Ponieważ dokładna kwantyfikacja białek jest niezbędna we wszystkich eksperymentach związanych z badaniami białek, opracowano różne metody pomiaru stężenia białek w danym teście. Niektóre z bardziej tradycyjnych metod ilościowego oznaczania białka całkowitego obejmują pomiar absorbancji UV przy 280 nm (A280), oznaczenia kwasu bicynchoninowego (BCA) i Bradforda oraz inne alternatywne metody, takie jak oznaczenie Lowry’ego i inne nowe oznaczenia.
Ponieważ białka absorbują światło przy określonej długości fali, pomiar można uzyskać za pomocą spektrofotometru. W szczególności, aminokwasy tyrozyna i tryptofan mają bardzo specyficzną absorpcję przy 280 nm, co pozwala na bezpośredni pomiar stężenia białka A280.
Absorpcja promieniowania UV przy 280 nm jest rutynowo stosowana do szacowania stężenia białka w laboratoriach ze względu na jej prostotę, łatwość użycia i przystępność. Pomiary są szybkie i wysoce powtarzalne, ponieważ nie ma potrzeby inkubacji. Ponadto, metoda ta wymaga również niezwykle małej objętości próbki, ponieważ nowoczesne spektrofotometry wykorzystują system zatrzymywania próbki podczas pomiaru.
Należy jednak zwrócić uwagę, aby upewnić się, że próbka białka nie zawiera żadnych składników niebiałkowych (np. kwasów nukleinowych) o tym samym widmie absorpcji, ponieważ może to prowadzić do błędnych wyników. Oprócz określania stężenia białka, wartości absorbancji mogą być również wykorzystywane w wykrywaniu zmian konformacyjnych i wiązania ligandów oraz do śledzenia reakcji enzymatycznych.
Wpływ tryptofanu i tyrozyny w kwantyfikacji białka
Dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu, białka i peptydy zawierające te aromatyczne aminokwasy absorbują światło UV o długości fali 280 nm. Każda z tych reszt ma odrębną długość fali absorpcji i emisji oraz różni się wydajnością kwantową. Fenyloalanina i wiązania disulfidowe również przyczyniają się do absorpcji przy tej długości fali, ale ponieważ jest ona stosunkowo nieistotna, można ją zaobserwować tylko przy braku zarówno tryptofanu, jak i tyrozyny.
Wiele enzymatycznych kofaktorów zawierających struktury pierścieni aromatycznych (np. FMN, FAD, NAD i porfiryny) również absorbuje światło UV w celu wzbudzenia i dlatego zwiększa intensywność powstającej fluorescencji. Specjalne białka, takie jak białko zielonej fluorescencji, mają również wewnętrzną sekwencję serynowo-glicynową, która jest modyfikowana potranslacyjnie i jest fluorescencyjna w obszarze światła widzialnego.
Tryptofan
Tryptofan jest znacznie bardziej fluorescencyjny niż tyrozyna i fenyloalanina. Jednakże jego właściwości fluorescencyjne są zależne od rozpuszczalnika, tj. widmo przesuwa się w kierunku krótszych długości fal i zwiększa intensywność wraz ze zmniejszaniem się polarności rozpuszczalnika. Jako takie, reszty tryptofanu pochowane w hydrofobowych domenach sfałdowanych białek wykazują przesunięcie widma o 10 do 20 nm.
Dzięki jego większej chłonności, wyższej wydajności kwantowej i rezonansowemu transferowi energii, widmo fluorescencji białka zawierającego te trzy aminokwasy zwykle przypomina widmo tryptofanu.
Tyrozyna
Tyrozyna może być wzbudzana przy długości fali podobnej do tryptofanu, ale będzie emitować przy wyraźnie innej długości fali. Chociaż może być prawdą, że tyrozyna jest mniej fluorescencyjna niż tryptofan, może dostarczać znaczącego sygnału, ponieważ jest często obecna w dużych ilościach w wielu białkach. Zaobserwowano, że fluorescencja tyrozyny jest wygaszana przez obecność pobliskich cząsteczek tryptofanu albo przez rezonansowy transfer energii, albo przez jonizację jej aromatycznej grupy hydroksylowej.
Oto kilka ważnych punktów, o których należy pamiętać podczas pomiaru peptydów metodą A280.
- Białka o podobnej masie cząsteczkowej mogą mieć różne wartości absorbancji ze względu na różnicę w zawartości tryptofanu i tyrozyny.
- Na absorbancję UV ma również wpływ struktura białka. Tak więc warunki, które wpływają na strukturę (takie jak temperatura, pH, siła jonowa lub obecność detergentów) mogą wpływać na zdolność reszt aromatycznych do absorbowania światła przy 280 nm i zmieniać wartość współczynnika ekstynkcji białka.
- Lokalne środowisko aminokwasów aromatycznych może mieć wpływ na ich widma. Oznacza to, że tryptofan będzie miał pik emisji przy niższych długościach fal, gdy jest pochowany w hydrofobowych wewnętrznych regionach białka, podczas gdy tyrozyna będzie często przekazywać swoją energię do sąsiednich aminokwasów tryptofanu. Zjonizowany tyrozynat, który powstaje, gdy protony są tracone z tyrozyny w wyniku wzrostu pH, będzie wykazywał długość fali podobną do tryptofanu.