Abstract
Background. Białko ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (ABCD1) jest peroksysomalnym półtransporterem, który umożliwia degradację kwasów tłuszczowych o bardzo długich łańcuchach (VLCFA). Patogenne warianty ABCD1 powodują odkładanie się VLCFA w różnych tkankach i płynach ustrojowych, co prowadzi do zaburzenia zwanego adrenoleukodystrofią sprzężoną z chromosomem X (X-ALD). Zaburzenie to najczęściej charakteryzuje się niewydolnością kory nadnerczy i wysokim stężeniem VLCFA, a w zależności od fenotypu ma różny stopień zaangażowania neurologicznego. Na przykład, postać X-ALD związana tylko z Addisonem nie ma wpływu na układ neurologiczny, podczas gdy postać mózgowa X-ALD często powoduje poważną utratę czucia, upośledzenie funkcji motorycznych, pogorszenie funkcji poznawczych i śmierć. Metody. Nowo scharakteryzowany i podejrzewany o patogenność wariant w ABCD1 został przeanalizowany przy użyciu naszej platformy informatyki białkowej (PIP). Spersonalizowane badania molekularne na poziomie białek zostały zakończone na danych z badań genetycznych, uzupełniając analizę i badania kliniczne. Wyniki. Przedstawiono przypadek adrenomieloneuropatii o początku u dorosłych (AMN) oraz nowy wariant ABCD1. Omówiono unikalne białko ABCD1, a przypadek probantki porównano z istniejącymi doniesieniami na temat AMN. Wnioski. Fuzja danych z wielu źródeł została połączona w kompleksowe podejście dające wzbogaconą ocenę choroby i rokowania pacjenta. Przeprowadzono modelowanie molekularne wariantu w celu lepszego scharakteryzowania jego znaczenia klinicznego i potwierdzenia patogenności.
1. Wprowadzenie
Białko ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (ABCD1) jest częścią nadrodziny transporterów ATP-binding cassette, która składa się z białek transmembranowych odpowiedzialnych za przekazywanie lipidów, metabolitów i innych cząsteczek pomiędzy komórkami lub strukturami wewnątrzkomórkowymi. Jest on kodowany przez ABCD1, gen zlokalizowany na Xq28 . ABCD1 jest peroksysomalnym półtransporterem, który importuje bardzo długołańcuchowe kwasy tłuszczowe (VLCFA) do peroksysomu poprzez wiązanie ATP. Dysfunkcyjny ABCD1 nie jest w stanie przenieść VLCFA do peroksysomu w celu ich degradacji, co skutkuje akumulacją VLCFA w płynach ustrojowych i tkankach. Ten nieprawidłowy poziom VLCFAs służy jako charakterystyczny biomarker adrenoleukodystrofii sprzężonej z chromosomem X (X-ALD), najczęstszego zaburzenia peroksysomalnego. X-ALD jest chorobą genetyczną związaną głównie z demielinizacją, neurodegeneracją i niewydolnością kory nadnerczy. Zanotowano ponad 800 wariantów w obrębie genu ABCD1. Mimo to nie zaobserwowano wyraźnych korelacji genotyp-fenotyp .
Hemizygotyczne samce zazwyczaj wykazują najbardziej znaczące objawy, podczas gdy heterozygotyczne samice często rozwijają mniejszy stopień niepełnosprawności w późniejszym okresie życia . Trzy klasyczne fenotypy to choroba Addisona-only, adrenomieloneuropatia (AMN) i mózgowa ALD. Osoby z postacią tylko choroby Addisona zwykle prezentują się z niewydolnością kory nadnerczy między 2 a 7 rokiem życia. Zwyrodnienie neurologiczne nie jest obecne początkowo, ale często rozwija się wraz z wiekiem. AMN zazwyczaj pojawia się w trzeciej lub czwartej dekadzie życia i dotyczy głównie rdzenia kręgowego. Klinicznym objawem choroby jest często postępująca sztywność i osłabienie kończyn dolnych. Niewydolność nadnerczy stwierdza się u około 2/3 pacjentów z AMN, a zmiany mózgowe dotyczą około połowy z nich. Mózgowa ALD jest najcięższym fenotypem, w którym demielinizacja mózgu powoduje szybkie pogorszenie słuchu, wzroku, funkcji motorycznych i poznawczych. Najczęściej spotykana u dzieci lub nastolatków, ta odmiana X-ALD często prowadzi do śmierci w ciągu 2-4 lat od wystąpienia objawów.
W niniejszym raporcie opisano historię probanda, u którego w latach trzydziestych rozpoznano AMN. Analiza molekularna genu ABCD1 zidentyfikowała wariant o niepewnym znaczeniu w obrębie tego osobnika. Co ciekawe, wariant ten został zgłoszony jako patogenny w ALD Mutation Database, ale informacje dotyczące przypadku klinicznego nie zostały opublikowane. Przypadek kliniczny naszego probanta został dołączony w celu lepszego poparcia patogenności tego wariantu ABCD1. Platforma informatyki białkowej (PIP) została wykorzystana do kompleksowego modelowania molekularnego w celu dalszego scharakteryzowania znaczenia tego wariantu i wyjaśnienia diagnozy pacjenta.
2. Opis przypadku (opis kliniczny)
Pacjent był 31-letnim mężczyzną, który zgłosił się do oceny postępującego stanu neurologicznego. Symptomy tego stanu pojawiły się po raz pierwszy 2 lata temu, kiedy probant zaczął coraz częściej potykać się. Później doświadczał uogólnionego osłabienia i sztywności mięśni, wraz z dalszą dysfunkcją chodu. Aby temu przeciwdziałać, przez ostatnie 7 miesięcy probant używał chodzika, który pomagał mu w poruszaniu się. Rozwinęło się u niego również nietrzymanie moczu. Co więcej, zgłaszał zamroczenie mózgu, utratę pamięci, deficyty uwagi, niepokój i zmęczenie. W rezultacie wykonywanie podstawowych zadań umysłowych zajmowało mu więcej czasu. Według probanta, używanie alkoholu nasilało te deficyty. Wreszcie, probant stracił 20 funtów od początku choroby i nie był w stanie odzyskać wagi pomimo wspólnych wysiłków, aby to zrobić. Ta utrata wagi była częściowo spowodowana objawami nudności i wymiotów, które najczęściej występowały rano.
Podczas badania fizykalnego, probant nie był w stanie podnieść się z pozycji siedzącej bez użycia rąk. Stwierdzono łagodną dyzartrię ataksyjną. Testy fiksacji wzroku ujawniły rzadkie szarpnięcia fali kwadratowej. Płynne dążenia były sakkadowe, a pacjent demonstrował powolne, pełne sakkady zarówno w pionie, jak i w poziomie. Odruchy rozciągowe były patologicznie szybkie w kończynach górnych. Proband miał również patologicznie szybkie mitotyczne odruchy rozciągowe w kończynach dolnych, w tym utrzymujący się klonus w kostkach. Występowała umiarkowanie upośledzona propriocepcja wielkich palców stóp. Łagodne osłabienie dystrybucji górnego neuronu ruchowego było widoczne w kończynach dolnych z oszczędzeniem mięśni biodrowo-piszczelowych. Test „od pięty do grzbietu” ujawnił dyssynergię. Podczas chodzenia badany patrzył na swoje stopy i poruszał się ze zmniejszonym krokiem. Jego kolana były nadmiernie ugięte, miał tendencję do chodzenia na palcach, a czasami ślizgał się na stopach. Obecny był objaw Romberga. Podczas stania, w nogach występowały ruchy drżące – głównie w mięśniu czworogłowym. Proband obracał się o 360 stopni w ciągu 3 prób, co wymagało od 9 do 15 kroków na obrót. Jego odruchy posturalne były nieprawidłowe, a test „Ciągnięcia” wynosił -3.
MRI mózgu był prawidłowy, a MRI kręgosłupa szyjnego ujawnił wyniki sugerujące łagodny, rozproszony zanik rdzenia kręgowego. Nie było dowodów na podostre zwyrodnienie mieszane lub inną nabytą chorobę rdzenia kręgowego (ryc. 1). Był leczony z powodu choroby z Lyme, ponieważ jego miano IgM z Lyme było dodatnie, ale nie odnotowano znaczącej poprawy. Jego płyn mózgowo-rdzeniowy był opisany jako bezkomórkowy. Badania w kierunku HIV, HTLV1, zapalenia wątroby typu C, zapalenia wątroby typu B i wirusa cytomegalii dały wynik negatywny. Nie udało się ustalić historii rodzinnej podobnych objawów, ponieważ wiedza probanta na temat ich historii chorób była ograniczona (Rycina 2).
Po poprzednich badaniach i obrazowaniu uzyskano profil peroksyzomalnych kwasów tłuszczowych probanta. Stwierdzono nieprawidłowe stężenia C26 : 0, C24/C22 i C26/C22, co sugerowało hemizygotyczność dla adrenomieloneuropatii typu X. Poziom hormonu adrenokortykotropowego wynosił 528 pg/mL (RR: 7,2-63). Następnie przeprowadzono sekwencjonowanie i analizę delecji/duplikacji genu ABCD1. Pacjent był hemizygotyczny dla wariantu o niepewnym znaczeniu w ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Wariant ten nie był obecny w internetowej bazie danych ExAC, chociaż był wymieniony jako patogenny w ALD Mutation Database. Dwa podobne warianty, c.1596A>G (p.Lys533Glu) i c.1598A>G (p.Lys533Arg), również zostały wcześniej zgłoszone jako klinicznie istotne .
3. Metody
3.1. Modelowanie strukturalne
Sekwencja ludzkiego ATP-binding cassette subfamily D member 1 (znanego jako ABCD1) jest prawdopodobnie białkiem transporterowym, które ma region wiążący nukleotydy z fałdem, który może działać jako podjednostka wiążąca ATP z aktywnością ATPazy. Wiadomo, że do utworzenia aktywnego transportera wymagana jest prawidłowa dimeryzacja. ABCD1 jest członkiem podrodziny ALD, która bierze udział w peroksysomalnym imporcie kwasów tłuszczowych do organelli. Te peroksysomalne transportery ABC są „półtransporterami”, co oznacza, że wymagają partnerskiej cząsteczki półtransportera – forma funkcjonalna jest zawsze homodimeryczna lub heterodimeryczna. Przyjmuje się, że ABCD1 jest kluczem do peroksysomalnego transportu lub katabolizmu bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Wiadomo, że ABCD1 oddziałuje z PEX19, a kodowany jest przez gen ABCD1, który został pobrany z NCBI Reference Accession Sequence: NP_000024: version NP_000024.2, który jest zakodowany dla sekwencji aminokwasowej; i został użyty do modelowania wspomaganego komputerowo. Symulacje Monte Carlo zostały przeprowadzone na mutancie, aby umożliwić lokalne zmiany regionalne dla pełnej długości 745 aminokwasów.
Rafinacja rentgenowska dla Monte Carlo została zbudowana przy użyciu metody YASARA SSP/PSSM . Struktura została zrelaksowana do pola siłowego YASARA/Amber przy użyciu potencjałów opartych na wiedzy w YASARA. Łańcuchy boczne i rotamery zostały dopasowane za pomocą potencjałów opartych na wiedzy, symulowanego wyżarzania z jawnym rozpuszczalnikiem i małych symulacji równoważenia przy użyciu protokołu rafinacji YASARA. Modelowano całą strukturę o pełnej długości, wypełniając wszelkie luki lub nierozwiązane fragmenty pochodzące z badań rentgenowskich.
Rafinacja sfinalizowanych modeli została zakończona przy użyciu modułu Schrodingera LC-MOD Monte Carlo lub protokołów NAMD2. Te rafinacje rozpoczynały się od wygenerowanego przez YASARA wstępnego rafinowania i wariantu . Superpozycja i kolejne rafinacje nakładających się regionów dały kompletny model dla ABCD1. Końcowe struktury zostały poddane optymalizacji energetycznej za pomocą gradientu sprzężonego PR z dielektrykiem zależnym od R.
Spójność atomowa została sprawdzona dla wszystkich 745 aminokwasów (12 201 atomów) pełnometrażowego modelu typu dzikiego (WT) i 745 aminokwasów (12 221 atomów) dla wariantu, weryfikując poprawność nazwy łańcucha, diedrogramów, kątów, skręceń, wiązań, elektrostatyki, typowania atomów i parametrów. Przewidywany jest model dimeru, który składa się z 24 402 atomów, w tym kofaktorów i jonów. Każdy model został wyeksportowany do następujących formatów: Maestro (MAE), oraz YASARA (PDB). Manipulacja modelem odbywała się za pomocą programu Maestro (Macromodel, wersja 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010) lub Visual Molecular Dynamics (VMD) . Analizy zostały podkreślone na N-terminus regionu zawierającego pierwsze 350 aminokwasów, biorąc pod uwagę długość i C-term odległość od miejsca mutacji.
Monte Carlo dynamics searching (hybrid MC lub poprzez wzmocnienie MDS sampling) został zakończony na każdym modelu dla konformacyjnego próbkowania, przy użyciu metod wcześniej opisanych w literaturze . Krótko mówiąc, każdy system wariantu ABCD1 został zminimalizowany z rozluźnionymi ograniczeniami przy użyciu albo Steepest Descent lub Conjugate Gradient PR, a następnie pozwolono mu przejść kryteria wyszukiwania MC, jak pokazano w literaturze . Podstawowym celem MC, w tym scenariuszu, jest zbadanie wszelkich zmienności konformacyjnych, które mogą wystąpić z różnymi mutacjami w regionie w pobliżu mutacji i możliwego wpływu na wiązanie DNA lub przetwarzanie z ABCD1.
4. Wyniki
4.1. Structure-Function Studies
Dla WT versus wariant p.K533E, stwierdziliśmy, że stabilność obiektu z obliczeń energetycznych dla ΔG na aminokwas pozostaje względnie taka sama, tak że WT ma stabilność obiektu 114.67 kcal/mol∗Å2. Wariant p.K533E powoduje wzrost netto energii swobodnej o 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, co może być destabilizujące dla lokalnego regionu. Ta stabilność obiektu była pozytywna, wskazując, że pewne dynamiczne zmiany są prawdopodobne z symulacją molekularną dla próbkowania konformacyjnego. Tak więc zbadaliśmy lokalne pozostałości i ustaliliśmy, że obliczenia elektrostatyczne mogą być przydatne do wyjaśnienia zmiany funkcji. Model molekularny dla pełnej struktury i jej formy wariantowej jest podany (Rysunek 3(a)) przy użyciu naszych najnowocześniejszych metod, które zostały ustanowione . Model dimeryczny jest krytyczny dla funkcji i pokazuje ważne interakcje w miejscu mutacji, które są zaburzone przez mutację wariantową.
Lokalne reszty w obrębie 12 Å cutoff w pobliżu miejsca wariantu (p.K533E) obejmują reszty z obu monomerów. Monomer zawierający wariant (monomer 1, szare karbony) ma następujące pobliskie reszty z interakcjami w pozycji 533: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 i K624 (Rysunek 3(b)). Ten wariant struktury (p.Lys533Glu) został przeanalizowany i wykazano bardziej bezpośrednie zaburzenie lokalnego środowiska z dodatniego ładunku lizyny (+) przerzucającego się na ujemny kwasu glutaminowego (-), co było dość destrukcyjne dla sąsiednich naładowanych reszt (powyżej). W szczególności, reszty K624, E499 i Y532 znajdują się w różnych interakcjach (Rysunek 3(b)). Lokalne ΔG dla każdego aminokwasu zwiększa wartość dodatnią netto, co odpowiada niekorzystnej stabilności w kieszeni, a do określenia ogólnego efektu potrzebna byłaby dłuższa dynamika, ale można się spodziewać, że będzie ona destabilizująca. Reszta K533E ma interesujące interakcje z Q472, I474, I475 i E499. K533E znajduje się w regionie helisa-helisa, gdzie jej naładowany łańcuch boczny jest ustawiony na zewnątrz w stosunku do przeciwnie naładowanych cząsteczek; występuje również pewne oddziaływanie helisa-helisa z sąsiednimi helisami (Rysunki 3(b) i 3(c)). Te same reszty są zaangażowane w wariant, ale pozycja jest zmieniona dla kilku reszt, w tym P534, P535 i K624 (Rysunek 3(c)). Ta interakcja może odpowiadać za zmienioną funkcję ze względu na zmianę zachowania dynamicznego dla lokalnej stabilności strukturalnej (Rysunek 3(c)). Obliczenia elektrostatyczne zostały zakończone w celu dalszej analizy (Rysunek 4). W szczególności, reszty K624, E499 i Y532 są umieszczone w różnych interakcjach (Rysunek 3(b)). Lokalne ΔG na aminokwas zwiększa wartość dodatnią netto, co odpowiada niekorzystnej stabilności w kieszeni. Aby określić ogólny efekt potrzebna byłaby dłuższa dynamika, ale można się spodziewać, że będzie ona destabilizująca.
4.2. Efekty tworzenia dimerów
Mapowanie elektrostatyki zostało wykonane przy użyciu obliczeń Poissona-Boltzmanna dla solwatacji na całej strukturze 745 aminokwasów. Efekty zmian były silnie zaznaczone na rozkładzie elektrostatycznym z wartością odcięcia +3 KT/E dla obu. Cząsteczka WT (wszystkie 745 aa) wykazuje wyraźny rozkład ładunku wokół K533, który pokazuje kilka ujemnie naładowanych regionów i duże neutralne kieszenie ze względu na bogate reszty hydrofobowe znajdujące się we wspomnianych wyżej heliksach. Mutacja treoninowa wydaje się zmieniać rozkład ładunków i umieszcza pozycje dla ładunków ujemnych dalej od siebie, jednocześnie zwiększając rozmiar regionów neutralnie naładowanych (Rysunki 4(a) i 4(b)). Lokalny region p.K533E jest naładowany w celu dopasowania dodatniej reszty lizynowej do sąsiednich reszt kwasu glutaminowego (w obrębie 6 Å) (Rysunek 4(b)). I odwrotnie, reszty K533 mają ładunki dodatnie, na które wpływają reszty w obrębie 6 Å, a mianowicie E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 i K624 (Figura 4(a)). Wariant p.K533E nie wydaje się mieć żadnego wpływu na sam dimer (Rysunki 3 i 4), ponieważ wariant ten znajduje się dystalnie od interfejsu między monomerami. Jednakże, występują znaczne zaburzenia w lokalnym sąsiedztwie, gdzie lizyna jest naturalnie wprowadzona do kieszeni z pobliskimi resztami, które są przeciwnie naładowane i angażują się w wiązania H i interakcje mostków solnych, co jest tracone wraz z ujemnym ładunkiem z podstawienia kwasu glutaminowego (Rysunek 3).
5. Dyskusja
Dla pacjentów z AMN, opcje leczenia są obecnie ograniczone. Jednakże, ostatnie badania z modelami mysimi stanowią potencjalne rozwiązanie. U pacjentów z X-ALD, nagromadzenie VLCFAs towarzyszy zwiększony poziom radykalnych form tlenu. Rodniki te napędzają postęp choroby, uszkadzając tkanki i ostatecznie powodując wystąpienie objawów neurologicznych. Myszy z analogami X-ALD były z powodzeniem leczone mieszanką antyoksydantów, co pozwoliło na opanowanie poziomu rodników i zatrzymanie tego patogennego procesu. Jeśli późniejsze próby okażą się obiecujące, możliwe jest, że nasz probant i inni pacjenci z AMN będą pewnego dnia leczeni w podobny sposób.
Chociaż nasz probant prezentował słabo rozumiany wariant w ABCD1, jego przypadek nie różnił się znacząco od typowego fenotypu AMN. Objawy zaczęły się u niego w późnych latach dwudziestych, co mieści się w oczekiwanym przedziale wiekowym od 20 do 40 lat. AMN zwykle wiąże się z zajęciem rdzenia kręgowego, co zostało potwierdzone w badaniach MRI probanta. Jego osłabienie nóg i zaburzenia chodu są charakterystyczne dla tej choroby, podobnie jak nietrzymanie moczu. Wymioty i mdłości są związane z niewydolnością nadnerczy, podczas gdy zaburzenia mowy i myślenia probanta mogą być związane ze zmianami w mózgu. Mimo to należy stwierdzić, że u pacjenta z tym samym wariantem ABCD1, który występuje u naszego probanta, mogą występować inne objawy. Patogenne warianty w ABCD1 rzadko powodują przewidywalne fenotypy – nawet gdy identyczna wersja jest posiadana przez członków rodziny .
Informatyka białkowa pochodząca z obliczeń mechaniki statystycznej zastosowana do modelowania molekularnego dla wariantów w porównaniu z dzikim typem daje nam wyraźne wskazanie na dysfunkcję normalnego zachowania białka na poziomie molekularnym, który miałby wpływ na funkcję. Na przykład, stwierdziliśmy, że wariant p.K533E powoduje wzrost netto energii swobodnej o 2.321 kcal/aamolÅ2, co destabilizuje lokalny region w obrębie 12 Å od reszty K533. Ze względu na lokalną zmianę strukturalną złagodzoną przez reszty szkieletowe i zmiany interakcji w strukturze drugorzędowej (sieć wiązań H nie pokazana) pozwalają skorelowanemu ruchowi rozprzestrzeniać się w całej strukturze, co dodatkowo utrudnia prawidłowe tworzenie dimeru.
Dzięki rzadkości wariantu ABCD1 naszego probanta, komercyjne laboratorium nie było w stanie pewnie nazwać wariantu patogennym. Dodatkowo, wyzwania logistyczne i mały rozmiar rodziny probanta sprawiły, że analiza segregacji rodzinnej była niepraktyczna. W rezultacie proces ten nie mógł zostać ukończony, aby pomóc nam lepiej zrozumieć znaczenie jego wariantu. Na szczęście, modelowanie molekularne dało nam kolejną szansę. Modelowanie molekularne białek potwierdziło podejrzenia, że ten wariant może wpływać na funkcję białek w sposób istotny klinicznie. Nie było żadnych podejrzeń, że ten wariant nie zostałby sklasyfikowany jako patogenny, biorąc pod uwagę poważną zmianę struktury, co zostało silnie poparte analizą PIP.
6. Wnioski
Podsumowując, opisujemy przypadek probanda z rzadkim wariantem w ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Brak informacji na temat tego wariantu uniemożliwił firmie wykonującej badania genetyczne sklasyfikowanie jego wariantu jako patogennego, ale ładunki molekularne wydają się wskazywać, że ten region białka jest znacząco zaburzony z równowagi (Rysunek 3(b)). Wykorzystanie modelowania białka dostarczyło również informacji do włączenia w szerszy obraz kliniczny probanta. Dodatkowo, jeden przypadek patogenności tego wariantu jest wymieniony w Bazie Danych Mutacji ALD. Łącznie, dowody te pozwoliły na pewną diagnozę AMN. Nasz probant miał typowe objawy AMN, ale zmienność fenotypowa właściwa dla ABCD1 może skutkować inną prezentacją X-ALD u innych osób posiadających ten wariant.
Skróty
| ABCD1: | Kaseta wiążąca ATP, podrodzina D, członek 1 (gen) |
| VLCFA: | Bardzo długołańcuchowe kwasy tłuszczowe |
| X-ALD: | Adrenoleukodystrofia związana z czynnikiem X |
| AMN: | Adrenomieloneuropatia. |
Dostępność danych
Zestawy danych i materiały są wyszczególnione w manuskrypcie.
Zgoda
Wszystkie stosowane procedury były zgodne z normami etycznymi odpowiedzialnej komisji ds. eksperymentów na ludziach (instytucjonalnej i krajowej) oraz z Deklaracją Helsińską z 1975 roku, zmienioną w 2000 roku (5). Od wszystkich pacjentów uzyskano świadomą zgodę na włączenie do badania.
Konflikty interesów
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktów interesów.
Wkład autorów
Wszyscy powyżsi autorzy wnieśli znaczący wkład w koncepcję lub projekt pracy; lub w nabycie, analizę lub interpretację danych dla pracy ORAZ sporządzenie pracy lub jej krytyczną rewizję w celu uzyskania ważnej zgody intelektualnej ORAZ wydali ostateczne zatwierdzenie wersji do publikacji ORAZ zgodzili się ponosić odpowiedzialność za wszystkie aspekty pracy w zapewnieniu, że kwestie związane z dokładnością lub integralnością jakiejkolwiek części pracy są odpowiednio zbadane i rozwiązane.
Funding
Funding was provided by the Center for Individualized Medicine, Mayo Clinic who provided funds to complete this study.
Acknowledgment
TC dziękuje Center for Individualized Medicine w Mayo Clinic Jacksonville za wsparcie badawcze.
.