- Abstract
- 1. Wstęp
- 2. Materiały i Metody
- 2.1. Subjects
- 2.2. Pobieranie próbek krwi
- 2.3. Ekstrakcja komórek jednojądrowych krwi obwodowej (PBMC)
- 2.4. Ekstrakcja RNA i synteza cDNA
- 2.5. Primer Design
- 2.6. Evaluation of the Serum Biochemical Factors
- 2.7. Analiza i Interpretacja Wyników
- 3. Wyniki
- 3.1. Wyniki qRT-PCR
- 3.2. Ocena ekspresji genów w PBMC
- 4. Dyskusja
- Konflikt interesów
- Podziękowania
Abstract
Geny ABCA1 i ABCG1 kodują białka transportera cholesterolu, które odgrywają kluczową rolę w homeostazie cholesterolu i fosfolipidów. Celem pracy była ocena i porównanie ekspresji genów ABCA1 i ABCG1 u pacjentów z zespołem metabolicznym i osób zdrowych. Badanie typu case-control przeprowadzono na 36 pacjentach z zespołem metabolicznym i takiej samej liczbie osób zdrowych w Hamadan (zachód Iranu) w latach 2013-2014. Całkowity RNA został wyekstrahowany z komórek jednojądrzastych i oczyszczony przy użyciu kolumny RNeasy Mini Kit. Ekspresję genów ABCA1 i ABCG1 przeprowadzono metodą qRT-PCR. Profil lipidowy i stężenie glukozy we krwi na czczo mierzono metodą kolorymetryczną. Ekspresja ABCG1 u pacjentów z zespołem metabolicznym była istotnie niższa (o około 75%) w porównaniu z grupą kontrolną, natomiast dla ekspresji ABCA1 nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy obiema badanymi grupami. Porównanie pozostałych parametrów, takich jak HDL-C, FBS, BMI, obwód talii oraz skurczowe i rozkurczowe ciśnienie tętnicze pomiędzy pacjentami z zespołem metabolicznym a osobami zdrowymi wykazało istotne różnice (). Zmniejszenie ekspresji ABCG1 u pacjentów z zespołem metabolicznym w porównaniu z osobami zdrowymi sugeruje, że hiperglikemia, związane z nią metabolity oraz hiperlipidemia ponad pojemność transportera spowodowały zmniejszenie ekspresji ABCG1. Brak istotnej zmiany w ekspresji genu ABCA1 pomiędzy dwiema grupami może wskazywać na inny mechanizm regulacji ekspresji ABCA1.
1. Wstęp
Zespół metaboliczny (MetS) jest definiowany jako zespół wzajemnie powiązanych czynników ryzyka cukrzycy i chorób sercowo-naczyniowych (CVD) . Istnieją pewne kryteria klinicznego rozpoznania zespołu metabolicznego, które obejmują podwyższony obwód talii (≥102 cm u mężczyzn i ≥88 cm u kobiet), podwyższone stężenie triglicerydów (≥150 mg/dl lub 1.7 mmol/L), obniżone stężenie cholesterolu lipoproteinowego o wysokiej gęstości (HDL-C <40 mg/dL lub 1,03 mmol/L u mężczyzn i <50 mg/dL lub 1,3 mmol/L u kobiet) i podwyższone ciśnienie krwi (≥130 mm Hg skurczowe ciśnienie krwi lub ≥85 mmHg rozkurczowe ciśnienie krwi). MetS można rozpoznać na podstawie obserwacji trzech z tych kryteriów. W ciągu ostatnich kilku lat częstość występowania MetS wzrosła na całym świecie, jednak w Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej zmniejszyła się z 25,5% w latach 1999/2000 do 22,9% w latach 2009/2010. Weiss i współpracownicy stwierdzili, że otyłość jest bezpośrednio związana ze zwiększoną częstością występowania MetS. Istnieje odwrotna zależność między CVD a poziomem HDL-C w osoczu, jednym z kryteriów zespołu metabolicznego. Lipoproteina o wysokiej gęstości, subfrakcja lipoprotein krążenia, odgrywa ważną rolę w transporcie cholesterolu z tkanek obwodowych do komórek wątroby. HDL jest bogata w białka Apo A-I i Apo A-II, a ponad dwie trzecie jej zawartości stanowi Apo A-I.
Transportery transmembranowe ABC odgrywają ważną rolę w wychwycie cholesterolu z makrofagów do HDL i zmniejszają powstawanie komórek piankowatych. ABCA1 składa się z 2261 aminokwasów i występuje w większości tkanek. W ostatnich latach wykazano, że ABCA1 odgrywa istotną rolę w ochronie przed chorobami układu sercowo-naczyniowego. Synteza HDL zależy bezpośrednio od aktywności ABCA1 w komórkach wątroby, co oznacza, że pełni on kluczową funkcję w ochronie komórek tętniczych przed powstawaniem komórek piankowatych poprzez zwiększanie stężenia HDL w osoczu. Aktywność ABCA1 makrofagów tętniczych wykazała odwrotne skojarzenie z tworzeniem komórek piankowatych, ponieważ wraz ze wzrostem jej aktywności tworzenie komórek piankowatych będzie się zmniejszać .
Zmniejszona lub upośledzona aktywność ABCA1 może powodować niektóre choroby, takie jak cukrzyca typu 2, choroba Tangeru i przedwczesne CVD .
ABCG1 gen znajduje się na chromosomie 21q22.3 . Zarówno ABCA1 jak i ABCG1 prowadzą do redukcji cholesterolu tkankowego poprzez jego odpływ do HDL, ale ABCG1 transportuje cholesterol tkankowy do HDL2 i HDL3, a ABCA1 transportuje go do pozbawionego lipidów Apo A-I. Makrofagi są najważniejszą tkanką działania ABCA1 i ABCG1. W wielu badaniach badano efekty upregulacji i downregulacji tych genów.
Zmniejszony odpływ cholesterolu jest konsekwencją braku ekspresji ABCA1 in vitro, może to prowadzić do wzrostu miażdżycy, ale upregulacja ABCA1 powoduje zmniejszenie miażdżycy. Obniżenie ekspresji ABCG1 również ma taki sam wpływ na odpływ cholesterolu, ale istnieją kontrowersyjne wyniki dotyczące wpływu obniżenia ekspresji ABCG1 na miażdżycę .
W MetS, wzorce ekspresji niektórych genów zmieniają się i mogą prowadzić do otyłości, cukrzycy i nadciśnienia. W obecnym badaniu, mieliśmy na celu ocenę ekspresji genów ABCA1 i ABCG1 u pacjentów z MetS, ponieważ geny te są zaangażowane w syntezę transporterów, które mają kluczową rolę w transporcie cholesterolu.
2. Materiały i Metody
2.1. Subjects
This case-control study was carried out on patients that were referred to an endocrinology ward in a hospital in Hamadan (west of Iran) during 2013-2014. Wyselekcjonowano trzydziestu sześciu pacjentów z zespołem metabolicznym. Jako grupę kontrolną wybrano również 36 zdrowych osób dobranych pod względem wieku i płci. Żadna ze zdrowych osób nie spełniała kryteriów zespołu metabolicznego.
Kryterium włączenia do grupy z zespołem metabolicznym było posiadanie trzech z pięciu wyżej wymienionych cech. Z badania wykluczono pacjentki, które w wywiadzie przyjmowały leki przeciwlipidowe, antykoncepcyjne i moczopędne. Pacjenci w ciąży oraz pacjenci z cukrzycą, stanami zapalnymi i infekcjami również zostali wykluczeni.
2.2. Pobieranie próbek krwi
Próbka krwi o objętości 2,5 mL od każdego uczestnika badania została dodana do probówki zawierającej EDTA i była przechowywana w temperaturze 4°C do ekstrakcji RNA (nie dłużej niż dwie godziny później).
2.3. Ekstrakcja komórek jednojądrowych krwi obwodowej (PBMC)
Do izolacji PBMC użyto roztworów Limfodex (Niemcy) i Henx (Iran). Około 2 mL roztworu Henx dodano do równej objętości krwi i całkowicie wymieszano; następnie ostrożnie i powoli wlano do 3 mL roztworu Lymphodex. Następnie mieszaninę umieszczono na Lymphodexie i wirowano przy 1000 g przez 20 minut. Pośrednią białą warstwę pomiędzy osoczem a Lymphodexem izolowano jako komórki jednojądrowe (MCs); następnie do MCs dodawano bufor Henxa, mieszano całkowicie i odwirowywano. Wreszcie, supernatant został odrzucony, a proces powtórzono jeszcze raz.
2.4. Ekstrakcja RNA i synteza cDNA
Siatkowa ekstrakcja RNA została przeprowadzona przy użyciu zestawu Gene JET RNA Purification zgodnie z protokołem producenta. Jakość i ilość oczyszczonego RNA analizowano przy użyciu NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA); następnie integralność każdej próbki RNA badano przy użyciu 1% żelu agarozowego, 1x TBE.
RNA przekształcono w cDNA przy użyciu zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622), postępując zgodnie z protokołem: krok 1: annealowanie primera w 25°C przez 5 min; krok 2: synteza cDNA w 42°C przez 60 min; krok 3: inaktywacja termiczna w 70°C przez 5 min. Produkty przechowywano w temperaturze -80°C do następnych kroków.
2.5. Primer Design
Szczególne startery dla każdego genu zostały zaprojektowane przez oprogramowanie Allele ID (wersja 7.6). W celu zwiększenia specyficzności reakcji real-time PCR i redukcji wyników fałszywie pozytywnych, jedna z każdej pary starterów została zaprojektowana tak, aby była dołączona do obszaru połączenia Exon-Exon. Dokładne kryteria zastosowanych starterów dla poszczególnych genów przedstawiono w tabeli 1. Jako kontrolę wewnętrzną zastosowano gen houseekeeping 18S rRNA.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Względna ekspresja genów została obliczona poprzez pomiar wartości cyklu progowego (CT) dla każdej próbki przy użyciu termocyklera C1000 i systemu czasu rzeczywistego CFX96 (Bio-Rad, USA) oraz zestawu SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa nr RR820L). Jako wartość CT określono średnią wartość CT w trzech powtórzeniach dla każdej próbki. Składowe ilości do reakcji qRT-PCR zawierały 10 μL zieleni SYBR, 7 μL wody dejonizowanej i po 1 μL każdego z primerów forward, reverse primerów i szablonu. Reakcję qRT-PCR przeprowadzano w następujących warunkach: wstępna aktywacja w 95°C przez 30 s, a następnie powtarzano 40 cykli następujących etapów: denaturacja w 95°C przez 5 s, annealgacja w zoptymalizowanej temperaturze annealingu dla odpowiedniego czasu trwania każdego genu oraz przedłużanie w 72°C przez 30 s, a na końcu uzyskiwano dane zwiększając temperaturę z 72°C do 95°C o 0,5°C/0,05 s. Następnie produkty PCR poddawano elektroforezie (na 1% żelu agarozowym, 1x TBE) w celu weryfikacji specyficzności amplikonów.
2.6. Evaluation of the Serum Biochemical Factors
Dwumililitrowa próbka krwi została pobrana od każdego uczestnika i odwirowana przy 3000 rpm przez 10 min w celu oddzielenia surowicy. Cholesterol całkowity (TC), LDL-C, TG, FBS i HDL-C badano przy użyciu zestawu Pars Azmun (Iran) firmy Hitachi 911 (Niemcy).
2.7. Analiza i Interpretacja Wyników
formuła została użyta do analizy względnej ekspresji genów zespołu metabolicznego i grup kontrolnych. Wydajność real-time PCR obliczano dla każdego genu stosując rozcieńczenie 10-2; następnie otrzymaną liczbę umieszczano w następującym wzorze obliczeniowym do pomiaru zmian fałdowych ekspresji genów :Do analizy statystycznej z 95% przedziałami ufności użyto oprogramowania SPSS V.16. Rozkład normalny zmiennych sprawdzono metodą Kołmogorowa-Smirnowa, a następnie porównano wartości między dwiema grupami za pomocą testu prób niezależnych.
3. Wyniki
Charakterystykę demograficzną i czynniki biochemiczne badanych grup przedstawiono w tabeli 2. Stosunek mężczyzn do kobiet wynosił 1/3 w każdej grupie (12 M i 24 F). Jak wynika z tabeli 2, różnice we wszystkich badanych parametrach były istotne statystycznie pomiędzy dwiema grupami () z wyjątkiem wieku i LDL-C. Grupa z zespołem metabolicznym miała wyższe BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, ciśnienie tętnicze rozkurczowe/rozkurczowe oraz obwód talii w porównaniu z osobami zdrowymi, natomiast HDL-C był istotnie niższy w zespole metabolicznym.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| BMI: Body Mass Index; FBS: Fast Blood Sugar; TG: triglicerydy, HDL-C: cholesterol lipoproteinowy o wysokiej gęstości; LDL-C: cholesterol lipoproteinowy o niskiej gęstości; różnica istotna. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.1. Wyniki qRT-PCR
Po zakończeniu reakcji PCR wyniki weryfikowano poprzez analizę krzywej reakcji, krzywej topnienia produktów oraz elektroforezę produktów PCR. Elektroforezę prowadzono na 1% agarozie z użyciem drabinki DNA o długości 100 bp. Wyniki przedstawiono na rysunku 1.
3.2. Ocena ekspresji genów w PBMC
Poziomy ekspresji genów mierzono w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej i porównywano między dwiema grupami, obliczając ΔCT dla każdego genu. Nie było różnicy w ekspresji ABCA1 między dwiema grupami, ale ekspresja ABCG1 była znacząco niższa w grupie MetS (). Szczegółowe wyniki przedstawiono w tabeli 3.
|
||||||||||||||||||||||||||
| Znaczące. | ||||||||||||||||||||||||||
Wyliczenie fałdowej zmiany ekspresji ABCG1 () wskazało na 3,1-krotnie niższą ekspresję w grupie MetS.
4. Dyskusja
ABCA1 i ABCG1 odgrywają kluczową rolę w transporcie zwrotnym cholesterolu z tkanek obwodowych, takich jak makrofagi, do wątroby, jednak ekspresja genów ABCA1 i ABCG1 jest badana w niektórych chorobach; nie znaleźliśmy żadnego doniesienia na ten temat w zespole metabolicznym. W niniejszej pracy badaliśmy ekspresję tych genów u osób z zespołem metabolicznym oraz u osób zdrowych.
Pomimo braku istotnych różnic w ekspresji genu ABCA1 pomiędzy dwoma badanymi grupami, stwierdziliśmy istotnie niższą ekspresję (o około 75%) ABCG1 u osób z zespołem metabolicznym w porównaniu z grupą kontrolną. Singaraja i wsp. wykazali, że zmniejszona ilość ABCA1 w makrofagach i nerkach jest związana z podwyższoną zawartością cholesterolu. Stwierdzili, że upośledzony eksport cholesterolu przez ABCA1 może przyczyniać się do nasilenia miażdżycy i nefropatii związanej z cukrzycą. Istnieją doniesienia próbujące odpowiedzieć na pytanie o możliwe mechanizmy regulujące ekspresję tych genów. Ostatnio wykazano, że polimorfizmy w ABCA1 i ABCC8 mogą być związane z zespołem metabolicznym. Istnieją dowody wskazujące, że zaburzenie funkcji ABCA1, które może być wynikiem mutacji w tym genie, może prowadzić do rodzinnej hipoalfalipoproteinemii, która charakteryzuje się niskim poziomem HDL i zwiększonym odkładaniem estrów cholesterolu w kilku tkankach i komórkach. Wykazano również, że nadekspresja genu ABCA1 może zapewniać ochronę przed miażdżycą. Dane te są zgodne z naszymi odkryciami i wspierają ideę, że niższa ekspresja genu ABCA1 może przyczyniać się do powikłań zespołu metabolicznego.
Haghpassand i wsp. wykazali, że ekspresja genu ABCA1 w PBMCs ma bezpośredni związek z ładunkiem cholesterolu, a nadekspresja ABCA1 prowadzi do przeniesienia nadmiaru cholesterolu do apoprotein. Wang i wsp. badali odwrotny transport cholesterolu u myszy znokautowanych ABCA1 i ABCG1 i stwierdzili, że kiedy zarówno ABCA1, jak i ABCG1 zostały znokautowane, istnieje większy odwrotny transport cholesterolu w porównaniu do znokautowanego ABCG1 .
Since Mauerer i wsp. wskazali, że wysoki poziom glukozy (hiperglikemia) jest zaangażowany w zmniejszoną ekspresję ABCA1 i ABCG1 in vitro , logiczne wydaje się oczekiwanie podobnych zmian w MetS. Promotory ABCA1 i ABCG1 mają miejsce receptorowe dla LXR i RXR; gdy do tych czynników dołącza się oksycholesterol i kwas retinowy, ekspresja ABCA1 i ABCG1 jest zwiększona. Również cAMP i NFκB są czynnikami transkrypcyjnymi odpowiednio dla ABCA1 i ABCG1.
Uzyskane wyniki wskazują na istotne zmniejszenie ekspresji ABCG1 u pacjentów z zespołem metabolicznym w porównaniu z osobami zdrowymi. Wyniki te sugerują, że hiperglikemia, związane z nią metabolity oraz hiperlipidemia ponad pojemność transportera mogą prowadzić do zmniejszenia ekspresji ABCG1. Ponieważ nie zaobserwowano istotnych zmian w ekspresji genu ABCA1, może to wynikać z innego mechanizmu regulacji. Ponieważ struktury tych genów są różne i są one regulowane przez różne czynniki transkrypcyjne, nasze wyniki mogą być uzasadnione. Niemniej jednak, ograniczona liczba próbek w tym badaniu jest kolejnym czynnikiem braku zmian w ekspresji ABCA1.
Innym punktem jest to, że badaliśmy ekspresję tych genów w PBMC badanych osób; ważne jest, aby zauważyć, że zmiany w ekspresji tych genów w monocytach mogą być inne niż w innych kluczowych tkankach, takich jak wątroba i jelito, które są głównymi miejscami syntezy HDL. Ponadto zmiany w poziomie mRNA niekoniecznie oznaczają zmiany w powiązanym białku.
Konflikt interesów
Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została zaczerpnięta z pracy magisterskiej Zahry Tavoosi. Autorzy pragną podziękować Uniwersytetowi Medycznemu Hamadan za wsparcie finansowe tego badania.
.