Dwie reszty aminokwasowe decydują o wrażliwości kanałów jonowych TRPV3 i TRPV4 na 2-APB

Wyniki

Identyfikacja mutacji wpływających na odpowiedź na 2-APB.

Przeanalizowaliśmy bibliotekę mutantów mysiego TRPV3 składającą się z ≈14,000 konstruktów cDNA niosących średnio 2.5 mutacji na klon wygenerowanych przez podatny na błędy PCR. Zmutowane konstrukty były transfekowane do komórek ludzkiej nerki embrionalnej (HEK293), a odpowiedzi wapniowe wywołane przez ciepło (42 °C), 25 μM 2-APB i 1.75 mM kamfory były monitorowane we fluorescencyjnym czytniku płytkowym (FLIPR). Ostatnio opisaliśmy identyfikację reszt specyficznie wymaganych do aktywacji cieplnej TRPV3 (20). Tutaj skupiliśmy się na zestawie danych 2-APB i kamfory, aby zidentyfikować reszty specyficznie wymagane do odpowiedzi chemicznych.

Specyficznie, wybraliśmy klony, które wykazały normalne odpowiedzi na jedną substancję chemiczną, ale znacznie zmniejszoną aktywację przez drugą (dla kryteriów wyboru, patrz Metody). Pozytywne klony były wybierane, odrastały i mierzono pełne krzywe dawka-odpowiedź przeciwko każdemu bodźcowi, a także obliczano wartości EC50 (patrz Metody). Siedem zmutowanych klonów zostało potwierdzonych jako wykazujące specyficzny niedobór 2-APB i poddanych sekwencjonowaniu. Co niezwykłe, wszystkie 7 klonów zawierało mutacje w 1 z 2 reszt. Pierwsza z nich, histydyna (H) 426, jest obecna w cytoplazmatycznym regionie N-końca, pomiędzy domeną ankyrynową i transmembranową. W badaniach przesiewowych zidentyfikowaliśmy 4 różne substytucje H426 (Tabela 1). Druga z nich, arginina (R) 696, jest obecna w C-końcowym cytoplazmatycznym polu TRP (IWRLQR), konserwowanej domenie w kanałach TRP (2, 3). 3 mutacje w tej reszcie mają tę samą, blisko spokrewnioną substytucję argininy na lizynę. Wszystkie 7 mutacji powodowało poważne deficyty w odpowiedzi na 2-APB, bez wpływu na odpowiedź na kamforę (Tabela 1). Chociaż niektóre klony z niedoborem kamfory również zostały zidentyfikowane, były to stosunkowo bardziej subtelne mutacje, przesuwające wartości EC50 kamfory ≈2-krotnie lub mniej (dane nie pokazane). Z tego powodu skupiliśmy się w tym badaniu na 2 resztach powodujących specyficznie >10-krotny niedobór 2-APB.

Wstępna charakterystyka elektrofizjologiczna kanałów TRPV3-H426 i TRPV3-R696.

FLIPR jest pośrednim sposobem pomiaru aktywności kanałów jonowych. Aby potwierdzić nasze wyniki FLIPR, zastosowaliśmy technikę patch clamp i zmierzyliśmy prądy całokomórkowe mysich TRPV3 typu dzikiego, TRPV3-H426N i TRPV3-R696K, gdy 2-APB (1 μM do 3 mM) lub kamfora (0,3 do 20 mM) były indywidualnie aplikowane do kąpieli od niskich do wysokich stężeń (Fig. 1 i Fig. S1). W sposób zależny od stężenia 2-APB aktywował prądy w komórkach HEK293 transfekowanych TRPV3 typu dzikiego ze średnimi wartościami EC50 wynoszącymi 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) i 36,8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) przy +100 i -100 mV, odpowiednio (Fig. 1A; Fig. S1A); 2-APB nie indukował mierzalnych prądów w komórkach HEK293 transfekowanych TRPV3-H426N do 100 μM. Jednakże, stężenia 2-APB, które są nasycające dla TRPV3 typu dzikiego (0,3 do 3 mM) były w stanie aktywować prądy w tym mutancie w sposób zależny od stężenia (Fig. 1A; Fig. S1A). W konsekwencji TRPV3-H426N wykazał >10-krotne przesunięcie EC50 aktywacji zależnej od 2-APB, a odpowiedź nigdy nie osiągnęła nasycenia. W równoległych eksperymentach kamfora również aktywowała prądy w komórkach HEK293 transfekowanych TRPV3 typu dzikiego w sposób zależny od stężenia, z wartościami EC50 wynoszącymi 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) i 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) odpowiednio przy +100 i -100 mV. Co ważne, odpowiedzi typu dzikiego na kamforę zaobserwowano w komórkach HEK293 transfekowanych TRPV3-H426N , potwierdzając, że aktywacja kamfory jest niezmieniona w tym mutancie (Fig. 1A; Fig. S1B).

W eksperymentach patch-clamp z całymi komórkami, 2-APB również indukował minimalną aktywację TRPV3-R696K. Przy +100 mV 2-APB zaczynał aktywować komórki HEK293 wyrażające ten zmutowany kanał już przy ≈3 μM, a nasycenie osiągał przy 30 μM, z EC50 wynoszącym 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Wyższe stężenia 2-APB (>30 μM) wywoływały prąd desensybilizujący z „odreagowaniem” po wypłukaniu 2-APB, zjawisko to jest szczegółowo opisane poniżej. Jednakże, przy -100 mV, 2-APB nie aktywował kanałów mutanta R696K nawet w stężeniu 1 mM (Rys. 1B; Rys. S1A). Maksymalna odpowiedź 2-APB przy 1 mM przy -100 mV wynosiła -2,3 ± 1,4 pA/pF (n = 6), co jest znacznie mniejsze (>10-krotnie) niż dla kanałów TRPV3 typu dzikiego (-482,1 ± 69,2 pA/pF przy 300 μM, n = 17), co sugeruje, że maksymalna odpowiedź kanału wywołana przez 2-APB jest zmniejszona w mutancie TRPV3-R696K. Jednak kamfora aktywowała podobne odpowiedzi w TRPV3- i TRPV3-R696K-transfekowanych komórkach HEK293 (Fig. 1B; Fig. S1B). Dlatego wstępne dane elektrofizjologiczne potwierdziły nasze wyniki badań przesiewowych, że mutanty TRPV3-H426N i TRPV3-R696K mają niedobór reakcji na 2-APB, bez wpływu na ogólną funkcję kanału, testowaną przez ich zdolność do odpowiedzi na kamforę.

Następnie zapytaliśmy, jakie właściwości łańcucha bocznego H426 i R696 są kluczowe dla aktywacji TRPV3 przez 2-APB. Zmutowaliśmy indywidualnie pozycje 426 i 696 do wszystkich innych aminokwasów i zmierzyliśmy krzywe dawka-odpowiedź FLIPR zarówno dla 2-APB jak i kamfory. Interesujące jest to, że wszystkie mutanty H426 miały zmniejszoną odpowiedź na 2-APB z silnym (>10-krotnym) wzrostem wartości EC50 (Tabela S1). Większość mutantów wykazywała normalną odpowiedź na kamforę, z wyjątkiem mutantów z podstawnikiem prolinowym łamiącym helisę, który wykazywał ≈2-krotny wzrost EC50 kamfory. Dane te są zgodne z wynikami naszego pierwotnego przesiewu, który zidentyfikował 4 różne substytucje skutkujące niedoborem 2-APB w tej pozycji. Mutanty kanałów niosące aromatyczne łańcuchy boczne F, T i W nie reagowały ani na kamforę, ani na 2-APB. Jednakże większość mutantów R696 wykazała zmniejszoną odpowiedź na 2-APB, ale również miała zmniejszoną maksymalną odpowiedź na kamforę (20 mM), wskazując, że te mutacje wpływają na ogólną ekspresję lub funkcję kanału (Tabela S2). Wynik ten jest również zgodny z naszym wstępnym wynikiem z pierwotnego badania przesiewowego, gdzie tylko substytucja lizyny została zidentyfikowana jako specyficznie wymagana dla 2-APB w tej reszcie. R696F również wykazywał pewien deficyt specyficzny dla 2-APB, chociaż maksymalne odpowiedzi kamfory były nieznacznie zaburzone. Mutanty R696D, R696G, R696N, R696P, R696S i R696T nie wykazywały znaczących odpowiedzi na 2-APB lub kamforę w porównaniu z komórkami transfekowanymi wektorem pcDNA.

Voltage-Dependent Response Remained Intact in 2-APB Mutants.

Zależność od napięcia została wykazana jako ważna rola w aktywacji i bramkowaniu kanałów TRP (1, 10-12, 21). W nieobecności stymulatorów chemicznych (na przykład kamfory lub 2-APB), kroki napięcia od -120 do +180 mV (krok 20 mV) nie aktywowały prądów w komórkach HEK293 transfekowanych TRPV3 typu dzikiego, wskazując, że TRPV3 (w przeciwieństwie do TRPV1 i TRPM8) nie jest aktywowany przez samo napięcie w zakresie badanym tutaj (20, 22). Jednakże, w obecności 30 μM 2-APB, prąd zależny od napięcia był aktywowany (Fig. S2A). Zgodnie z oczekiwaniami, w TRPV3-H426N nie zaobserwowano wykrywalnego prądu modulowanego napięciem w obecności 30 μM 2-APB (Fig. S2B). Jednakże, 6 mM kamfory wywołało prąd zależny od napięcia w komórkach HEK293 wyrażających TRPV3 typu dzikiego (V1/2 81.3 ± 2.6 mV) (Fig. S2 A i D) i TRPV3-H426N (V1/2 81.3 ± 2.5 mV) (Fig. S2 B i D). Podobnie jak w przypadku TRPV3-H426N, w TRPV3-R696K nie było wykrywalnego prądu modulowanego napięciem po podaniu 30 μM 2-APB (Fig. S2C). Jednakże kamfora aktywowała prąd zależny od napięcia z V1/2 wynoszącym 81,1 ± 5,4 mV (Fig. S2 C i D). Wyniki te wskazują, że modulacja napięcia jest nienaruszona w TRPV3-H426N i TRPV3-R696K i sugerują, że utrata zależności od napięcia jest mało prawdopodobna jako przyczyna zmniejszonej odpowiedzi na 2-APB w tych zmutowanych kanałach.

Wrażliwość na temperaturę TRPV3-H426N i TRPV3-R696K.

Wrażliwość na temperaturę jest cechą charakterystyczną funkcji kanału TRPV3 (14, 16, 23). Dlatego zapytaliśmy, czy aktywacja temperaturowa była zmieniona w klonach TRPV3-H426N i TRPV3-R696K. Zmierzyliśmy temperaturową (25 do 42 °C) aktywację komórek HEK293 transfekowanych dzikim typem TRPV3, TRPV3-H426N lub mutantem TRPV3-R696K w teście FLIPR. Odpowiedzi na ciepło TRPV3-H426N były równe lub nieznacznie większe niż odpowiedzi TRPV3 typu dzikiego (n = 4 eksperymenty), co sugeruje, że 2-APB- i aktywacja cieplna mogą być rozdzielone (Fig. S2E; i dane nie pokazane). Jednak odpowiedzi na ciepło w TRPV3-R696K były znacznie mniejsze w porównaniu z typem dzikim (n = 3 eksperymenty), co sugeruje, że ten mutant nie zmienia specyficznie aktywacji 2-APB (Fig. S2E).

Calcium-Dependent Desensitization of TRPV3-R696K.

Ciekawą cechą odpowiedzi na 2-APB w TRPV3-R696K-transfekowanych komórkach HEK293 jest szybka desensytyzacja przy >30 μM 2-APB i wyłączenie odpowiedzi na 2-APB w wysokich stężeniach (Fig. S3). Zjawisko to jest sprzeczne z TRPV3 typu dzikiego, który uwrażliwia się w odpowiedzi na powtarzalną/ciągłą stymulację substancjami chemicznymi lub ciepłem (14, 16). Proponuje się, że mechanizmem leżącym u podstaw sensytyzacji TRPV3 jest utrata inhibicji wapniowej tego kanału (22). Ponieważ desensytyzacja większości innych kanałów TRP (takich jak TRPV1 i TRPA1) na bodźce chemiczne lub temperaturowe również zależy od wapnia zewnątrzkomórkowego (24, 25), postanowiliśmy sprawdzić, czy wapń zewnątrzkomórkowy odgrywa rolę w wywołanej przez 2-APB odpowiedzi desensytyzującej w TRVP3-R696K. Zaskakująco, przy braku wapnia zewnątrzkomórkowego, 100 μM 2-APB aktywowało silne, podobne do dzikich prądy wewnętrzne i zewnętrzne w TRPV3-R696K (gęstość prądu TRPV3-R696K: 755.7 ± 200,0 pA/pF przy +100 mV, -641,2 ± 133,9 pA/pF przy -100 mV (n = 5); TRPV3 typu dzikiego: 615,0 ± 266,7 pA/pF przy +100 mV i -471,0 ± 83,2 pA/pF przy -100 mV, n = 9) (Fig. S4 A i B). Wynik ten sugeruje, że zastąpienie argininy lizyną w pozycji 696 w polu TRP TRPV3 powoduje przejście kanału w stan desensybilizacji na skutek stymulacji 2-APB, ale nie kamforą, w sposób zależny od wapnia. Domyślna reszta wiążąca Ca2+ w domenie pętli porowej, asparaginian 641, jest konserwowana wśród wszystkich kanałów TRPV i jest krytyczna dla właściwości permeacyjnych kanałów TRP (26, 27). Wykazano, że mutacja D641 do asparaginy (N) zmniejsza blok czerwieni rutenowej i wysokie powinowactwo zewnątrzpochodnej inhibicji wapnia w TRPV3 i innych kanałach TRP (17, 22, 26, 27). Dlatego sprawdziliśmy, czy mutacja D641N może uwolnić klon TRPV3-R696K od zależnej od wapnia utraty odpowiedzi na 2-APB. W teście FLIPR, TRPV3-D641N miał EC50 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), co jest w przybliżeniu połową wartości TRPV3 typu dzikiego (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). Podwójny mutant TRVP3-D641N/R696K miał EC50 równe 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), pokazując, że mutacja D641N w pełni przywróciła odpowiedź TRPV3-R696K na 2-APB. Zgodnie z oczekiwaniami, odpowiedź na kamforę była podobna wśród TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N i TRPV3-D641N/R696K (Fig. S4 C i D). Badania te pokazują, że TRPV3-R696 nie jest wyłącznie mutacją 2-APB. Obserwowane deficyty są pośredniczone przez wapń, wpływając na odpowiedzi 2-APB, ale nie kamfory.

Wrażliwość na 2-APB w ortologach TRPV3.

Zachowania aminokwasowe i różnice wśród ortologów są użytecznymi narzędziami do rozcinania relacji struktura-funkcja białek, w tym kanałów TRP (28, 29). Dlatego zapytaliśmy, czy te ortologi TRPV3 mają porównywalne odpowiedzi na kamforę i 2-APB. Rzeczywiście, ludzkie, psie i żabie kanały TRPV3, które mają histydyny w odpowiadającej myszy pozycji 426 (Rys. 2A), mają podobne odpowiedzi na 2-APB, gdy są nadekspresjonowane w komórkach HEK293 (chociaż odpowiedzi na kamforę w Xenopus tropicalis TRPV3 były zmniejszone w porównaniu z mysim TRPV3 typu dzikiego) (Rys. 2C). Zgodnie z oczekiwaniami, gdy H426 u ludzi, psów i żab zostało zmutowane do N, krzywe odpowiedzi na stężenie 2-APB były silnie przesunięte w prawo u każdego z tych ortologów TRPV3 (ryc. 2B). Ponownie, ta mutacja nie zmniejszyła wrażliwości na kamforę w porównaniu z ortologami TRPV3 typu dzikiego (Fig. 2C). Przeciwnie, zarówno ludzkie, jak i żabie mutanty TRPV3 H426N miały nieco większą wrażliwość na kamforę niż ich odpowiedniki typu dzikiego. Wyniki te wskazują, że mechanizm aktywacji TRPV3 przez 2-APB może być konserwowany u różnych gatunków.

Co ciekawe, chociaż R696 jest konserwowany w polu TRP TRPV3 wśród wszystkich gatunków, pozycja odpowiadająca myszy 426 w kurczaku TRPV3 (cTRPV3) jest N (427). Jak wykazano powyżej, substytucja H-N w reszcie 426 u ssaków i płazów zaburza prawidłową odpowiedź na 2-APB (ryc. 2A). Zgodne z tym, że reszty te są ważne dla odpowiedzi na 2-APB, EC50 2-APB w cTRPV3 wynosi 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) w porównaniu z 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) dla mysiej TRPV3. Co znamienne, mutacja N427 w H przesunęła krzywą stężenie-odpowiedź na 2-APB znacząco w lewo (EC50 6,1 ± 0,9 μM, nHill = 2,3), podczas gdy wartość EC50 dla kamfory pozostała niezmieniona (ryc. 3A). Całokomórkowe zapisy patch clamp potwierdziły, że krzywa odpowiedzi na stężenie 2-APB była silnie przesunięta w lewo u kurczaka TRPV3-N427H w porównaniu z cTRPV3 typu dzikiego zarówno przy +100, jak i -100 mV (ryc. 3B). Zapis jednokanałowy wykazał prawie 200-krotny wzrost otwarć kanałów w stosunku do poziomu podstawowego pod wpływem 25 μM 2-APB w kanalikach inside-out z komórek cTRPV3-N427H (n = 7), podczas gdy nie zaobserwowano istotnych zmian w kanalikach inside-out z komórek HEK293 cTRPV3-ekspresjonowanych wild-type (n = 5). Jednakże, 6 mM kamfory silnie zwiększało otwarcia pojedynczych kanałów w kanalikach inside-out z komórek HEK293 transfekowanych albo dzikim typem cTRPV3 albo mutantem cTRPV3-N427H na podobnym poziomie (Rys. 3 C-E). Stąd, pojedyncza mutacja punktowa w kurczęcej TRPV3 specyficznie zwiększa jej wrażliwość na 2-APB.

Wrażliwość na 2-APB w pokrewnych termoTRP: TRPV1, TRPV2, i TRPV4.

Mammalian TRPV3 jest blisko spokrewniony z TRPV1 (39% homologii aminokwasowej), TRPV2 (36% homologii), i TRPV4 (38% homologii). Co ciekawe, 2-APB jest wspólnym agonistą TRPV1, TRPV2 i TRPV3, ale nie TRPV4 (18). Dlatego zadaliśmy sobie pytanie, czy istnieje wspólny mechanizm działania 2-APB na te pokrewne kanały jonowe. Odpowiednikiem pozycji His-426 mysiego TRPV3 jest N w TRPV1 (N419), TRPV2 (N379) i TRPV4 (N456) (ryc. 4A; ryc. S5A). Odpowiednikiem pozycji R696 mysiego TRPV3 w polu TRP jest również R (R701) w TRPV1, konserwowana lizyna (K664) w TRPV2 i nienaładowany tryptofan (W737) w TRPV4 (Ryc. 4A; Ryc. S5A).

Skupiliśmy się na N-końcowej reszcie H, która jest specyficznie wymagana do prawidłowej odpowiedzi na 2-APB dla TRPV3 ssaków i płazów, a mutacja N do H w tej reszcie jest wystarczająca do wywołania solidnych odpowiedzi na 2-APB w TRPV3 kurczaka. Dzikie TRPV1 i TRPV2 posiadają Ns w pozycji odpowiadającej TRPV3 H426, ale wykazują silne odpowiedzi na 2-APB. Ten wynik podnosi możliwość, że TRPV1 i TRPV2 reagują na 2-APB poprzez inne mechanizmy niż TRPV3. Niemniej jednak sprawdziliśmy, czy wprowadzenie H w tej pozycji specyficznie wpływa na odpowiedzi na 2-APB w TRPV2 i TRPV1. Mutant TRPV1-N419H wykazywał zwiększoną odpowiedź zarówno na 2-APB, jak i na kapsaicynę, co wskazuje na niespecyficzny wpływ na ekspresję lub funkcję kanału (Fig. S5B). Odpowiedni mutant TRPV2-N379H miał podobne odpowiedzi na 2-APB i probenecid (inny agonista TRPV2) w porównaniu z TRPV2 typu dzikiego (Fig. S5C) (30). Wyniki te sugerują, że mechanizm aktywacji 2-APB w TRPV2 i TRPV1 nie jest całkowicie konserwowany z mechanizmem aktywacji TRPV3 (patrz Dyskusja).

Następnie zapytaliśmy, czy równoważne reszty TRPV3-H426 i R696 są odpowiedzialne za brak odpowiedzi na 2-APB w TRPV4. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zmutowaliśmy równoważne reszty aminokwasowe przy N456 i W737 w TRPV4 odpowiednio do H i R (Fig. 4A). TRPV4 typu dzikiego i TRPV4-W737R wykazywały jedynie marginalną odpowiedź na 2-APB w porównaniu z kontrolą transfekowaną wektorem (Rys. 4B). Jednakże, co znamienne, komórki HEK293 transfekowane TRPV4-N456H reagowały na 2-APB z EC50 wynoszącym 131,0 ± 3,3 μM (nHill = 2,4). Również TRPV4 niosący podwójną mutację N456H/W737R wykazywał jeszcze silniejszą odpowiedź na 2-APB, z EC50 wynoszącym 10,0 ± 0,8 μM (nHill = 1,2) (zbliżonym do wartości dla mysiej TRPV3 typu dzikiego) (ryc. 4B). Odpowiedzi na agonistę TRPV4 4-α-PDD nie różniły się istotnie między TRPV4 typu dzikiego i wszystkimi mutantami TRPV4, co sugeruje, że zwiększone odpowiedzi na 2-APB nie są spowodowane zwiększonym poziomem ekspresji TRPV4 lub ogólnym wzmocnieniem funkcji (Fig. 4B). Nagrania w wyciętych płatkach typu inside-out z ekspresją TRPV4, TRPV4-N456H, TRPV4-W737R lub TRPV4-N456H/W737R ujawniły aktywność pojedynczego kanału przez 150 μM 2-APB zarówno w TRPV4-N456H, jak i TRPV4-N456H/W737R, przy czym ten ostatni wykazywał silniejsze odpowiedzi (Fig. S6 B i C). Nie zaobserwowano aktywności pojedynczego kanału aktywowanego 2-APB w TRPV4 typu dzikiego i TRPV4-W737R (Fig. S6A; i dane nie pokazane). Wyniki te wskazują, że różnice w 2 resztach aminokwasowych zidentyfikowanych w naszym ekranie są odpowiedzialne za brak wrażliwości TRPV4.

na 2-APB.