Frontiers in Pharmacology

Introduction

Stosowanie naturalnych środków leczniczych jest starożytną tradycją nadal praktykowaną, przy czym >60% światowej populacji zajmuje się różnymi problemami zdrowotnymi, w tym nowotworami, stosując medycynę tradycyjną jako pierwszy wybór (Sultana et al., 2014). Jednak leczenie nowotworów jest złożone, a obecne możliwości dla pacjentów zależą od rodzaju i stadium nowotworu, oprócz wieku, płci i ogólnego stanu zdrowia pacjenta. Chociaż chemioterapia jest zwykle skuteczna we wczesnych stadiach raka, jej skuteczność zależy od schematu podawania leku i stanu fizjologicznego pacjenta. Niemniej jednak, głównym problemem związanym z chemioterapią jest jej toksyczność, ponieważ stosowane leki mają tendencję do wpływania na komórki nowotworowe, jak również na komórki prawidłowe, z wysokim indeksem proliferacyjnym generującym uszkodzenia uboczne u pacjentów. Co więcej, komórki nowotworowe mogą rozwinąć oporność na leczenie, dając przerzuty, a tym samym osłabiając odpowiedź na leczenie i zmniejszając możliwość przeżycia wolnego od choroby. Dlatego jednym z kluczowych wyzwań w odkrywaniu leków jest zmniejszenie toksyczności środków chemioterapeutycznych i opracowanie bardziej skutecznych i wydajnych leków w celu poprawy leczenia, czasu powrotu do zdrowia i ogólnej jakości życia pacjentów.

Produkty naturalne stanowią bogate źródło struktur chemicznych do rozwoju terapii przeciwnowotworowych. W dziedzinie farmacji onkologicznej 49% leków stosowanych w chemioterapii pochodzi ze źródeł naturalnych, takich jak rośliny, mikroorganizmy i organizmy morskie, lub jest przez nie inspirowanych (Newman i Cragg, 2016). Przykłady obejmują alkaloidy vinca i taksany (środki wiążące tubulinę), a także podofilotoksyny, antracykliny i etopozydy (inhibitory topoizomerazy) (Da Rocha i in., 2001; Nobili i in., 2009). Przykłady te ilustrują potencjał produktów naturalnych w odkrywaniu leków.

AAs są wtórnymi metabolitami wytwarzanymi przez rodzinę Annonaceae (Rysunek 1). W medycynie tradycyjnej owoce z rodzaju Annona są stosowane w leczeniu gorączki, bólu, reumatyzmu, biegunki i zapalenia stawów, a ich liście w leczeniu cukrzycy, bólów głowy i bezsenności (Moghadamtousi et al., 2015a). Annona reticulate była stosowana w Afryce jako środek przeciwdysenteryczny i przeciwrobaczy, a A. squamosa jest wykorzystywana w Indiach do leczenia różnych schorzeń, w tym nowotworów złośliwych (Savithramma i in., 2011). Ponadto, A. muricata jest popularnym środkiem leczniczym w Ameryce, Afryce i Indiach w leczeniu nowotworów (Moghadamtousi et al., 2015a), natomiast w Meksyku A. macroprophyllata, A. muricata i A. purpurea są stosowane w leczeniu guzów skóry i raka żołądka (Alonso-Castro et al., 2011; Brindis et al., 2013). Według etnofarmakologicznego przeglądu roślin leczniczych w Meksyku, rodzaj Annona może być również badany w leczeniu raka jelita grubego (Jacobo-Herrera i in., 2016). Dowody te wskazują, że AA są molekułami o znaczącym potencjale bioaktywnym.

Do tej pory opisano ponad 500 AA; związki te charakteryzują się długim łańcuchem alifatycznym z α, β-nienasyconym pierścieniem γ-laktonowym i 0-3 pierścieniami tetrahydrofuranu (THF) (Yuan i in., 2015), i wykazały aktywność cytotoksyczną wobec różnych ludzkich linii komórkowych raka (tj. płuc, piersi, okrężnicy, nerek, trzustki, prostaty, wątroby i pęcherza moczowego) (przegląd w Zeng i in., 1996; Chávez i Mata, 1998; Wang et al., 2002; Yuan et al., 2003; Mangal et al., 2016; Miao et al., 2016a; Miao et al., 2016b) oprócz aktywności przeciwnowotworowej in vivo (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b). W niniejszym artykule dokonaliśmy przeglądu najnowszych doniesień na temat AAs w dziedzinie odkrywania leków w onkologii.

Materiały i Metody

Wykonaliśmy wyszukiwanie w bazie PubMed z użyciem następujących terminów kluczowych: „acetogeniny i rak”, „acetogeniny aktywność antytumorowa”, „acetogeniny cytotoksyczność” i „acetogeniny mechanizm działania”, wśród innych kombinacji. Dokonaliśmy przeglądu artykułów opublikowanych w ciągu ostatnich 15 lat, które opierały się na dwóch kryteriach: rośliny o zastosowaniu leczniczym oraz metodologia frakcjonowania wspomagana testami biologicznymi. Dane in vitro są oparte wyłącznie na aktywności czystych związków, podczas gdy w badaniach in vivo, ekstrakty ziołowe były również brane pod uwagę ze względu na brak badań w modelach zwierzęcych.

Wyniki i dyskusja

Badania in vitro

W dziedzinie produktów naturalnych, poszukiwanie bioaktywnych cząsteczek zazwyczaj wiąże się z frakcjonowaniem ekstraktów metodą bioassay-guided w celu znalezienia głównej cząsteczki lub cząsteczek odpowiedzialnych za aktywność. Jednakże, wiele wtórnych metabolitów może być ukierunkowanych na wiele cech nowotworów. Ogólnie rzecz biorąc, przemysł farmaceutyczny jest zainteresowany lekami, które wykazują więcej niż jedną interakcję molekularną i obejmują różne cele molekularne.

Acetogeniny są cząsteczkami o wielkim potencjale dla przyszłej terapii przeciwnowotworowej. Ich najbardziej znaczącą aktywnością biologiczną jest hamowanie mitochondrialnego Kompleksu I dzięki ich strukturze bis-THF. Rzeczywiście, wcześniej stwierdzono, że mono-THF AAs posiadające łańcuch alkilowy łączący cząsteczkę laktonową z grupą THF są niekompetycyjnymi inhibitorami kompleksu I (tj. oksydoreduktazy NADH: ubichinon) w łańcuchu oddechowym, co prowadzi do blokady fosforylacji oksydacyjnej i w konsekwencji do zmniejszenia produkcji ATP (Tormo i in., 1999; Chen i in., 2012). Takie zahamowanie obejmuje dużą grupę szlaków, które mogą indukować śmierć komórki, w tym apoptozę i autofagię, lub działać w innych sieciach metabolicznych jako inhibitory enzymu dehydrogenazy mleczanowej A, jako przeciwutleniacz lub poprzez zatrzymanie cyklu komórkowego.

Co więcej, A. muricata (Moghadamtousi i in., 2015a) i A. squamosa L. (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b; Chen et al., 2012c; Chen et al., 2016) zostały zgłoszone, aby mieć aktywność cytotoksyczną przeciwko kilku ludzkim lub innym liniom komórek nowotworowych ssaków. W szczególności, AA annosquatins A (1) i B (2) wykazują selektywność wobec linii komórkowych MCF-7 i A-549, odpowiednio (Chen et al., 2012c). W tabeli 1 przedstawiono ostatnio odkryte AA wykazujące aktywność cytotoksyczną, a także inne, mniej aktualne związki, które wykazują aktywność przeciwnowotworową in vivo (tabela 2).

Apoptoza jest naturalną strategią śmierci komórkowej, która zabija niepotrzebne lub uszkodzone komórki. Głównymi genami zaangażowanymi w ten proces są p53 i rodzina bcl2; pierwszy z nich jest supresorem nowotworu, natomiast drugi może być proapoptotyczny (m.in. BAD, BAX i BAK) lub antyapoptotyczny (bcl2, i bcl-x) (Okada i Mak, 2004). Podstawową funkcją p53 jest zapobieganie replikacji komórek z uszkodzeniami DNA. Dlatego p53 jest nieaktywny, a uszkodzone komórki nadal rosną i replikują mutacje DNA, co prowadzi do chorób takich jak nowotwory (Igney i Krammer, 2002; Okada i Mak, 2004). Dlatego też dotychczasowe badania można podzielić na dwa główne tematy: indukcja apoptozy lub mechanizmy oporności na apoptozę.

Obecne chemioterapeutyki indukujące apoptozę powodują poważne skutki wtórne u pacjentów. W związku z tym priorytetem jest poszukiwanie mniej toksycznych leków, a produkty naturalne mają pomóc w opracowaniu leków modulujących apoptozę. W tym kontekście, AA zwiększają aktywność kaspazy 3 i 8 (efektorów apoptozy), podczas gdy zmniejszają ekspresję survivinu i Bcl-2, zwiększając w ten sposób apoptozę. AA annonacyna (3) promuje apoptozę w komórkach nowotworowych poprzez aktywację szlaków kaspazy 3 i Bax (Yuan i in., 2003), podczas gdy skwamocyna indukuje apoptozę poprzez ekspresję proapoptotycznych genów Bax i Bad, co skutkuje rozszczepieniem PARP i zwiększoną aktywnością kaspazy 3 w komórkach raka pęcherza moczowego T24 (Yuan i in., 2006). Kontrastuje to z wcześniejszymi wynikami, w których skwamocyna nie indukowała apoptozy w komórkach raka piersi, ale hamowała proliferację poprzez blokowanie cyklu komórkowego w fazie G1 (Raynaud i in., 1999).

Metanolowy ekstrakt z A. reticulata hamuje ekspresję kaspaz 6 i 9 w komórkach raka okrężnicy i wątroby (Mondal i in., 2007), podczas gdy organiczne i wodne ekstrakty A. squamosa obniżają ekspresję Bcl-2 w komórkach raka piersi MCF-7 i komórkach białaczki K-562, wskazując na ich działanie jako induktorów apoptozy (Pardhasaradhi et al., 2005). Ponadto ekstrakt z liści A. muricata indukuje ekspresję kaspaz 3 i 9 oraz hamuje proliferację komórek poprzez zmniejszenie fosfo-ERK i fosfo-AKT w komórkach MIA PaCa-2 (Yiallouris et al., 2018).

As prowadzą również do zatrzymania cyklu, co ma wpływ na proliferację komórek nowotworowych. AAs regulują cykl komórkowy w przejściu G1/S poprzez hamowanie ekspresji cykliny D1 w ludzkich komórkach raka wątrobowokomórkowego (Qian i in., 2015). W tym kontekście, ekstrakt z A. muricata zatrzymuje cykl komórkowy w fazie G1 i zmniejsza liczbę komórek w fazie S w sposób zależny od stężenia poprzez zmniejszenie ekspresji cykliny D1, ważnego białka regulacyjnego cyklu komórkowego (Torres i in., 2012). Podobny efekt zaobserwowano w przypadku skwamocyny, która zatrzymuje komórki w fazie G1 w komórkach raka pęcherza moczowego T24 (Yuan i in., 2006). Pomimo istotności cyklu komórkowego, niewiele badań dotyczyło tego, jak AAs wpływają na ten mechanizm.

Glikoliza tlenowa, mechanizm wykorzystywany przez komórki nowotworowe do pozyskiwania energii przy braku tlenu (Figueroa-González i wsp., 2016; García-Castillo i wsp., 2017), jest również celem AAs. Różne białka i enzymy glikolityczne są upregulowane przez HIF-1, ważny czynnik transkrypcyjny zaangażowany w glikolizę tlenową w komórkach nowotworowych. Co ciekawe, ekstrakt z A. muricata obniżył ekspresję HIF-1α i NF-κB, a także poziom transportera glukozy GLUT1 oraz enzymów HKII i LDHA w komórkach raka trzustki (Torres i in., 2012). Ponadto ekstrakt z liści A. muricata wykazywał działanie antyproliferacyjne w nowotworowych liniach komórkowych i promował śmierć komórek poprzez hamowanie pomp NKA i SERCA (Yiallouris i in., 2018).

Z drugiej strony, gen MDR1 koduje glikoproteinę P błony komórkowej, kluczowe białko transporterowe, które ekstruduje leki przeciwnowotworowe z wnętrza komórek, ograniczając w ten sposób ich wewnątrzkomórkową akumulację i zmniejszając ich toksyczność (Figueroa-González et al., 2012). Metabolity wtórne, takie jak flawonole, ginsenozydy, polifenole, alkaloidy i glikozydy żywicy, wykazały interesujące wyniki w modulowaniu P-gp w liniach komórek nowotworowych (Phang i in., 1993; Beck i in., 1988; Silva i in., 2001; Jodoin i in., 2002; Zhou i in., 2004; Figueroa-González i in., 2012). Ponadto, AAs mogą obniżać ekspresję genów MDR1 i MRP1 w lekoopornym ludzkim raku wątrobowokomórkowym, jak również ekspresję topoizomerazy IIα i S-transferazy glutationowejΠ (Qian et al., 2015).

Ostatnio autofagia wzbudziła zainteresowanie jako mechanizm śmierci komórki. Autofagia jest procesem katabolicznym, który komórki eukariotyczne aktywują, gdy znajdują się pod wpływem stresu, takiego jak głodzenie komórek lub obecność patogenów (He i Klionsky, 2009). Podczas tego procesu, komórka przetwarza białka lub niefunkcjonalne organelle w wieloetapowym procesie obejmującym degradację lizosomalną, aby ostatecznie odzyskać homeostazę komórkową (Kenific i Debnath, 2015). Jako takie, deregulacja strumienia autofagii może prowadzić do nowotworów, ponieważ recykling makromolekuł, niefunkcjonalnych organelli i białek zapewnia komórkom nowotworowym wysokie wymagania metaboliczne do proliferacji komórek (Kenific i Debnath, 2015; García-Castillo i in., 2017). W tym scenariuszu autofagia stała się atrakcyjnym celem terapeutycznym, a AAs mogą być zdolne do hamowania tego procesu. Liu i wsp. (2012) donieśli, że związek AA005 (analog acetogeniny) hamował produkcję ATP, aktywował AMPK i blokował szlak mTOR Complex 1, aby w końcu indukować autofagię w komórkach raka jelita grubego i zatrzymać cykl komórkowy w fazie G1. Związek ten jest mimetykiem AA, w którym jednostka eterowa glikolu etylenowego zastępuje dwa pierścienie THF. Taka modalność chemiczna zapewnia wyższą aktywność biologiczną, co jest przykładem plastyczności AAs, którą można uznać za inspirację do tworzenia nowych, silniejszych cząsteczek o różnych celach farmakologicznych.

Antitumor Activity of Acetogenins in Animal Models

Dane dotyczące aktywności przeciwnowotworowej AAs i ekstraktów z Annony są szczególnie obiecujące, ponieważ związki te wykazywały aktywność przeciwnowotworową w modelach zwierzęcych. Badania in vivo dostarczają kluczowych informacji na temat działania leku w całym organizmie i pozwalają ocenić nie tylko ich działanie przeciwnowotworowe, ale także toksyczność w różnych narządach. Co ważne, zwierzęta są obiektami doświadczalnymi, które umożliwiają prowadzenie obserwacji klinicznych, w tym ocenę wyników klinicznych, progresji i przeżycia wolnego od choroby oraz nawrotów choroby.

Octan etylu ekstraktu z A. squamosa, który jest bogaty w AAs 12,15-cis-squamostatin-A (4) i bullatacin (5) zmniejszał wzrost guzów wątrobowokomórkowych u myszy przy maksymalnym wskaźniku hamowania wynoszącym 69,55% w porównaniu z kontrolą pozytywną (cyklofosfamid) (Chen i in., 2012b). Zasugerowano, że konfiguracja cis w jednym ze składników może być odpowiedzialna za aktywność cytotoksyczną preparatu ziołowego. Ponadto, bullatacyna (5) wyizolowana z A. squamosa w dawce 15 μg/kg skutecznie ograniczała wzrost guza u myszy noszących ksenograft S180 i HepS odpowiednio o 65,8 i 63,4%. Wyniki te są lepsze od tych uzyskanych przy zastosowaniu wyższych stężeń taksolu (40 μg/kg). Bullatacyna (5) posiada przylegającą cząsteczkę bis-THF i trzy grupy hydroksylowe, które prawdopodobnie stanowią strukturę bioaktywną (Chen et al., 2012a).

Olej z nasion A. squamosa hamował 53,54% wzrostu guza u myszy noszących komórki H22 (Chen et al., 2016) i zmniejszał ekspresję IL-6, Jak i różnych fosforylowanych transduktorów sygnału i aktywatorów szlaku transkrypcji p-Stat3. Donoszono również, że α, β-nienasycone cząsteczki γ-laktonu obecne w AAs są akceptorami reakcji Michaela (Ji i in., 2012), które hamują aktywację Stat3, celu terapeutycznego zaangażowanego w proliferację komórek, apoptozę, zapalenie i angiogenezę (Cafferkey i Chau, 2016). Ekstrakt z A. muricata spowalniał wzrost guza w ksenograftach trzustki (Yiallouris et al., 2018), zmniejszając przerzuty poprzez obniżenie poziomu metaloproteinazy-9, oraz promując śmierć komórek nowotworowych poprzez nekrozę (Torres i in., 2012). W ksenografcie prostaty, ekstrakt z A. muricata wzbogacony o flawonoidy poprawił biodostępność i wykazał niższą toksyczność niż ekstrakt wzbogacony o AAs (Yang et al., 2015).

Laherradurin (6) i cherimolin-2 (7) zostały wyizolowane z rośliny leczniczej A. diversifolia i przetestowane in vivo przeciwko komórkom raka szyjki macicy i raka jelita grubego (Schlie-Guzmán et al., 2009). Oba AA redukowały rozmiar guzów HeLa z podobnymi wartościami jak doksorubicyna; oba związki wykazywały również aktywność antyproliferacyjną in vitro wobec tej samej linii komórek nowotworowych. Wyniki te są zgodne z innymi doniesieniami, gdzie najbardziej aktywną cząsteczką okazała się laherraduryna (6), która posiada przylegające do siebie cząsteczki bis-THF i strukturę β-hydroksy γ-metylowego γ-laktonu, podczas gdy cherimolina-2 (7), która zawiera nieprzylegające do siebie cząsteczki bis-THF i jednostkę γ-laktonową wykazuje zmniejszoną aktywność przeciwnowotworową. Tabela 2 przedstawia aktywność przeciwnowotworową różnych AA w modelach zwierzęcych.

Badania toksyczności

Doświadczenia z udziałem zwierząt powinny obejmować protokoły ostrej toksyczności doustnej w celu przetestowania substancji chemicznych i zaobserwowania oznak toksyczności; minimalizują one liczbę wymaganych zwierząt, zapewniają prawidłowe podawanie dawek w doświadczeniach i pozwalają uniknąć cierpienia (OECD, 2008). Jednakże, jak dotąd, istnieje niewiele informacji dotyczących toksyczności AAs lub ekstraktów z Annony. Na przykład LD50 dla ekstraktu etanolowego A. muricata u myszy wynosiło 1,67 g/kg według Sousa et al. (2010). Arthur et al. (2011) podali LD50 (<5 g/kg) wodnego ekstraktu, odnotowując, że wyższa dawka może uszkodzić nerki. Zaobserwowano również, że ekstrakt z nasion A. squamosa może powodować uszkodzenie wątroby (Miao i in., 2016b), a ekstrakt z A. muricata wzbogacony o flawonoidy wykazywał zmniejszoną toksyczność w ksenografcie prostaty (Yang i in., 2015). Cherimolin-2 wyizolowany z A. diversifolia wykazywał działanie toksyczne i śmierć w ksenograftach SW480 w dawkach powyżej 5 mg/kg/dzień (Schlie-Guzmán i in., 2009).

Jak wyjaśniono wcześniej, AAs mogą hamować kompleks 1 łańcucha oddechowego poprzez transport łańcucha elektronowego w mitochondriach. AAs przyłączają się i blokują enzym NADH, który jest zwykle nadekspresyjny w komórkach nowotworowych, hamując produkcję ATP, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki. Przypuszczalnie taki mechanizm sugeruje, że AA są „nieszkodliwe” dla normalnych komórek; nadal należy przeprowadzić więcej badań, aby zapewnić selektywność tych cząsteczek.

Wniosek

Chemoterapia nie jest specyficzna dla komórek nowotworowych; powoduje kilka niepożądanych skutków ubocznych, takich jak uszkodzenie normalnych tkanek i narządów. Jednak najważniejszym aspektem konwencjonalnej chemioterapii jest to, że w znacznej liczbie przypadków komórki nowotworowe rozwijają mechanizmy oporności, które umożliwiają progresję guza i powstawanie przerzutów.

Poszukiwanie nowych leków w przyrodzie nie jest niczym nowym. Kilka pochodnych substancji naturalnych jest obecnie stosowanych w leczeniu różnych chorób. Na przykład taksol (paklitaksel), który został odkryty dzięki tradycyjnej wiedzy, jest uważany za najbardziej dochodowy lek przeciwnowotworowy na rynku. Co ciekawe, paklitaksel jest lekiem antymitotycznym, hamującym proliferację komórek w hodowlach komórkowych, ale w nowotworach udokumentowano, że indukuje podziały wielobiegunowe, co pokazuje, że cząsteczka może mieć różne mechanizmy działania w zależności od warunków in vitro lub warunków pacjenta. Alkaloid ten ma 30-letnią historię i ilustruje główne przeszkody w pracy z produktami naturalnymi, ich ograniczoną dostępność biologiczną i koszty produkcji, a także niesamowitą skuteczność w zabijaniu komórek nowotworowych.

Acetogeniny są wszechstronnymi cząsteczkami przeciwnowotworowymi powodującymi śmierć komórek nowotworowych poprzez różne mechanizmy. Mogą modulować wykluczanie leków chemioterapeutycznych z komórek nowotworowych i są silnymi induktorami apoptozy. Ich bioaktywna elastyczność przejawia się w zdolności do regulowania cyklu komórkowego poprzez zatrzymywanie komórek w fazie G1, promowanie apoptozy poprzez hamowanie różnych białek, a nawet indukowanie autofagii. Ponadto, wyróżnia się ich interakcje metaboliczne, szczególnie związane z czynnikami transkrypcyjnymi HIF1 i STAT3 oraz ich reperkusje w zużyciu energii, angiogenezie, zapaleniu i metastazie. Aktywność przeciwnowotworowa AAs in vivo jest obiecująca (przykładem są bullatacyna, laherraduryna i cherimolina-2). Jednakże, dane przedkliniczne nie są wystarczające do uzyskania dobrego zrozumienia farmakodynamiki i kinetyki AAs, a więcej badań ostrej toksyczności i rozpuszczalności jest potrzebnych do zapewnienia bezpieczeństwa i możliwości przeprowadzenia prób klinicznych z udziałem ludzi. Dodatkowo, włączenie różnych ligandów (tj. przeciwciał, witamin i peptydów) lub przygotowanie pochodnych specyficznych dla nowotworów może poprawić aktywność AA i dać bardziej odpowiednie leki.

Wyciągi roślinne są chemicznie złożone, a ich właściwości lecznicze często zależą od interakcji między związkami i ich proporcji w ekstrakcie. Wciąż pozostaje wiele do odkrycia w zakresie wpływu AAs na nowotwory. Dziedzina ta daje szansę na znalezienie nowych cząsteczek do leczenia tej złożonej choroby. Standaryzacja ekstraktów jest zatem możliwą alternatywą dla stosowania suplementów ziołowych, szczególnie w przypadku roślin, których aktywność farmakologiczna opiera się na kombinacji więcej niż jednego związku. Ten mini-przegląd wymienia niektóre wcześniej badane AA, które wykazują aktywność przeciwnowotworową i mogą mieć przyszłość w klinicznych badaniach nad rakiem.

Wkład Autorów

NJ-H przyczynił się do stworzenia koncepcji, napisania i omówienia artykułu; CP-P wniósł znaczący wkład w dyskusję i korektę manuskryptu; VC-T przygotował wszystkie ryciny i tabele; MM-V i AG-E wnieśli wkład w sekcję chemiczną artykułu; AZ-D wniósł znaczący wkład w dyskusję na temat biologii molekularnej artykułu. Wszyscy autorzy omówili, poprawili i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu do publikacji.

Funding

Ta praca była wspierana przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Meksyk (numer grantu 285884). VC-T był finansowany przez CONACYT (numer grantu doktoranckiego 267787).

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy oświadczają, że badania były prowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

NJ-H dziękuje CONACYT za finansowanie projektu.

.