Biosynteza trans-4-hydroksyproliny przez rekombinowane szczepy Corynebacterium glutamicum i Escherichia coli

Konstrukcja rekombinowanych szczepów produkujących trans-Hyp

W bazie danych znajduje się kilka genów spekulowanych jako geny 4-hydroksylazy L-proliny, w tym geny w Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 i Dactylosporangium. sp. Używając PCR, sklonowaliśmy i otrzymaliśmy putatywne geny P4H z P. stutzer i B. bronchiseptica RB50, nazwane p4hP i p4hB. Po trawieniu zostały one podligowane do odpowiednich plazmidów i przekształcone odpowiednio w C. glutamicum i E. coli. Długość p4hP wynosiła 918 bps, natomiast p4hB 924 bps. Sekwencje te były w 100% identyczne z genami zgłoszonymi w NCBI. Gen trans-P4H z Dactylosporangium sp. (p4hD) uległ udanej ekspresji w E. coli i może przekształcać L-prolinę z dobrymi właściwościami enzymatycznymi. Długość p4hD wynosiła 816 bps, kodując 272-aminokwasowy polipeptyd o masie cząsteczkowej 29,715 daltonów. W niniejszej pracy p4hD został zastosowany z pewnymi modyfikacjami na podstawach jądrowych. Oryginalna sekwencja genu p4hD została przeanalizowana (http://www.kazusa.or.jp/codon/), a wyniki pokazały, że istniały pewne rzadkie kodony zarówno dla C. glutamicum jak i E. coli. Stwierdzono, że rzadkie kodony są silnie związane z niskim poziomem ekspresji białka. Wykazano, że optymalizacja kodonów dla heterologicznej ekspresji białek często drastycznie zwiększa ekspresję białek. Tak więc, rzadkie kodony genu p4hD zostały zastąpione tymi używanymi z dużą częstotliwością w C. glutamicum, a zawartość GC została skorygowana z 73% do 61% poprzez konwersję synonimów, co było zbliżone do C glutamicum. Zmodyfikowany gen p4hD został zsyntetyzowany zgodnie z powyższymi modyfikacjami (plik dodatkowy 1).

Ekspresja P4H jest jednym z ważnych aspektów budowy szlaku biosyntezy trans-Hyp. Rysunek 2 pokazuje SDS-PAGE trans-P4Hs wyrażonych w rekombinowanych C. glutamicum i E. coli. Wszystkie rekombinowane trans-P4H uległy ekspresji jako białka rozpuszczalne, bez ciałek wtrętowych. Oczywiste jest, że rekombinowane trans-P4H w E. coli ulegały ekspresji w znacznie większym stopniu niż te w C. glutamicum (rys. 2). Wiele czynników ma wpływ na ekspresję obcych białek, w tym promotory, układ gospodarz-wektor, warunki kulturowe itd. Ponieważ była to pierwsza ekspresja trans-P4Hs w C. glutamicum, bardziej wszechstronne badania, takie jak wybór promotora i optymalizacja warunków hodowli, będą rozważane w naszych przyszłych pracach.

Porównanie aktywności P4H

Oxygenases are widely applied in industry since they can catalyze the highly specific oxyfunctionalization of unactivated C-H bonds under mild conditions, especially transferring molecular oxygen to a substrate . P4H należy do rodziny dioksygenaz zależnych od 2-oksokwasów, które są białkami monomerycznymi i wykorzystują raczej substraty monomeryczne niż polimeryczne. Aktywność trans-P4Hs przy użyciu rekombinowanych całych komórek w tym badaniu została zmierzona (Tabela 1). Nasze dane wskazują, że poziom ekspresji białka i aktywność enzymatyczna były wyższe w temperaturze 30°C. Wyniki pokazały również, że plazmidy były bardzo stabilne, ponieważ stabilność plazmidów rekombinowanych szczepów E. coli i C. glutamicum wynosiła ponad 98% pod koniec fermentacji.

Komórki rekombinantów z ekspresją różnych genów wykazywały różne poziomy aktywności katalitycznej w kierunku L-proliny. Aktywność trans-P4H wyrażonego przez E. coli BL21/ pET28a-p4hD była najwyższa spośród wszystkich skonstruowanych szczepów rekombinantowych. Nowe sklonowane i wyeksprymowane geny z P. stutzeri i B. bronchiseptica również wykazywały interesujące aktywności. Jeśli chodzi o różne szczepy gospodarza, to E. coli reprezentowała się lepiej niż C. glutamicum, co może być związane z wydajnością odpowiedniego plazmidu. Cztery szczepy C. glutamicum produkujące L-prolinę zostały użyte jako szczepy ekspresyjne, a otrzymane rekombinowane szczepy wykazywały różne aktywności enzymatyczne. Najwyższa specyficzna aktywność enzymatyczna wśród szczepów C. glutamicum wynosiła 40.7 U/mg – mokra komórka C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Natomiast specyficzna aktywność enzymatyczna rekombinowanego szczepu E. coli/pET28a -p4hD wynosiła do 60,4 U/mg – mokra komórka. Wzrost trzech rekombinowanych szczepów E. coli był podobny. Istniała jednak znacząca różnica pomiędzy rekombinowanymi szczepami C. glutamicum. Rekombinowane szczepy C. glutamicum o wyższej specyficznej aktywności enzymatycznej rosły słabiej niż te o niższej specyficznej aktywności enzymatycznej. Dodatkowo, aktywność enzymatyczna E. coli BL21 /pET28a -p4hD była podobna do aktywności E. coli W1485/pWFH1 i wyższa niż E. coli BL21/pET24-p4h1 z . Aktywność p4hD w E. coli W1485/pWFH1 była oryginalna dla Dactylosporangium sp., podczas gdy p4hD w E. coli BL21/pET24-p4h1 została zmodyfikowana. Chociaż optymalizacja kodonów w tym badaniu została zaprojektowana dla C. glutamicum, wyniki wskazały, że była ona również z powodzeniem stosowana w E. coli.

Produkcja Trans-Hyp w kolbach

W tabeli 1 przedstawiono również produkcję Trans-Hyp przez różne rekombinowane szczepy C. glutamicum i E. coli. Wydajność trans-Hyp przez te rekombinowane szczepy zależała zarówno od aktywności enzymatycznej P4H, jak i od wzrostu komórek. Najwyższą wydajnością charakteryzował się szczep E. coli BL21/ pET28a-p4hD, co było zbieżne z jego specyficzną aktywnością enzymatyczną. Pomimo, że rekombinowane szczepy E. coli rosły podobnie w podłożu produkcyjnym, istniała znacząca różnica w produkcji trans-Hyp, która nie utrzymywała się na tym samym poziomie w zależności od specyficznej aktywności enzymatycznej. Produkcja trans-Hyp przez rekombinowane szczepy C. glutamicum była również znacznie mniejsza niż przez E. coli BL21/pET28a-p4hD. Wynikało to zarówno z mniejszej ekspresji trans-P4H, jak i mniejszego wzrostu komórek C. glutamicum. Produkcja L-proliny przez cztery szczepy C. glutamicum była również mniejsza niż 1 g/L. Nie było dużej różnicy w produkcji trans-Hyp pomiędzy rekombinowanymi szczepami C. glutamicum z tym samym genem p4hD, mimo że niektóre szczepy miały lepszą wydajność enzymatyczną i produkcję proliny.

Użycie rekombinowanych szczepów do bezpośredniej syntezy trans-Hyp z glukozy poprzez fermentację zostało osiągnięte, ponieważ zarówno enzymy jak i prekursory potrzebne w procesie były dostępne. Nadekspresja obcych trans-P4Hs katalizowała hydroksylację L-proliny w pozycji trans-4, podczas gdy 2-ketoglutaran był dostarczany przez glukozę w cyklu TCA, a następnie oksydacyjnie dekarboksylowany do bursztynianu (Rysunek 1). Doniesiono, że prolina była wymagana w produkcji Hyp przez rekombinowane E. coli tylko z genem p4h. Węgiel zawarty w prolinie dodanej podczas fermentacji przepływał tylko do aminokwasów syntetyzowanych z intermediatów cyklu TCA, a nie do glukoneogenezy. Jednakże, nagromadzony Hyp był na stosunkowo wysokim poziomie nawet bez dodatku proliny w tym badaniu. Można więc zrozumieć, że Corynebacterium posiada silną ścieżkę biosyntezy proliny. Ścieżka biosyntezy proliny została również zidentyfikowana u E. coli, co może przyczynić się do syntezy trans-Hyp przez rekombinowane szczepy E. coli. Modyfikacja szlaku proliny w E. coli zwiększyła wydajność Hyp, podczas gdy tworzenie Hyp może również złagodzić inhibicję sprzężenia zwrotnego proliny. Ilość proliny (0-4 mM) promowała produkcję trans-Hyp. Jednak ciągły dodatek L-proliny nie poprawiał znacząco wydajności produkcji (Tabela 2). W tym badaniu czas hodowli był znacznie krótszy niż podawany w literaturze, co można przypisać różnym zastosowanym podłożom, a także wskazywało na duży potencjał przy optymalizacji. W rzeczywistości, 2,28 g/L trans-Hyp zostało wyprodukowane przez rekombinowane E. coli bez dodatku L-proliny w kolbach z niewielką modyfikacją podłoży i 6,72 g/L zostało osiągnięte przez dodanie tylko 4 mM L-proliny.

W celu dalszego zwiększenia biosyntezy trans-Hyp przez rekombinowane C. glutamicum i E. coli, należy również rozważyć alternatywne podejścia. W E. coli, degradacja proliny powinna być przezwyciężona. Chociaż produkcja trans-Hyp przez mutanta putA E. coli nie uległa dalszej poprawie, wydajność oparta na wykorzystanej prolinie została znacznie zwiększona. Zarówno w C. glutamicum jak i w E. coli, ekspresja rekombinowanej P4H jako jednej z oksygenaz jest zaangażowana w fizjologiczny metabolizm komórek gospodarza, włączając w to kofaktor, współsubstrat i tlen. Ponadto, bez silnego szlaku syntetycznego proliny w E. coli, dostępność i transport substratu poważnie ograniczy transformację.