Potencjalne wykorzystanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) w spersonalizowanych zastosowaniach medycyny regeneracyjnej może być zwiększone przez transgenikę, włączając w to ekspresję konstytutywnych etykiet komórkowych, reporterów różnicowania lub modulatorów fenotypów chorobowych. Dlatego też istnieje precedens dla powtarzalnej ekspresji transgenów wśród podklonów iPSC o izogenicznym lub zróżnicowanym tle genetycznym. Używając wektorów wirusowych lub transpozonowych, trudno jest kontrolować miejsca integracji transgenu i liczbę kopii, a odtworzenie ich w wielu liniach komórkowych jest prawie niemożliwe. Co więcej, przypadkowo zintegrowane transgeny często podlegają plejotropowym efektom pozycyjnym jako konsekwencja zmian epigenetycznych nieodłącznie związanych z różnicowaniem, co podważa zastosowania w iPSCs. Aby rozwiązać ten problem, zaadaptowaliśmy popularne technologie TALEN i nukleazy CRISPR/Cas9 w celu wprowadzenia transgenów do wcześniej zdefiniowanych loci i przezwyciężenia przypadkowych efektów pozycyjnych. AAVS1 jest przykładowym locus w obrębie genu PPP1R12C, które pozwala na ekspresję transgenów napędzanych promotorem CAG. Ukierunkowanie genów kontroluje liczbę kopii transgenu tak, że wzory ekspresji reporterów są powtarzalne i skalowalne ∼2-krotnie. Co więcej, ekspresja genów jest utrzymywana podczas długotrwałej hodowli ludzkich iPSC i różnicowania in vitro wzdłuż wielu linii rozwojowych. Tutaj przedstawiamy nasz protokół celowania AAVS1 przy użyciu standardowych wektorów dawców i metod konstrukcyjnych, jak również przedstawiamy praktyczne rozważania dotyczące hodowli iPSC, selekcji leków i genotypowania.
.