zachodzi w kierunku 5′ do 3′. PC/MS i chemiczne sondowanie struktury drugorzędowej rRNA wykazały, że wiązanie białka r do domeny 5′ rRNA można zaobserwować przed nawiązaniem kontaktu białka z domeną 3′ rRNA. Natomiast badania śladów rodników hydroksylowych wykazały początkowy wybuch ochrony nukleotydów na całej długości 16S rRNA, co wskazuje, że składanie RNA zarodkuje z wielu różnych miejsc rozsianych po całym RNA, a tym samym wskazuje na brak kierunkowości 5′ do 3′ w montażu. Te sprzeczne obserwacje można pogodzić biorąc pod uwagę charakter różnych układów doświadczalnych. PC/MS mierzy kinetykę wiązania białek do rRNA, i jako takie tylko stabilne interakcje r-białko-rRNA mogą być wykryte, ponieważ r-białka, które wiążą się słabo podczas impulsu mogą być wypłukane podczas pościgu. Z drugiej strony, testy Footprinting mogą uchwycić ochronę nukleotydów zarówno przez słabo oddziałujące, jak i stabilnie związane r-białka. W sumie dane te wskazują, że podczas gdy montaż rybosomów może nukleować w całym rRNA, ostateczne ścisłe stowarzyszenie białek r z rRNA występuje w kierunku 5′ do 3′.
Ważne jest, aby rozważyć, w jaki sposób te eksperymenty in vitro mogą lub nie mogą odzwierciedlać montażu in vivo. Na przykład, gdy montaż rybosomów występuje in vivo, jest on sprzężony z transkrypcją rRNA, co również przypuszczalnie przyczynia się do obserwowanej kierunkowości 5′ do 3′ asocjacji r-białek. rRNA może ewoluować, aby złożyć 5′ do 3′, jak jest syntetyzowany, i włączyć r-białka w ten sposób, tym samym sprzęgając montaż z transkrypcją rRNA. Ponadto, wymóg etapu ogrzewania podczas rekonstytucji podjednostek rybosomalnych in vitro oraz identyfikacja wielu mutantów bakteryjnych, które są wadliwe w produkcji rybosomów, wskazują na potrzebę istnienia czynników trans-działających podczas biogenezy rybosomów in vivo.
.