Frontiers in Microbiology

Introduction

Bakteriofagi znalazły się w centrum zainteresowania badań naukowych, ponieważ odgrywają ważną rolę w prawie każdej społeczności mikrobiologicznej. Jako wirusowi drapieżcy bakterii, mają znaczący wpływ na populacje i dynamikę mikroorganizmów w różnych środowiskach. Istnieje kilka przeglądów traktujących o roli bakteriofagów w różnych środowiskach, takich jak morza czy organizm ludzki (Clokie i Mann, 2006; Wahida i in., 2016; Łusiak-Szelachowska i in., 2017). Od momentu ich odkrycia ponad 100 lat temu, osobno przez Fredericka Tworta, a następnie przez Felixa D’Herelle (Salmond i Fineran, 2015), bakteriofagi były wykorzystywane w krajach Europy Wschodniej do leczenia medycznego infekcji bakteryjnych, podczas gdy w pozostałej części świata protagonistami były antybiotyki (Myelnikov, 2018). Obecnie, gdy zakażenia wieloopornymi bakteriami stały się ogólnoświatowym zagrożeniem (Zaman i in., 2017), pacjenci z całego świata są leczeni w Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology, and Virology, w Tbilisi w Gruzji, który ma chyba najdłuższe doświadczenie w terapii bakteriofagowej (Kutateladze i Adamia, 2008), a także w Zakładzie Terapii Bakteriofagowej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu w Polsce (Międzybrodzki i in., 2012). Zastosowanie bakteriofagów mogłoby być nie tylko cennym rozwiązaniem w sektorze medycznym, ale również w innych dziedzinach, w których bakterie mogą mieć negatywny wpływ.

Niektóre firmy w Stanach Zjednoczonych, takie jak OmniLytics Inc. (Sandy, UT, Stany Zjednoczone) i Intralytix Inc. (Baltimore, MD, Stany Zjednoczone) opracowały różne produkty bakteriofagowe do stosowania jako środki dezynfekujące w przemyśle spożywczym, które mogą być używane przeciwko Salmonella, Escherichia coli i Listeria monocytogenes. W Europie holenderska firma Micreos BV (Wageningen, Holandia) również wprowadziła na rynek produkty bakteriofagowe przeciwko Salmonelli i E. coli, a niemiecka firma, Fink Tec (Hamm, Niemcy), ukierunkowane na E. coli (Moye i in., 2018). Oczekuje się szerszego zastosowania bakteriofagów w łańcuchu wartości żywności, w tym w rolnictwie i akwakulturze, gdzie szerokie spektrum różnorodnych patogenów roślin i ryb powoduje znaczące straty ekonomiczne (Buttimer i in., 2017; Doss i in., 2017).

Pomimo że niektóre produkty bakteriofagowe są już komercjalizowane, nie osiągnięto jeszcze skutecznego, stałego i kontrolowanego procesu produkcji bakteriofagów. Produkcja fagów w laboratoriach może być uważana za proces rutynowy, a protokoły są dobrze zdefiniowane; jednakże, procesy te nie są łatwe do skalowania. Podmioty przemysłowe są najbardziej zainteresowane uzyskaniem niezawodnych metod produkcji fagów, umożliwiających skalowanie procesu. Jednak rozwiązanie tego problemu nie jest łatwe, ze względu na biologiczną naturę systemu i różnorodne rodzaje interakcji, które zachodzą pomiędzy fagami i bakteriami.

Podjęto kilka prób wygenerowania niezawodnych metod produkcji bakteriofagów. Niektórzy badacze zastosowali podejście teoretyczne z modelami symulacyjnymi, podczas gdy inni przyjęli podejście praktyczne poprzez eksperymenty. Ten mini-przegląd analizuje wybrane przykłady obu podejść, porównując ich główne różnice.

Ogólności w produkcji bakteriofagów

Biologiczna natura bakteriofagów wymusza ich reprodukcję w komórce gospodarza. Dlatego metoda produkcji bakteriofagów wymaga procesu produkcyjnego obejmującego co najmniej dwie jednostki operacyjne, wzrost bakterii gospodarza i rozmnażanie bakteriofagów (lub infekcję). Ważne jest, aby rozważyć podstawowe parametry wzrostu bakterii i infekcji fagowej, takie jak wybrane substraty dla bakterii i optymalna temperatura, zarówno dla wzrostu bakterii, jak i infekcji fagowej, ponieważ czynniki te mogą wpływać na infekcyjność fagów (Tokman i in., 2016). Podobnie, ważne jest, aby znać biologię fagów, które mają być produkowane, w tym różne parametry infekcji, takie jak szybkość adsorpcji, wielkość rozerwania i okres utajony; jednakże, jak zostanie to omówione później, parametry te mogą się zmieniać w zależności od warunków infekcji (Santos i in., 2014). Co ważniejsze, zaleca się dogłębne zrozumienie specyficznych interakcji, jakie mogą zachodzić pomiędzy gospodarzem bakteryjnym a wybranym fagiem, takich jak obecność systemu CRISPR-cas w bakterii, ponieważ czynniki te mogą mieć silny wpływ na proces infekcji fagowej (Levin i in., 2013). Zaleca się również wybór niewirulentnego szczepu bakteryjnego jako gospodarza. Produkcja bakteriofagów na poziomie przemysłowym będzie wymagała dużych ilości bakterii gospodarza, dlatego unikanie stosowania wirulentnych lekoopornych, a zwłaszcza wieloopornych patogenów powinno być obowiązkowe w procesie produkcji fagów (Torres-Barceló, 2018). To samo dotyczy bakterii niosących profagi, ponieważ mogłyby one być indukowane w trakcie procesu, zmieniając ostateczny wynik (Stewart i Levin, 1984).

Zawodny proces produkcji bakteriofagów na dużą skalę może być bardzo nieuchwytny, ponieważ dane uzyskane w laboratorium nie zawsze są przydatne do skalowania procesów biologicznych (Kwok, 2010). Naukowcy próbowali wypełnić tę lukę głównie poprzez badania nad produkcją bakteriofagów oparte na symulacjach komputerowych, a niektóre z nich zostały zweryfikowane eksperymentalnie. Tutaj, przeanalizujemy najpierw badania teoretyczne skupione na modelach produkcji fagów, a następnie wybrane badania, które zostały zwalidowane eksperymentalnie. Wszystkie przypadki zgadzają się z kryteriami oznaczeń dla dalszego oczyszczania i walidacji produktu opartego na bakteriofagach, a niektóre z nich zostały uwzględnione w obu rozdziałach (Santos i in., 2014; Nabergoj i in., 2018a).

Teoretyczne modele produkcji fagów

Aby opisać proces produkcji fagów za pomocą modelu matematycznego, ważne jest określenie parametrów kinetycznych, które należy uwzględnić w modelu. Trzema podstawowymi parametrami dla produkcji fagów są populacje podatnych niezakażonych bakterii, bakterii zakażonych fagiem oraz wolne fagi (Krysiak-Baltyn i in., 2016). Wychodząc z tego założenia, różne modele uwzględniły dodatkowe zmienne, takie jak oporne niezakażone bakterie (Santos i in., 2014; Chaudhry i in., 2018) lub wiele gatunków bakterii (Levin i in., 1977). Wszystkie te populacje wchodzą w interakcje kontrolowane przez parametry kinetyczne związane ze wzrostem bakterii i infekcją fagową. Uważa się, że dobrze wiadomo, które stałe są ważne dla bakterii; jednak w przypadku bakteriofagów jest to wciąż przedmiotem dyskusji. Istnieje zgoda co do tego, że stała adsorpcji, okres latencji i wielkość rozpadu są ważnymi zmiennymi, które należy rozważyć; jednak ich znaczenie w modelu różni się w zależności od badań. Ponadto, różni autorzy stosują różne nazewnictwo do definiowania parametrów kinetycznych, co stanowi jedną z głównych trudności w porównywaniu różnych modeli i ujednolicaniu ogólnej wiedzy na ten temat. Na przykład, szybkość adsorpcji fagów (wskaźnik cząsteczek fagów zaadsorbowanych na bakteriach) jest powszechnie określana symbolem „δ”; jednakże Beretta i Kuang (1998) użyli symbolu „K”, który może być również symbolem stałej Monoda specyficzności substratowej „Ks”. Inne przykłady odmiennej nomenklatury można znaleźć w tabeli 1. Podobnie jak w innych procesach biologicznych, oczekuje się, że autorzy pracujący w dziedzinie modeli wzrostu fagów-bakterii uzgodnią określone słownictwo algebraiczne lub zamieszczą w swoich artykułach jasne wyjaśnienie terminów i jednostek oraz przejrzystą nomenklaturę, co ostatnio stwierdzili Krysiak-Baltyn i wsp. (2018). W oparciu o nomenklaturę stosowaną przez innych autorów (Tabela 1) proponujemy użycie znaków greckich do nazwania poszczególnych parametrów kinetycznych w rozmnażaniu fagów. Wielkość burstu może być symbolizowana przez β, szybkość adsorpcji przez δ, czas zaćmienia przez ε, a szybkość rozpadu faga przez λ. Jedynymi wyjątkami byłyby stężenie faga, które jest powszechnie znane jako „P”, oraz czas latencji, znany jako „L”. Jednolitość w tym matematycznym języku ułatwi zrozumienie i eksplorację danych dla przyszłych akademickich lub przemysłowych recenzentów.

Począwszy od Campbella (1961), podjęto wiele wysiłków w celu opisania modeli produkcji bakteriofagów, opisujących zachowanie populacji fagów w różnych warunkach i przy użyciu różnych metod. Tabela 1 podsumowuje różne modele produkcji fagów, podane jako równania różniczkowe lub całkowe (w zależności od decyzji każdego z autorów), wymieniając specyficzne względy dla każdego modelu.

Modele produkcji fagów są ogólnie spójne w opisie zmian populacji fagów w czasie. Może to być reprezentowane jako kinetyczna zmiana w cząsteczkach fagów lub jednostkach tworzących płytki (PFU) na jednostkę czasu, końcowe stężenia uzyskane po procesie wsadowym lub podczas okresu czasu w procesie ciągłym. Pomimo ogólnej zgody, modele te różnią się w kilku stwierdzeniach. Modele zaproponowane przez Campbella (1961) oraz Berettę i Kuanga (1998) są spójne w bilansowaniu cząstek fagów z warunkami generacji (uwalnianie cząstek bakteriofagów na jednostkę czasu) i utratą wolnych bakteriofagów z powodu adsorpcji lub szybkości rozpadu; modele te są użyteczne ze względu na ich prostotę i wykorzystanie standardowych parametrów wzrostu fagów, takich jak szybkość adsorpcji, wielkość rozpadu i czas utajenia, i są szybkim sposobem symulacji procesów produkcji wsadowej, ale nie mogą pasować do procesów takich jak populacje bakterii opornych lub ewolucja fagów w czasie. Modele te mają również tendencję do niedoszacowania wpływu parametrów takich jak wielkość burstu i okres utajony, podczas gdy nowsze modele pokazały znaczenie tych parametrów i to, jak mogą się one zmieniać w zależności od innych czynników (Santos i in., 2014; Nabergoj i in., 2018b).

Ciekawy model zaproponowany ostatnio przez Santosa i in. (2014) uwzględnia wpływ tempa wzrostu bakterii na stałą adsorpcji fagów oraz równanie rozkładu normalnego, które rządzi wartościami okresu utajonego, biorąc pod uwagę zmienność tych parametrów. Model ten okazał się bardzo przydatny, ponieważ daje możliwość oceny wpływu substratu na produkcję fagów, a uwzględnienie w modelu tempa wzrostu bakterii daje pośrednie narzędzie do uwzględnienia stanu fizjologicznego bakterii w trakcie procesu. Zależność parametrów infekcji bakteriofagowej od tempa wzrostu bakterii była później badana również przez innych autorów (Krysiak-Baltyn i in., 2018; Nabergoj i in., 2018b); Nabergoj i współpracownicy stwierdzili, że rozmiar burst wzrastał liniowo wraz z tempem wzrostu bakterii, podczas gdy stała adsorpcji i okres utajony malały.

Inne modele badały wpływ wielu gatunków bakterii, a także występowanie oporności bakterii (Levin i in., 1977; Santos i in., 2014; Chaudhry i in., 2018). Chociaż celem tych badań nie zawsze było opracowanie metod produkcji fagów, są one przydatne do opisania potencjalnych sytuacji, jakie mogą wystąpić podczas tego procesu. Modele te obejmują zmienne związane z selekcją oporności bakterii i szybkością odwracania jako funkcją populacji bakterii (dostępność mniej lub bardziej podatnych bakterii w czasie), definiując warunki, w których podatne i oporne bakterie mogą współistnieć, takie jak silna selektywna niekorzystna sytuacja u bakterii opornych (na przykład niższe tempo wzrostu), i/lub istnienie schronienia przestrzennego (lub schronienia gęstości), w którym (poniżej którego) fag nie jest w stanie zainfekować bakterii. Chaudhry i wsp. (2018) zaproponowali interesujące wyjaśnienie tego, jak fagi mogą przetrwać w populacjach zdominowanych przez bakterie oporne, sugerując, że te ostatnie mogą produkować bakterie podatne na zakażenie w częstotliwościach, które pozwoliłyby na replikację fagów. Co ciekawe, zjawisko to było już wcześniej sugerowane (Bastías et al., 2010). Generowanie szczepów opornych na fagi w systemach produkcji fagów może być powodem do niepokoju i dlatego powinno być uwzględnione w rozwoju nowych metod, aby zminimalizować tę możliwość. Kilku autorów sugeruje, że tego problemu można uniknąć dzięki konfiguracji produkcji fagowej, co zostanie omówione w następnym rozdziale.

Innym ciekawym opracowaniem jest praca Krysiak-Baltyn i wsp. (2018), która również uwzględnia zmienne parametry infekcji jako funkcję szybkości wzrostu bakterii oraz szacuje koszty operacyjne i produktywność w symulowanym dwustopniowym systemie procesowym. Jednym z ważnych wniosków z tej teoretycznej pracy jest to, że optymalne stężenie substratu dla wzrostu bakterii nie powinno być koniecznie takie samo dla produkcji bakteriofagów, a zgodnie z ich analizą koszt na mL fagów przy stężeniu 4 × 1010 fagów/mL może być tak niski jak 1,78 × 10-2 $. Byłoby interesujące doświadczalne zatwierdzenie tego oszacowania i określenie, jak jest ono dostosowane do różnych gospodarek lub krajów.

Wreszcie, ewolucja bakteriofagów musi być również rozważana w procesie produkcji, ponieważ fagi mogą zwiększać lub zmniejszać swoją wydajność do infekowania bakterii w czasie (Lenski i Levin, 1985). Koncepcja ta może być przedstawiona jako wskaźniki infekcji w eksperymentach dotyczących zasięgu gospodarza, gdzie nawet metody rozszerzania zasięgu gospodarza mogą być osiągnięte dla zastosowań terapii fagowej (Mapes et al., 2016). Sytuacja ta została zasymulowana w hodowlach wsadowych, pokazując, że pojawianie się mutantów fagowych jest silnie zależne od elastyczności genetycznej fagów (tempa mutacji) (Levin i Bull, 2004). Możliwość przewidzenia ewolucji fagów podczas produkcji byłaby pomocna w ustawieniu procesu produkcyjnego minimalizującego prawdopodobieństwo zmiany właściwości litycznych fagów. Recenzowane artykuły pokazują, że modele produkcji bakteriofagów są ważnym podejściem, które może pomóc w znalezieniu najlepszych strategii, jednakże wymagają one eksperymentalnej walidacji.

Doświadczenia doświadczalne w produkcji bakteriofagów

Istnieje kilka praktycznych badań dotyczących produkcji fagów. Niektóre z nich koncentrują się na produkcji fagów w bioreaktorach, podczas gdy inne skupiają się na ocenie i optymalizacji procesu. Zgodnie z oczekiwaniami, doświadczenia te uwzględniają również etap wzrostu bakterii i infekcji/propagacji fagów w kolbach i bioreaktorach (Tabela 2). Dane te są użyteczne, aby dać wgląd w to, jak pewne modele gospodarz-bakteriofag mogą być wykorzystane do propagacji i zwiększenia poziomu produkcji fagów. Najczęściej stosowanymi systemami gospodarz-fag są szczepy E. coli i ich fagi, prawdopodobnie z powodu dużej ilości informacji dotyczących tych systemów bakteryjno-fagowych (fagi E. coli T3, T4 i T7) i braku informacji o innych systemach bakteryjno-fagowych.

Według jednego z opisanych przypadków, uzyskane miana mogą wynosić nawet 1,2 × 1016 PFU mL-1 w bioreaktorze okresowym (5 L) (Sochocka i in., 2015). Ten poziom produkcji zgadza się z produkcją potrzebną do celów terapeutycznych (>1 1010 PFU mL-1), biorąc pod uwagę etapy oczyszczania, szybkość rozpadu fagów i stabilność lub okres przechowywania (Naghizadeh et al., 2018). Inni autorzy również odnotowali obiecujące poziomy produkcji 5 × 1012 PFU mL-1 w 1,2 L (Warner i in., 2014) oraz 2,4 × 1013 PFU dzień-1 w 1 L (Nabergoj i in., 2018a; Tabela 2).

Trudno jest ustalić porównania dotyczące tego, która metoda może być bardziej wydajna, ponieważ wykorzystują one różne procedury hodowli i różne systemy gospodarz-bakteriofag. Hodowla wsadowa jest najtańszym (nie najprostszym) sposobem produkcji bakteriofagów, ale jest wysoce ograniczona przez maksymalną objętość dostępnego sprzętu, całkowity czas działania i dostępność substratów (wyższe stężenia mogą być hamujące dla wzrostu bakterii). Hodowla ciągła ma większą skalowalność, gdy optymalizuje się szybkość rozcieńczania bakterii poprzez modyfikację strumienia wlotowego i wylotowego. Ponadto, regulacja szybkości rozcieńczania pozwoli na bezpośrednią kontrolę nad szybkością wzrostu bakterii, co ma bezpośredni wpływ na parametry infekcji, takie jak wielkość pęcherzyków, stała adsorpcji i okres utajony (Mancuso i in., 2018; Nabergoj i in., 2018b). Szybkość rozcieńczania może być również wykorzystana do zwiększenia produktywności systemu, co zostało wykazane przez Nabergoj i wsp. (2018a), gdzie maksymalna produktywność fagów wynosząca 109 fagów mL-1 h-1 została osiągnięta przy niskiej szybkości rozcieńczania wynoszącej 2 h-1 w systemie cellstat o pojemności 1 L. System pracy ciągłej może funkcjonować stale, dlatego jest najwygodniejszym sposobem wytwarzania produktu biotechnologicznego dla przedsiębiorstwa. Są one jednak trudne i kosztowne w realizacji, wymagają stałego monitorowania w celu utrzymania stanu ustalonego. Całkowicie ciągły proces wzrostu bakterii i produkcji bakteriofagów mógłby zwiększyć prawdopodobieństwo wystąpienia oporności na bakteriofagi, jeśli nie zostaną przyjęte określone środki zaradcze (Middelboe i in., 2001).

Niektórzy autorzy sugerują wdrożenie procesów dwuetapowych, jednego wyłącznie do produkcji bakterii, a drugiego do propagacji fagów (Schwienhorst i in., 1996; Sauvageau i Cooper, 2010; Nabergoj i in., 2018a). Można to osiągnąć za pomocą systemu cellstat, w którym dwa bioreaktory są połączone szeregowo ze stałym przepływem przez układ. W tym przypadku, natężenie przepływu pomiędzy reaktorami i objętość w każdym reaktorze (a także stopień rozcieńczenia i tempo wzrostu bakterii przez dodanie) mogą być kontrolowane w celu osiągnięcia maksymalnej wydajności (Nabergoj i in., 2018a). Inny ciekawy układ zaproponowany przez Sauvageau i Coopera (2010) składa się z półciągłego systemu dwustopniowego, samocyklującego procesu. W tym przypadku, każdy z etapów funkcjonuje podobnie do hodowli wsadowej, gdzie bakterie są najpierw hodowane oddzielnie od fagów, a następnie wprowadzane do etapu namnażania fagów po osiągnięciu odpowiedniego stężenia, umożliwiając w ten sposób rozpoczęcie procesu infekcji przy użyciu pożądanej mnogości infekcji (Kasman i in., 2002). Ta konfiguracja ma również tę zaletę, że nie wymaga stałego monitorowania w celu utrzymania stanu ustalonego systemów ciągłych i została wykorzystana do uzyskania wydajności 7.59 × 1014 PFU mol CO2-1 (Sauvageau i Cooper, 2010). Oba przykłady, system cellstat i dwuetapowy proces samocyklingu, mają tę wielką zaletę, że bakterie są hodowane w nieobecności fagów, dlatego oporność na bakteriofagi nie jest preferowana podczas procesu.

Na koniec, ważne jest, aby zauważyć, że istnieją pewne parametry, które nie zawsze są podawane w badaniach dotyczących produkcji bakteriofagów. Na przykład, parametry takie jak proporcje napowietrzania lub dopływ powietrza do bioreaktora są wymienione tylko w dwóch raportach (Sauvageau i Cooper, 2010; Santos i in., 2014), mimo że jest to jeden z najważniejszych parametrów w produkcji bakterii na poziomie przemysłowym. Informacje o innych parametrach, takich jak transfer energii, różne sposoby wykorzystania substratów, konstrukcja bioreaktora, mieszadła, śmigła i materiały konstrukcyjne w produkcji bakteriofagów są skąpe lub nie istnieją.

Wniosek końcowy

Ponowne odkrycie potencjalnego wykorzystania fagów w szerokim spektrum zastosowań jest bardzo ekscytujące i obiecujące. Dowody sugerują, że należy preferować systemy do produkcji bakteriofagów, które zmniejszają prawdopodobieństwo pojawienia się oporności na bakteriofagi, takie jak cellstat lub dwustopniowy proces samocyklujący. Opcje te pozwoliłyby również na kontrolowanie zmiennych w celu zwiększenia wydajności procesu. Niemniej jednak, modele produkcji bakteriofagów są dalekie od ustalenia i mogą być ulepszone na kilka sposobów. Wciąż pozostaje wiele wyzwań do pokonania. Potrzebne są dalsze badania nad zoptymalizowaną produkcją bakteriofagów na dużą skalę, kosztami infrastruktury i sprzętu, różnymi obawami dotyczącymi bezpieczeństwa i dawkowania, a doświadczenie sugeruje, że te wyzwania powinny być stawiane przy współpracy partnerów akademickich i przemysłowych.

Na koniec, ważne jest, aby zauważyć, że większość modeli do produkcji bakteriofagów może być stosowana w określonym zakresie wartości parametrów infekcji fagowej i wzrostu bakterii. Dlatego, niezależnie od ważnych postępów w modelach i ustawieniach produkcji fagów, dogłębna znajomość specyficznego systemu fag-bakteria będzie zawsze pierwszym wymogiem w celu ustanowienia wydajnego systemu produkcji fagów.

Wkład autorów

RG, SL, i RB wymyślili pracę i napisali manuskrypt. KG, GH, i JR napisali część manuskryptu. Wszyscy autorzy przyczynili się do przeglądu bibliograficznego, rewizji manuskryptu, przeczytali i zatwierdzili przedłożoną wersję.

Funding

Ta praca została sfinansowana przez CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 i Postdoctorado PUCV 2018.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy deklarują, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

RG dziękuje CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL thanks Postdoctorado PUCV 2018.

.