Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae: a comprehensive analysis of more than 2000 strains from the SAG culture collection

A database of FA profiles from diverse microalgae

Charakterystykę profili FA szczepów mikroglonów z SAG przeprowadzono poprzez skrining długołańcuchowych FA (C-14 – C-24) zestryfikowanych w lipidach. Łącznie przebadano 2076 szczepów kultur z SAG (co stanowi 91% stanu posiadania SAG). Utworzono bazę danych, która zawierała wszystkie zidentyfikowane FA oraz niektóre inne hydrofobowe metabolity. Przegląd wszystkich substancji zidentyfikowanych w badanych szczepach glonów przedstawiono w tabeli 1. W sumie 86 różnych substancji zostało zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii masowej, z czego 76 to estry metylowe FA. Spośród 76 kwasów tłuszczowych, 36 substancji zidentyfikowano na podstawie widma masowego i czasu retencji według substancji wzorcowej, a pozostałe 40 kwasów tłuszczowych zidentyfikowano tylko na podstawie widma masowego. Pozostałe 10 substancji zostało zidentyfikowanych również tylko na podstawie widm masowych. W porównaniach z substancją wzorcową, związek był identyfikowany przez porównanie z widmami masowymi o najwyższym podobieństwie do proponowanej substancji w bibliotece MS (Nist02 lub Wiley98). W ten sposób wykryto niektóre estry metylowe rozgałęzionych FA, np. 12-metylo-14:0 lub 3, 7, 11, 15-tetrametylo-16:0. Podczas gdy dla większości FAME dostępne były autentyczne wzorce lub referencje MS, dla niektórych innych substancji możliwa była jedynie identyfikacja typu „best hit”. Pochodne DMOX umożliwiły identyfikację pozostałych 12 FAME. Niezidentyfikowane substancje muszą być jeszcze zweryfikowane z autentycznymi wzorcami, które nie są dostępne w tym momencie. Pełna baza danych przedstawiona jest jako plik dodatkowy 1.

Bakterie w kulturach glonów (jako zanieczyszczenia lub czasami nawet poprzez symbiozę) są dobrze znane i można je znaleźć w szczepach hodowlanych prawie każdej kolekcji kultur glonów. Tylko niewielka część (około 20%) badanych szczepów SAG może znajdować się w stanie aksenicznym. Dlatego też, również zawartość FA w bakteriach zanieczyszczających mogła mieć wpływ na uzyskany profil FA. Aby to sprawdzić, wykonano pomiary metylo-15:0 i metylo-17:0, które są uważane za markery kontaminacji bakteryjnej. Tylko 34 szczepy z 2076 analizowanych szczepów zawierały niewielkie ilości metylu-15:0. Ten zaobserwowany niski wskaźnik bakterii zanieczyszczających został poparty przez kontrole mikroskopowe, które są rutynowe w ciągłej konserwacji szczepów glonów (dane nie pokazane). Podsumowując, stwierdzamy, że tylko 1-2% szczepów mogło być zanieczyszczonych i że istnieje tylko niewielki wpływ zanieczyszczeń bakteryjnych na obserwowane profile FA kultur glonów.

W dodatku porównaliśmy zmierzone profile głównych FA 10 losowo wybranych szczepów z różnych klas z opublikowanymi danymi (Tabela 2), przy czym należy zauważyć, że tylko jeden z 10 szczepów, które zostały wybrane z opublikowanych danych, pochodził z kolekcji SAG. W przypadku 6 szczepów profile FA były bardzo podobne. W przypadku 4 pozostałych szczepów zaobserwowano duże różnice w stopniu desaturacji FA o różnych długościach łańcucha, co można tłumaczyć różnymi warunkami hodowli stosowanymi w różnych badaniach.

Patterns of fatty acid composition

Profile FAME były raczej różne wśród szczepów. Jako przykład, profile FAME z czterech różnych rodzajów, tj. Chroococcus (Cyanobacteria), Closteriopsis (Chlorophyta, Trebouxiophyceae), Pseudochantransia (Rhodophyta) i Prymnesium (Chromalveolates, Haptophyta) są przedstawione na Rysunku 1. W związku z tym spodziewano się uzyskać pewne odmienne wzorce dystrybucji FA pomiędzy filiami, klasami i rodzajami mikroalg. Ponadto sprawdzono, czy różnice we wzorach FA można znaleźć również w grupach o niższej randze taksonomicznej, tj. między gatunkami tego samego rodzaju, a nawet między wieloma izolatami tego samego gatunku.

2.1 Dystrybucja czterech ważnych PUFA wśród szczepów z kolekcji kultur glonów SAG

Schematy dystrybucji FA wśród i w obrębie 17 grup (filii lub klas) mikroalg i sinic, do których należą badane szczepy, zbadano bardziej szczegółowo dla czterech PUFA, które mają duże znaczenie żywieniowe (Tabela 3). Częstotliwość występowania tych czterech PUFA w określonej grupie mikroalg podano jako procent szczepów z określonym FA ze wszystkich badanych szczepów w tabeli 3.

Ponieważ kolekcja kultur SAG koncentruje się na mikroskopijnych glonach z siedlisk lądowych, Haptophyta, Dinophyta i Phaeophyceae były po prostu słabo reprezentowane. Dlatego odzyskane wzorce rozmieszczenia w tych i innych słabo reprezentowanych grupach mogą nie być reprezentatywne dla całej grupy. Na przykład, dla Phaeophyceae dostępne były głównie formy mikroskopijne (np. Ectocarpus i słodkowodny rodzaj Bodanella), a badane szczepy Rhodophyta obejmowały głównie formy słodkowodne lub pochodzące z siedlisk lądowych (np. Porphyridium). Chociaż okrzemki są bardzo zróżnicowane w siedliskach lądowych, badana niewielka próba dostępnych szczepów okrzemek (18) zdecydowanie nie reprezentuje tej grupy, która jest prawdopodobnie najbogatszą gatunkowo grupą glonów. Ponadto, dla każdej z dwóch klas Stramenopiles (glonów heterokontynentalnych), Phaeothamniophyceae i Raphidophyceae, w SAG utrzymywane są tylko dwa szczepy i dlatego nie są one tutaj dalej omawiane. Podobnie, w SAG znajduje się tylko jeden szczep Chlorarachniophyta (supergrupa Rhizaria).

Kwas dokozaheksaenowy o bardzo długim łańcuchu PUFA (DHA, 22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) był trzecim najczęściej występującym FA, obecnym w 15 z 20 badanych grup (Tabela 3). W Dinophyta, Haptophyta i Euglenoids szczepy zawierające DHA były szczególnie częste i DHA występował tam w stosunkowo wysokim udziale procentowym w całkowitej zawartości FA, tj. w 60% lub więcej tych szczepów udział DHA był wyższy niż 5%. W pojedynczym badanym dinofitowym szczepie Ceratium horridum udział DHA wynosił nawet 29,3%. W pozostałych grupach DHA występował raczej z niską częstotliwością, a także przeważnie w niewielkim udziale, tj. poniżej 1% całkowitej zawartości FA. W Cryptophyta i Bacillariophyceae DHA występował wprawdzie w co piątym szczepie, ale jego udział procentowy w całkowitej zawartości FA był tam mniejszy niż 5%, z wyjątkiem Cryptomonas baltica SAG 18.80 (Cryptophyta), gdzie wynosił 13,7%. Pomimo, że DHA występował w raczej niskich częstotliwościach u zielenic (Chlorophyta), drugą najwyższą zawartość DHA spośród wszystkich szczepów SAG, 18,9% całkowitej ilości FA, stwierdzono u chlorofitu Chlorococcum novae-angliae SAG 5.85, a następnie u trebouksiofita Prototheca zopfii SAG 263-8 z 14,2%. Łącznie wyniki te są zgodne z ilościami DHA opisanymi wcześniej dla poszczególnych grup alg .

Kwas eikozapentaenowy (EPA, 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)) był jednym z najczęściej występujących PUFA, znalezionym we wszystkich z 17 grup objętych naszymi badaniami (Tabela 3). Szczepy zawierające EPA występowały szczególnie często w Eustigmatophyceae, Glaucophyta, Xanthophyceae i Rhodophyta. Najwyższy udział EPA w całkowitej zawartości FA występował w Rhodophyta, gdzie około 81% szczepów wykazywało więcej niż 10% EPA. Najwyższe wartości wynosiły 52,4% u Compsopogonopsis leptoclados SAG 106.79 i 44,9% u Acrochaetium virgatulum SAG 1.81. Również szczepy trzech gatunków Porphyridium zawierały wysokie ilości EPA (31,2% w P. sordidum SAG O 500, 27,5% w P. aerugineum SAG 110.79, 26,7% w P. purpureum SAG 1380-1a). Jest to zgodne z doniesieniem o P. cruentum sugerującym, że czerwone algi są bogatym źródłem EPA. Pomimo, że EPA występował dość często w Glaucophyta, tylko około połowa szczepów miała udział EPA większy niż 10% (maksymalnie 31.1% w Glaucocystis nostochinearum SAG 28.80). Jest to zgodne z innymi badaniami, które wykazały wysokie ilości EPA (oprócz ARA) w glaukoficie Cyanophora paradoxa . Najwyższy odsetek (87%) szczepów z udziałem EPA większym niż 10% był w Dinophyta, ale z maksimum tylko 24,3% w Pyrocystis lunula SAG 2014. W Euglenoids, Xanthophyceae i Eustigmatophyceae około 67% wszystkich szczepów miało udział EPA większy niż 10%, z maksymalnymi wartościami około 31% (31,4% w Heterococcus fuornensis SAG 835-5, 31,6% w Euglena proxima SAG 1224-11a) i 34,6% w Goniochloris sculpta SAG 29.96. EPA występował rzadko i najczęściej w nieznacznych ilościach (< 5%) w większości zielenic, ale trzy szczepy miały wyjątkowo wyższą zawartość ok. 20% sumy FAs (24,2%, Chlorella sp. SAG 242.80; 24,0%, Chlamydomonas allensworthii SAG 28.98; 22,3%, Cylindrocapsa involuta SAG 314-1). EPA był jedynym FA odzyskanym z Chlorarachnion repens SAG 26.97 (Chlorarachniophyta). To, że Xanthophyceae i Eustigmatophyceae zawierają EPA w stosunkowo wysokich proporcjach, podczas gdy zielone algi rzadko gromadzą EPA, potwierdza wcześniejsze badania.

Kwas arachidonowy (ARA, 20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)) najczęściej występował w Phaeophyceae, gdzie był obecny we wszystkich szczepach z wyjątkiem jednego badanego (Tabela 3); w około 54% wszystkich szczepów Phaeophyceae udział ARA był wyższy niż 10%, ale maksymalnie tylko 17,7% w Halopteris filicina SAG 10.96. ARA miała najwyższy udział w całkowitej zawartości FA w Rhodophyta; tam nawet około 77% wszystkich szczepów miało zawartość ARA powyżej 10%, z maksimum 68,3% w Pseudochantransia sp. SAG 19.96. Co ciekawe, zawartość ARA była dość wysoka, ale zmienna wśród ośmiu badanych wielokrotnych izolatów rodofitu Porphyridium purpureum. Podczas gdy średnia zawartość ARA wynosiła około 31% w sześciu szczepach, to w SAG 1380-1d było to tylko 3.8%, ale w SAG 1380-1e aż 44.5%. Nie znamy jeszcze wyjaśnienia tej różnicy; oba szczepy zostały wyizolowane z siedlisk morskich i są hodowane w tych samych warunkach. Wysoki udział ARA (jak również EPA) stwierdzono już wcześniej u innego gatunku Porphyridium cruentum . ARA były obecne w około połowie wszystkich badanych szczepów Euglenoid i to w stosunkowo wysokich proporcjach całkowitej zawartości FA, tj. około jedna trzecia szczepów wykazywała więcej niż 5% ARA, z wyjątkowo wysokimi wartościami 41.3% i 34.3% u Rhabdomonas incurva SAG 1271-8 i Khawkinea quartana SAG 1204-9. Co ciekawe, inny szczep tego samego gatunku K. quartana, SAG 1204-9, miał mniej niż połowę (13,3%) zawartości ARA, a u pięciu innych gatunków Rhabdomonas nie wykryto ARA. Dowodzi to, że zawartość FA może być dość zmienna pomiędzy gatunkami tego samego rodzaju, a nawet pomiędzy wieloma izolatami tego samego gatunku. Chociaż około połowa wszystkich badanych szczepów dla Xanthophyceae i Eustigmatophyceae zawierała ARA (tab. 3), to jednak miały one ten FA w stosunkowo niskich proporcjach. Tylko jedna czwarta szczepów Xanthophyceae zawierała ARA w ilości większej niż 5%, a w Eustigmatophyceae nawet żaden szczep nie osiągnął 5%. ARA rzadko występowała u zielenic, tj. ze średnią częstością ok. 14% w fyllach Chlorophyta i Streptophyta, z wyjątkiem zielenic prasinofitowych, gdzie ARA była obecna u 42,9% wszystkich szczepów (tab. 3). Jednakże, było kilka pojedynczych przykładów zielenic z wyjątkowo wysoką zawartością ARA, tj. 73,8% (odpowiadające 102 μg/mg suchej masy, najwyższa zawartość ARA wykryta we wszystkich badanych szczepach SAG) w chloroficie Palmodictyon varium SAG 3.92, następnie 52,9% w chloroficie Trochisciopsis tetraspora SAG 19.95 i 51,8% w trebouxiophyte Myrmecia bisecta SAG 2043. Stwierdzenie wysokiej zawartości ARA w tym ostatnim szczepie jest zgodne z tym, że jest on blisko spokrewniony z Parietochloris incisa (syn. Lobosphaeropsis incisa, Myrmecia incisa). P. incisa została zaliczona do „mikroalg oleistych” i jest najbogatszym znanym do tej pory roślinnym źródłem ARA ze względu na zdolność do akumulacji dużych ilości ARA (do 59% całkowitej zawartości FA). Co ciekawe, szczep SAG P. incisa (Lobosphaera incisa SAG 2007) miał z 13,2% znacznie niższą zawartość ARA (tab. 2).

Kwas γ-linolenowy (GLA, 18:3(6Z, 9Z, 12Z)) był trzecim co do częstości występowania FA w badanej próbie szczepów mikroalg SAG, brakowało go tylko w Haptophyta, Dinophyta i Euglenoids (tab. 3). Najczęściej wykrywano go u dwóch linii zielenic, prasinofitów i Streptophyta. U prasinofitów GLA występował tylko w jednym z pięciu dostępnych dla tej grupy rodzajów, Tetraselmis, i to w 12 z 17 dostępnych szczepów, w zmiennych proporcjach, tj. od 0,5 do 7,3% całkowitej zawartości FA. W Streptophyta, GLA był szerzej rozpowszechniony, tj. wykryto go w 17 z 41 badanych rodzajów. Rozmieszczenie GLA było dość zmienne w obrębie szczepów i gatunków danego rodzaju streptofitów, podobnie jak w przypadku ARA w innych rodzajach. Stosunkowo wysoki procent GLA stwierdzono w szczepach Closterium (16,5% w C. baillyanum SAG 50.89, 8% w C. lunula SAG 7.84), ale GLA nie stwierdzono w pozostałych 12 szczepach tego rodzaju. Podobnie, w licznie dostępnych szczepach Cosmarium (25) i Micrasterias (16), GLA stwierdzono tylko w 11 i 2 szczepach, odpowiednio. Najwyższy procent GLA stwierdzono w klasie zielenic Chlorophyceae (29,9% w Deasonia multinucleata SAG 25,95, 28,5% w Desmodesmus multiformis SAG 26,91) oraz w Cyanobacteria (24,8% w Spirulina maxima SAG 84,79). W około jednej trzeciej (32%) wszystkich chlorofitowych szczepów GLA zawartość tego FA wynosiła 5% i więcej. Dystrybucja GLA u cyjanobakterii była raczej niejednolita, tzn. 27 szczepów cyjanobakterii z GLA ograniczało się głównie do trzech rodzajów, Calothrix (8 szczepów), Microcystis (7 szczepów) i Spirulina (6 szczepów). Również w obrębie każdego z tych rodzajów udział GLA był dość zróżnicowany, np. u Spiruliny wahał się od 4,6% do 24,8%, a trzy szczepy nie zawierały GLA. Skład FA był wcześniej używany do rozróżniania sinic w izolatach i próbkach naturalnych na poziomie rodzajowym. Do dyskryminacji gatunków sinic, jako dodatkowy marker, we wcześniejszych badaniach wykorzystano skład węglowodorowy, ale w naszych badaniach nie udało się wykryć żadnej substancji z tej grupy. Co ciekawe, GLA był jedynym FA, który został wykryty w więcej niż trzech z 223 badanych szczepów. Dlatego też, szczepy sinic SAG można z grubsza podzielić na te, w których obecny jest GLA (kilka rodzajów) i te, w których prawie nie występują PUFA. Odpowiada to wcześniejszym ustaleniom, które opisywały dwudzielność cyjanobakterii, niezależnie od ich pozycji taksonomicznej, na rodzaje produkujące C-18 PUFA i te, które tego nie robią.

Prasinofitowy rodzaj Tetraselmis stanowił interesujący przykład do badania zmienności FA wśród blisko spokrewnionych izolatów. Dziewięć szczepów przypisanych do tego rodzaju zostało wyizolowanych z tego samego (morskiego) miejsca i uznanych przez izolatora za ten sam gatunek (U.G. Schlösser, pers. comm.). Tylko w dwóch szczepach obecny był DHA, ale w bardzo niewielkich ilościach (0,3% i 0,4%). W przeciwieństwie do tego, ARA i GLA występowały we wszystkich izolatach, a ich udział procentowy wahał się odpowiednio od 0,8% do 2,7% i od 0,5% do 7,3%.

2.2 Analiza wzorów dystrybucji FA

Wykryty skład kwasów tłuszczowych (FA) 2076 badanych szczepów został poddany analizie statystycznej w celu sprawdzenia, czy wśród różnych badanych grup glonów występują pewne wzory dystrybucji FA, które mogą odpowiadać ich związkom filogenetycznym. W pierwszym zestawie trzech analiz (wyższe poziomy taksonomiczne) sprawdzono 1) czy wzory dystrybucji FA mogą odzwierciedlać różnice pomiędzy filogenami glonów wywodzących się z pierwotnej (supergrupa Plantae) lub wtórnej endocytobiozie (Chromalveolates, Euglenoidy) w porównaniu z sinicami reprezentującymi pochodzenie plastydowe, 2) rozróżnienie filii w obrębie supergrupy Plantae (Chlorophyta, Streptophyta, Rhodophyta/Glaucophyta) i 3) główne linie ewolucyjne (klasy) w obrębie Chlorophyta. Drugi zestaw analiz koncentrował się na poziomie rodzajowym, tzn. sprawdzono, czy podział na rodzaje, oparty na wcześniejszych analizach sekwencji 18S rDNA sugerowanych dla Chlamydomonas s.l., Chlorella s.l. i Scenedesmus s.l., znajduje odzwierciedlenie we wzorcach dystrybucji FA. W przypadku pierwszego zestawu analiz wiele gatunków (266), które były reprezentowane jako wiele szczepów (np. Chlamydomonas moewusii, 28), musiało zostać zredukowanych do pojedynczego szczepu na gatunek, aby uniknąć błędu systematycznego. Obejmowało to również wiele szczepów niezidentyfikowanych na poziomie gatunku, tj. oznaczonych jako „sp.” zamiast nazwy gatunku (np. Chlorogonium sp., 26). Szczepy Chlorophyta należące do SAG były szczególnie bogate w takie wielokrotne szczepy. Wykluczono również te szczepy, w których wykryto tylko jeden FA. Zmniejszyło to całkowitą liczbę szczepów branych pod uwagę w naszych obliczeniach do 1193. Szczepy zostały następnie podzielone na jedenaście grup odpowiadających w przybliżeniu filarom lub klasom (plik dodatkowy 2). Szczepy należące do Chlorophyta (61% wszystkich badanych szczepów) zostały dalej podzielone na trzy klasy, Chlorophyceae, Trebouxiophyceae i Ulvophyceae, podczas gdy prasinofitowe szczepy zielonych glonów SAG (1,7% wszystkich rozważanych szczepów Chlorophyta) zostały wyłączone z analiz, ponieważ obejmowały tylko bardzo niewiele gatunków (10). Szczepy Glaucophyta (15) i Rhodophyta (81) potraktowano zbiorczo jako jedną złożoną jednostkę. Rhizaria – Chlorarachniophyta, była reprezentowana tylko przez jeden szczep i dlatego została pominięta w analizach statystycznych.

Analizy na wyższych poziomach taksonomicznych

Sprawdzono, czy wzorce dystrybucji składu FA na badanych szczepach odgraniczają od siebie trzy „nadgrupy” glonów eukariotycznych, Plantae, Chromalveolates i Excavates (Euglenoids), oraz sinice. Nadgrupa Plantae obejmuje wyłącznie eukarionty z plastydami pochodzącymi z pierwotnej endocytobiozy, tzn. cyjanobakteria została przekształcona w organellę poprzez pobranie i zatrzymanie przez komórkę gospodarza, po czym nastąpiła utrata znacznej części jej genomu. Glony chromalweolowe, jak również Euglenoidy (jedyna linia glonów należących do Excavates) nabyły swoje plastyda poprzez wtórną endocytobiozę odpowiednio od rodofitu i zielonej algi. Aby uwzględnić niemal równą liczbę szczepów dla wszystkich czterech grup, wybrano losowo 100 szczepów Plantae, Chromalveolates i Cyanobacteria, co odpowiada całkowitej liczbie rozpatrywanych szczepów euglenoidów (73). Rzędowość wynikająca z CVA (Canonical Variates Analysis, wielogrupowa analiza dyskryminacyjna) wskazała na silną różnicę pomiędzy sinicami/pierwotną endocytobiozą (Plantae) a dwiema grupami reprezentującymi wtórną endocytobiozę (Chromalveolates/Euglenoidy) (Rysunek 2). Zaobserwowana różnica została bez wyjątku poparta nieparametrycznymi testami istotności dla danych wielowymiarowych (NP-MANOVA i ANOSIM). Po zastosowaniu SIMPERa najniższe obserwowane niepodobieństwo (63,55%) wystąpiło pomiędzy Cyanobacteria a Plantae, natomiast najwyższe (77,29%) pomiędzy Plantae a Chromalveolates. Pierwsza zmienna kanoniczna (CV1) obejmowała 99,99% wszystkich możliwych różnic pomiędzy czterema grupami, dlatego też zbadano ewentualne korelacje pomiędzy tą osią a FA. Cztery FA były istotnie i wyłącznie skorelowane z pierwszym wariancie kanonicznym (CV1), tj. 16:0 (ρCV1 = -0,61/p < 0.001), 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,46/p < 0,001), 9-oktadekanamidem (ρCV1 = 0,41/p < 0,001) oraz 18:1(9Z) (ρCV1 = -0,17/p = 0,001). W drugiej analizie sprawdzono, czy rozkład FA pozwala na rozróżnienie filii supergromady Plantae, tj. dwóch linii zielenic, Chlorophyta i Streptophyta, oraz złożonej grupy Rhodophyta/Glaucophyta. Ponieważ ta ostatnia grupa z 54 szczepami była najmniejsza, porównano ją z równie dużymi próbkami losowymi z każdej z Chlorophyta i Streptophyta (tab. 3). Wykres rzędowości z CVA 162 badanych szczepów wyraźnie oddzielił grupę Rhodophyta/Glaucophyta od obu fylli zielenic (Ryc. 3). CV1 obejmowała 79% wszystkich możliwych różnic, a nawet CV2 z 21% nie była nieistotna. Testy istotności, NP-MANOVA i ANOSIM, potwierdziły odrębność wszystkich trzech grup. SIMPER wykazał, że grupa złożona Rhodophyta/Glaucophyta jest raczej niepodobna do obu fylli zielenic, tj. jej niepodobieństwo do Chlorophyta i Streptophyta wynosiło odpowiednio 70,55% i 71,53%. Najmniejsze niepodobieństwo (55,41%) spośród trzech badanych grup było pomiędzy Chlorophyta i Streptophyta. Pięć FA było istotnie i wyłącznie skorelowanych z CV1, tj. 18:3(9Z, 12Z, 15Z) (ρCV1 = 0,77/p < 0,001), 20:4 (ρCV1 = -0.49/p < 0,001), 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) (ρCV1 = -0,59/p < 0,001), 18:1(9Z) (ρCV1 = 0,30/p = 0,001) i 16:0 (ρCV1 = -0,56/p = 0, 001). Dwa FA były skorelowane wyłącznie z CV2, tj. dyskryminowały Chlorophyta i Streptophyta, 18:1(9Z) (ρCV2 = -0,4477/p < 0,001) i 9-oktadekanamid (ρCV2 = 0,34/p < 0,001). Zdecydowanie największa część wszystkich rozpatrywanych szczepów (60,3%) pochodziła z Chlorophyta, co sprawiło, że interesujące było sprawdzenie, czy rozkład FA może rozróżniać trzy klasy Chlorophyta: Chlorophyceae, Trebouxiophyceae i Ulvophyceae. Ulvophyceae było najmniejszą z tych trzech klas z zaledwie 49 szczepami i dlatego do analiz statystycznych wykorzystano losowe próbki o prawie takiej samej wielkości (54) z każdej z pozostałych dwóch klas. CVA nie ujawniła żadnych wyraźnych grup, tzn. analizowane szczepy miały tendencję do tworzenia trzech grup odpowiadających trzem klasom glonów zielonych, ale ze znacznym nakładaniem się ich na siebie (rys. 4). Jednak zarówno w zastosowanych testach istotności, jak i SIMPER stwierdzono, że te trzy klasy różnią się od siebie w sposób istotny. Te ostatnie oraz analizy korelacji pozwoliły uznać, że 9-oktadekanamid (ρCV1 = -0,58/p < 0,001; ρCV2 = -0,22/p < 0,010) oraz FA 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,44/p < 0.001; ρCV2 = -0,53/p < 0,001) jako jedyne zmienne dobrze dyskryminujące odpowiednio Ulvophyceae od Chlorophyceae/Trebouxiophyceae i Trebouxiophyceae od Ulvophyceae/Chlorophyceae.

Analizy na poziomie generycznym

Trzy poprzednie analizy wykazały, że relacje filogenetyczne na poziomie filii i klas wśród grup glonów były odzwierciedlone we wzorach dystrybucji FA przy użyciu dużej próby szczepów. Dlatego w drugiej grupie analiz sprawdziliśmy, czy różnice we wzorach dystrybucji FA mogą rozstrzygać o takim samym rozróżnieniu rodzajów, jak w analizach sekwencji genów rRNA. Aby to sprawdzić, wybraliśmy trzy rodzaje, które są szeroko wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych i dobrze reprezentowane przez szczepy SAG, tj. Chlorella s.l., Scenedesmus s.l. i Chlamydomonas s.l.. Ostatnie analizy sekwencji genu18S rRNA ujawniły, że każda z tych trzech grup jest para- lub polifiletyczna, obejmując kilka odrębnych rodzajów. Dla Chlamydomonas wybraliśmy 17 gatunków (53 szczepy), z których 9 było reprezentowanych przez wiele szczepów (np. C. reinhardtii, 16), które były rozmieszczone w pięciu niezależnych liniach/kladach (= rodzajach) w filogenezie 18S rDNA. W celu lepszej reprezentacji kladu „Oogamochlamys” uwzględniono również dwa szczepy z kolekcji UTEX (2213, 1753). Rzędowość NMDS wyraźnie oddzieliła członków kladu „Reinhardtii” (górny prawy na Rysunku 5), z wyjątkiem trzech szczepów, od tych z kladu „Chloromonas” (dolny lewy na Rysunku 5). Jednakże grupa „Chloromonas”, jak wykazały wzory FA, obejmowała również trzy badane szczepy z kladu „Moewusii” i cztery z kladu „Oogamochlamys”, co było sprzeczne z filogenezami 18S rDNA. Również w przeciwieństwie do filogenez rDNA, analizy FA rozdzieliły rodzaj Lobochlamys, tj. L. culleus należał do grupy „Chloromonas”, podczas gdy L. segnis do grupy „Reinhardtii”. Szczepy Oogamochlamys również zostały rozdzielone na obie grupy FA, w przeciwieństwie do ich przyporządkowania gatunkowego na podstawie analiz 18S rDNA.

Gatunki i szczepy wcześniej przypisane do jednego rodzaju Scenedesmus zostały wykazane jako faktycznie rozmieszczone na kilku rodzajach poprzez analizy sekwencji genów rRNA. Na przykład, rodzaj Acutodesmus został wyodrębniony z rodzaju Scenedesmus. Wykres NMDS ordination plot of FA distribution patterns ujawnił tendencję do rozmieszczenia badanych szczepów w dwóch skupieniach, tj. jedno skupienie 8 szczepów Acutodesmus (w tym głównie wiele szczepów A. obliquus) było wyraźnie oddzielone od drugiego skupienia zawierającego głównie szczepy Scenedesmus s.str. (Ryc. 6). Liczne szczepy S. vacuolatus zgrupowano razem z czterema innymi szczepami tego rodzaju, z wyjątkiem szczepu SAG 211-11n, który znajdował się blisko skupiska Acutodesmus. Natomiast liczne szczepy A. obliquus były rozmieszczone w obu skupieniach (rys. 6). Siedem szczepów A. obliquus tworzyło głównie skupisko Acutodesmus, podczas gdy pięć innych szczepów A. obliquus grupowało się razem ze szczepami Scenedesmus s.str. Oznacza to, że w obrębie tego samego gatunku zielenic, A. obliquus, istnieją dwa odmienne wzory FA. Odciski palców AFLP wykazały już duże zróżnicowanie genetyczne wśród wielu szczepów A. obliquus, podczas gdy porównania sekwencji ITS2 rDNA wykazały konspekcyjność wielu szczepów, z wyjątkiem SAG 276-20 (T. Friedl, obserwacje niepublikowane). Stwierdzenie wyodrębnienia szczepów A. obliquus w dwóch grupach wzorca FA przemawia zatem za tezą, że różnice genetyczne stwierdzone za pomocą AFLPs mogą odpowiadać różnym właściwościom fenotypowym. W związku z tym kluczowe znaczenie może mieć staranne rejestrowanie, który szczep został użyty w danym zastosowaniu. Chociaż stwierdzono, że szczep SAG 276-20 nie należy do tego samego gatunku, A. obliquus, jego wzór FA sugeruje, że może on nadal należeć do Acutodesmus, ponieważ został zgrupowany w klastrze Acutodesmus (rysunek 6).

Chlorella vulgaris stanowi kolejny przykład, w którym rozległe zróżnicowanie genetyczne wśród wielu szczepów tego samego gatunku zostało wykryte za pomocą analiz AFLP. 15 szczepów SAG C. vulgaris porównano z 19 innymi szczepami Chlorella i chlorella-podobnymi, tj. ich najbliższymi krewnymi w filogenezie 18S rDNA, C. sorokiniana i C. lobophora, członkami kladu Parachlorella sensu stricto oraz szczepami bardziej odległymi, tj. z kladów Watanabea i Prasiola sensu stricto. Ordynacja NMDS na podstawie rozkładu FA nie wykazała prawie żadnych różnic w obrębie wielu szczepów C. vulgaris i skupiła je razem, z wyjątkiem szczepu SAG 211-1e (Rysunek 7). Kolejne skupisko, odległe od C. vulgaris, utworzyli członkowie kladu Watanabea, podczas gdy glony podobne do chlorelli z kladu Prasiola nie były skupione razem.

.