Efficient 3-hydroxypropionic acid production from glycerol by metabolically engineered Klebsiella pneumoniae

W produkcji 1,3-propanediolu lub 3-HP z glicerolu głównym produktem ubocznym jest kwas mlekowy, który znacząco obniża wydajność produktu. Dlatego też podjęto próby ograniczenia produkcji mleczanu poprzez delecję genu kodującego dehydrogenazę mleczanową (Kumar i wsp. 2013b; Zhong i wsp. 2014). Ponieważ obie reakcje tworzące 1,3-propanediol i 3-HP konkurują o ich wspólny substrat 3-hydroksyaldehyd (3-HPA), delecja oksydoreduktazy propanediolowej sprzyja produkcji 3-HP (Ashok i wsp. 2011). Dlatego w tym badaniu znokautowano geny ldhA i dhaT, aby zwiększyć produkcję 3-HP.

Wpływ niedoboru ldhA na produkcję 3-HP

Zbudowano szczep JJQ01 z niedoborem ldhA i potwierdzono znokautowanie ldhA, jak pokazano na Rysunku S2A. Skonstruowano rekombinowane szczepy Kp4(pUC18-kan-aldH) i JJQ01(pUC18-kan-aldH) i przeprowadzono fermentację wsadową w 5-L bioreaktorze. Profile wzrostu komórek, zużycia glicerolu i produkcji metabolitów przedstawiono na Rys. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) wyprodukował 18.3 g/L 3-HP z wydajnością 0.21 mol/mol w ciągu 38 h, podczas gdy kwas mlekowy osiągnął 32.2 g/L z wyższą wydajnością 0.34 mol/mol. Ponadto wytworzono 17,6 g/L 2,3-butanodiolu, 6,1 g/L 1,3-propanodiolu i 10,7 g/L kwasu octowego. Tworzenie się mleczanu zwiększa nie tylko koszty, ale również trudności w odzyskiwaniu 3-HP, który jest izomerem mleczanu. Ponadto, mleczan jest głównym inhibitorem biosyntezy 3-HP i 1,3-propanodiolu (Xu i wsp. 2009b; Kumar i wsp. 2013b). Deficyt ldhA skutecznie wyeliminował powstawanie mleczanu, a produkcja 3-HP osiągnęła 48,3 g/L z wydajnością 0,28 mol/mol, jak pokazano na Rys. 2b. Stężenie i wydajność 3-HP w szczepie z niedoborem ldhA były zwiększone odpowiednio 1,64-krotnie i 33,3%, w porównaniu do szczepu Kp4(pUC18-kan-aldH). Poza niewielką ilością tworzącego się etanolu (około 4 g/L), nie wykryto akumulacji pirogronianu i mrówczanu przez szczep z mutacją ldhA, które prawie nie były obserwowane w przypadku użycia szczepu typu dzikiego.

Wyniki te wyraźnie wskazywały, że zablokowanie produkcji kwasu mlekowego znacznie przekierowało strumień węgla do produkcji 3-HP. Asymilacja glicerolu przez DhaB uległa znacznej poprawie, prawie 0,4 mol/mol glicerolu zostało skierowane przez DhaB do 3-HPA, co było zgodne z innymi badaniami (Kumar i wsp. 2013b; Xu i wsp. 2009b). Redukcja mleczanu mogła obniżyć toksyczność dla komórek, sprzyjała wzrostowi komórek i produktywności 3-HP. Jednakże, redukcja mleczanu zwiększyła również tworzenie 2,3-butanodiolu i 1,3-propanodiolu, które osiągnęły odpowiednio 21,9 g/L z wydajnością 0,13 mol/mol i 18,5 g/L z wydajnością 0,12 mol/mol. Z powodu delecji ldhA, nadmiar NADH pochodz±cy z podwyższonej akumulacji 3-HP może promować produkcję 2,3-butanodiolu i 1,3-propanodiolu zamiast mleczanu w celu regeneracji NAD+ i utrzymania równowagi redoks. W rzeczywistości, tworzenie etanolu również wspierało regenerację NAD+, co spowodowało wyższy strumień z pirogronianu do etanolu niż strumień do pirogronianu.

Effect of dhaT deficiency on 3-HP production

Delecja ldhA dramatycznie zwiększyła produkcję 3-HP, w tym samym czasie produkcja 1,3-propanediolu również została zwiększona do 18,5 g/L. Ko i wsp. (2017) podali, że 43 g/L 3-HP i 21 g/L 1,3-propanediolu uzyskano poprzez redukcję octanu i innych produktów ubocznych. Chociaż tworzenie 1,3-propanediolu korzystnie wpływa na utylizację glicerolu poprzez regenerację kofaktora, to odpowiada on za znaczną część strumienia węgla glicerolu. Ponieważ 1,3-propanodiol i 3-HP konkurują o ten sam prekursor 3-HPA, w celu ograniczenia strumienia do 1,3-propanodiolu skonstruowano szczep JJQ02(pUC18-kan-aldH) z podwójną eliminacją ldhA i dhaT (przedstawiony w pliku dodatkowym 1: Rysunek S2B). Wyniki fermentacji wsadowej w 5-L reaktorze przedstawiono na Rys. 2c. Nieoczekiwanie, równoczesne znokautowanie ldhA i dhaT dało tylko 44,5 g/L 3-HP, mimo że wydajność wzrosła do 0,32 mol/mol glicerolu. Delecja dhaT spowodowała zmniejszenie miana i wydajności 1,3-propanodiolu odpowiednio do 9,9 g/L i 0,07 mol/mol. Jednak 1,3-propanediol nadal był produkowany w reakcji katalizowanej przez YqhD i inne oksydoreduktazy (Ashok i wsp. 2013). Ponadto, w porównaniu do JJQ01(pUC18-kan-aldH), produkcja 2,3-butanodiolu została nieznacznie zwiększona z 21,9 do 23,4 g/L, co wskazuje na zwiększenie strumienia do szlaku 2,3-butanodiolu w celu zużycia nadmiaru NADH pochodzącego z reakcji katalizowanej przez ALDH. Synteza 1,3-propanodiolu odgrywa kluczową rolę w regulacji równowagi redoks u K. pneumoniae. W ramach szlaku oksydacyjnego, podczas tworzenia jednej cząsteczki octanu z glicerolu powstają trzy cząsteczki NADH, jednocześnie tworzona jest jedna cząsteczka ATP. W konsekwencji, delecja zarówno ldhA jak i dhaT znacznie zmniejszyła zdolność do regeneracji NAD+, a więcej NADH było utleniane poprzez tworzenie 2,3-butanodiolu, co skutkowało zwiększoną ilością 2,3-butanodiolu. Zmniejszenie szybkości napowietrzania (ograniczenie dopływu tlenu) mogło zwiększyć produkcję octanu, aby dostarczyć więcej ATP, ale jednocześnie powstawało więcej NADH, co powodowało dalsze zwiększenie produkcji 2,3-butanodiolu. Jednakże zregenerowany NAD+ wydawał się być mniejszy niż ten powstały w reakcji katalizowanej przez DhaT, co prowadziło do mniejszej produkcji 3-HP. Dlatego dostarczanie odpowiedniej ilości tlenu do generowania NAD+ bez wpływu na aktywność DhaB i dysymilację glicerolu jest krytyczne dla produkcji 3-HP w fermentacji mikrotlenowej.

W tym badaniu, nie udało się poprawić 3-HP przez usunięcie genu dhaT. Dysymilacja glicerolu jest regulowana przez dehydrogenazę glicerolu DhaD, kinazę glicerolu GlpK, dehydratazę glicerolu DhaB i oksydoreduktazy 1,3-propanodiolu 1,3-PDORs. Sztywność punktu rozgałęzienia glicerolu sugeruje, że poprawa produkcji 3-HP poprzez delecję genów zaangażowanych w podział strumienia glicerolu jest trudna. Ashok i wsp. (2011) określili aktywność DhaD, DhaB, ALDH i 1,3-PDOR po delecji genu dhaT. Stwierdzili oni, że aktywność DhaD uległa nieznacznej poprawie, aktywność ALDH nieznacznie się obniżyła, a aktywność DhaB uległa znacznemu obniżeniu. Zhang i wsp. (2008) również analizowali odporność w punktach rozgałęzień szlaku dysymilacji glicerolu. Wykazano, że podział strumienia węgla pomiędzy gałęzią redukcyjną i utleniającą był odporny na warunki środowiskowe.

Wpływ napowietrzania na produkcję 3-HP

Nasze wcześniejsze badania wykazały, że warunki mikro-aerobowe były korzystne dla produkcji 3-HP. W porównaniu do procesu beztlenowego, w fermentacji mikroaerobowej produkcja 3-HP była znacznie zwiększona ze względu na wyższy poziom ekspresji dehydrogenazy aldehydowej, a jednocześnie produkcja 1,3-propanodiolu była zmniejszona (Huang et al. 2013). Wang i wsp. (2011) podali, że aktywność specyficzna dehydratazy glicerolu u K. pneumoniae przy tempie napowietrzania 0,04 vvm była o 59% wyższa niż przy braku dopływu powietrza. Jednak donoszono, że dehydrataza glicerolowa może być szybko inaktywowana przez tlen (Toraya 2000; Ruch i Lin 1975) i znacząco wpływała na produkcję 3-HP (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Dodatkowo, koenzym B12, kofaktor dla DhaB, nie jest wystarczająco syntetyzowany w warunkach wysokiego napowietrzenia u większości naturalnych producentów 3-HPA, takich jak K. pneumoniae. Huang i wsp. (2013) oraz Ko i wsp. (2017) również wykazali, że warunki wysokotlenowe nie były korzystne dla produkcji 3-HP. Dlatego podjęliśmy wstępne eksperymenty fed-batch w różnych warunkach napowietrzania i również stwierdziliśmy, że utrzymywanie wysokiego tempa napowietrzania było niekorzystne dla produkcji 3-HP po ustaniu wzrostu komórek (dane nie pokazane). W hodowli wsadowej JJQ02(pUC18-kan-aldH), przyjęliśmy szybkość napowietrzania o połowę mniejszą od początkowej, gdy OD650 była zamknięta do wartości maksymalnej. Profile wzrostu, glicerolu i metabolitów są pokazane na Rys. 3, a czarna strzałka wskazała punkt czasowy do obniżenia szybkości napowietrzania (0.5 vvm).

Końcowe miano 3-HP osiągnęło 61.9 g/L z wydajnością 0.58 mol/mol w 5-L reaktorze w 38 h. Stężenie 3-HP i wydajność przez JJQ02(pUC18-kan-aldH) były 3.3- i 2.76-krotnie większe niż przez Kp4 (pUC18-kan-aldH), oraz 1.28- i 2.07-krotnie większe niż przez JJQ01(pUC18-kan-aldH). Wyniki wykazały, że produkcja 1,3-propanodiolu i 2,3-butanodiolu zatrzymała się po 20 h. Jednakże miano 3-HP nadal wzrastało, chociaż tempo produkcji spadało od tego momentu. W dalszej części fermentacji mikroaerobowej, chociaż niewiele NADH było regenerowane poprzez tworzenie 1,3-propanodiolu i 2,3-butanodiolu, pewna ilość NADH mogła być nadal regenerowana poprzez łańcuch transportu elektronów, ponieważ najbardziej efektywnym sposobem regeneracji NAD+ jest łańcuch transportu elektronów w obecności tlenu (Richardson 2000; Kumar i in. 2013b), co skutkuje wzrostem 3-HP bez oczywistego wzrostu 1,3-propanediolu i 2,3-butanediolu.

Fermentacja w skali 300-L

Aby zbadać wykonalność szczepu JJQ02(pUC18-kan-aldH) do produkcji 3-HP w większym bioreaktorze, przeprowadzono fermentację wsadową w bioreaktorze 300-L, stosując się do warunków fermentacji ustalonych w fermentorze 5-L. Przyjęto dwustopniową strategię napowietrzania; szybkość napowietrzania zmniejszono do połowy w punkcie czasowym oznaczonym czarną strzałką, jak pokazano na Rys. 4. 3-HP osiągnął 54,5 g/L z wydajnością 0,43 mol/mol, a stężenie i wydajność wynosiły 12,2 g/L i 0,11 mol/mol dla 1,3-propanodiolu, 21,3 g/L i 0.17 mol/mol dla 2,3-butanodiolu, oraz 9,3 g/L i 0,11 mol/mol dla octanu w 51 h (Rys. 4).

W porównaniu z wynikami uzyskanymi w reaktorze 5-L, miano i wydajność molowa 2,3-butanodiolu w reaktorze 300-L zostały oczywiście zwiększone, które były podobne do tych z tym samym szczepem w reaktorze 5-L przy stałej szybkości napowietrzania 1 vvm. Sugerowało to, że transfer tlenu w reaktorze 300-L może być nieco wyższy niż w reaktorze 5-L przy zmniejszonej szybkości napowietrzania, ponieważ niektóre badania wskazywały, że produkcja 2,3-butanodiolu wymaga odpowiedniej szybkości napowietrzania (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). W warunkach napowietrzania w reaktorze 300-L, ekspresja enzymów związanych z tworzeniem 2,3-butanodiolu oraz pula NADH lub stosunek NADH/NAD+ promowały produkcję 2,3-butanodiolu, a ekspresja DhaB i AldH mogła być nieznacznie zaburzona.

Mając na uwadze równowagę redoks, w szczepie ldhA dhaT z podwójnym mutantem, NADH powstający w reakcji katalizowanej przez ALDH był częściowo regenerowany poprzez tworzenie 2,3-butanodiolu i innych zredukowanych metabolitów, takich jak etanol i bursztynian, a częściowo przez łańcuch transportu elektronów (Richardson 2000; Kumar i wsp. 2013b). Dlatego też szybkość napowietrzania w fermentacji mikrosferycznej istotnie wpływała na produkty końcowe. W fermentacji w reaktorze 300-L, mimo że szybkość napowietrzania została zredukowana do połowy początkowej, sytuacja transferu tlenu nadal mogła się znacznie różnić od tej w reaktorze 5-L ze względu na różne charakterystyki transferu tlenu, co było tradycyjnym tematem w skalowaniu bioprocesów. Różnice w dystrybucji produktów w różnych reaktorach wskazywały na znaczenie precyzyjnej kontroli dostarczania tlenu, podczas gdy jedynie zmniejszenie szybkości napowietrzania wydawało się zbyt surowe. Jednakże, chociaż miano i wydajność 3-HP różniły się nieznacznie od tych w reaktorze 5-L, skalowanie zakończyło się sukcesem. Ponieważ wydajność transferu tlenu w reaktorze 300-L była inna niż w reaktorze 5-L, oczekiwano, że dalsza precyzyjna regulacja szybkości napowietrzania w reaktorze 300-L może zwiększyć poziom 3-HP.