1.1 Możliwe fizjologiczne źródła nukleotydów i nukleozydów
ATP i inne opisane nukleotydy traktują zarówno receptory metabotropowe (P2Y), jak i jonotropowe (P2X). Podjednostki receptorów P2X (P2X1-P2X7) tworzą kanały kationowe bramkowane ligandami, jako homomultimery lub heteromultimery. Podjednostki P2X3 uczestniczą w szlaku przepuszczalności jonów poprzez łączenie pól każdej z podjednostek. P2X3R ma najniższą zarejestrowaną względną przepuszczalność Ca2+ z całej rodziny. P2X7, oprócz kanałów kationowych, jest kojarzony z dużymi porami cytolitycznymi, które występują w makrofagach i komórkach mikrogleju mózgowego. Receptory P2Y mogą aktywować lub hamować cyklazę adenylanową w zależności od podtypu, a w konsekwencji od rodzaju sprzężonego z nimi białka G. Cyklaza adenylanowa, a w szczególności pojawia się hamowanie kanałów Ca2+. Receptory P2Y stanowią podgrupę receptorów sprzężonych z białkiem G; większość z nich sprzęga się z fosfolipazą C za pośrednictwem białka G, ale występuje również hamowanie cyklazy adenylanowej i kanałów Ca2+ typu N oraz aktywacja kanałów K+. Receptory P2Y są ogólnie rozróżniane farmakologicznie na podstawie kolejności agonistów; niektóre preferują pirymidynę w stosunku do puryny. Kilka receptorów P2Y ma bardzo powszechną dystrybucję tkankową. Struktury molekularne ATP i BzATP przedstawiono na rycinie 1.
Rysunek 1.
Struktury molekularne ATP i BzATP .
Nukleotydy adeninowe hamują indukowane izoproterenolem i forskoliną gromadzenie cyklicznego AMP w komórkach glejaka szczura C6-2B. Hamowanie to występuje w obecności inhibitora fosfodiesterazy. Nukleotydy adeninowe nie powodowały efektów w pomiarach bezpośredniej aktywności fosfodiesterazy w nienaruszonych komórkach. Wstępne potraktowanie komórek glejaka C6-2B toksyną krztuścową blokowało hamujące działanie agonistów receptorów P2Y-purynergicznych. Szereg analogów ATP i ADP spowodowało uszeregowanie siły działania (5′-trójfosforan 2-metylotioadenozyny> lub = 5′-difosforan 2-metylotioadenozyny > adenozyna 5′-O-(2-trójfosforan) > 2-chloro-adenozyna ADP = adenozyna 5′-O-(3-trójfosforan) > ATP > UTP) spodziewane po aktywacji receptora P2Y-purinergicznego; a agoniści receptora P2X-purynergicznego, alfa, beta-metylenadenozyno-5′-trifosforan i beta, gamma-metylenadenozyno-5′-trifosforan nie wywierały żadnego wpływu. Aktywność fosfolipazy C występuje w odpowiedzi na aktywację receptora P2-purinergicznego w wielu tkankach docelowych, dlatego w komórkach C6-2B mierzono wpływ agonistów receptora P2Y na akumulację fosforanu inozytolu. Nie znaleziono dowodów na regulację metabolizmu lipidów inozytolu przez receptor P2Y-purynergiczny w warunkach, w których aktywacja muskarynowego receptora cholinergicznego lub AIF4 zwiększała akumulację fosforanu inozytolu. Wyniki te wskazują, że na komórkach glejaka szczurzego C6-2B obecny jest podtyp receptora P2-purynergicznego o odmiennej charakterystyce sygnalizacyjnej. Chociaż receptor ten wyraża ogólne właściwości farmakologiczne receptora P2Y-purynergicznego związanego z fosfolipazą C, może reprezentować unikalny podtyp receptora, ponieważ hamuje cyklazę adenylową .
Puryny były uważane za ograniczone do przedziału wewnątrzkomórkowego, w którym były wykorzystywane do przetwarzania energii, syntezy kwasów nukleinowych i dużej liczby reakcji biochemicznych. Karl Lohmann wyizolował ATP, który jest kluczowym wewnątrzkomórkowym walutą energetyczną, w 1929 roku. Jednakże adenozyna i trifosforan adenozyny (i) są obfitymi biochemicznymi składnikami mikrośrodowiska guza, (ii) są silnymi modulatorami odpowiedzi komórek odpornościowych i uwalniania cytokin, oraz (iii) są kluczowymi graczami w interakcji gospodarz-nowotwór. Ponadto, oba nukleotydy bezpośrednio wpływają na wzrost komórek nowotworowych. Adenozyna jest silnym immunosupresantem (działającym głównie na receptory A2A) i modulatorem wzrostu komórek (działającym głównie na receptory A3). ATP jest czynnikiem prozapalnym (działa w receptorach P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6 i P2Y12 oraz w receptorach P2X4 i P2X7), immunosupresyjnym (działa w P2Y11) i stymulatorem wzrostu (działa w P2Y1, P2Y2 i P2X7). Ta złożona sieć sygnalizacyjna wywołuje szereg hamujących i stymulujących odpowiedzi, które wpływają na funkcję komórek odpornościowych, wzrost guza i rozprzestrzenianie się przerzutów.
Receptory purynergiczne, reprezentowane przez wiele rodzin, są najliczniej występującymi receptorami w organizmach żywych, prawdopodobnie występującymi we wczesnych etapach ewolucji. Sygnalizacja purynergiczna w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym jest szybko rozwijającą się dziedziną. Badanie tych receptorów umożliwia opracowanie strategii terapeutycznych dla tych zaburzeń z nowymi mechanizmami działania, w tym ropnych, patogennych warunków, w tym bólu, urazu, niedokrwienia, padaczki, migreny, zaburzeń psychicznych i uzależnienia od narkotyków .
W mikromolarnych/nanomolarnych stężeniach, pozakomórkowy adenozynotrójfosforan (ATP) wykazano, aby wytworzyć znaczące zmiany funkcjonalne w szerokiej gamie normalnych i przekształconych typów komórek. Chociaż ATP może być specjalnie uwalniany z cytozolu uszkodzonych komórek, jest on również pakowany w niektórych egzocytotycznych pęcherzykach/granulach zawierających konwencjonalne neuroprzekaźniki i hormony. Różne biologiczne odpowiedzi na ATP s± mediowane przez różne P2-purinergiczne receptory na powierzchni komórek, aktywowane po przywi±zaniu ATP i innych nukleotydów. Najnowsze badania fizjologiczne, biochemiczne i farmakologiczne wykazały, że istnieje wiele typów podtypów receptorów ATP. Należą do nich: (1) receptory ATP związane z białkiem G, które indukują hydrolizę fosfolipidów inozytolu, mobilizację Ca2 + i aktywację kinazy białkowej C; (2) receptory ATP, które bezpośrednio aktywują nieselektywne kanały kationowe w błonach plazmatycznych różnych typów komórek oraz (3) receptory ATP zdolne do wywoływania odpowiedzi cytotoksycznych lub aktywacyjnych w limfocytach T i innych komórkach efektorowych układu odpornościowego poprzez szybką indukcję powierzchniowych porów błonowych przepuszczalnych dla jonów i endogennych metabolitów (o masach cząsteczkowych do 900 Da). Oprócz tych kryteriów funkcjonalnych, te domyślne podtypy receptorów ATP mogą być farmakologicznie rozróżniane przez charakterystyczną siłę działania dla różnych strukturalnie zmodyfikowanych analogów ATP .
Wewnątrzkomórkowe nukleotydy odgrywają podstawową i wszechobecną rolę w metabolizmie energii, syntezie kwasów nukleinowych i regulacji enzymów. Powszechnie wiadomo, że zewnątrzkomórkowe nukleotydy i nukleozydy prowadzą ważne działania biologiczne w wielu tkankach i komórkach. Sensory metaboliczne GLUTs (ułatwiają transport glukozy do komórek), SGLTs (ułatwiają reabsorpcję glukozy z powrotem do krążenia) i KATP (kanały potasowe wrażliwe na ATP) odgrywają ważną rolę w homeostazie i metabolizmie glukozy w organizmie i w wielu specyficznych narządach (np, jelito, trzustka, serce, mięśnie szkieletowe i mózg) .
KATP wiążą sygnały metaboliczne z pobudliwością komórek i odgrywają ważną rolę w wielu tkankach, w tym regulację wydzielania insuliny, kontrolę napięcia naczyń krwionośnych i ochronę neuronów i mięśni przed niedokrwieniem. Kanały KATP to oktameryczne kompleksy składające się z czterech receptorów sulfonylomocznikowych (SUR.x) i czterech prostowniczych kanałów potasowych (Kir6.x). Są one regulowane przez wewnątrzkomórkowe ATP i ADP. Podczas gdy ATP hamuje aktywność kanału, ADP antagonizuje hamujący efekt ATP w obecności Mg2+ i stymuluje aktywność kanału. Te właściwości bramki są niezbędne, aby kanał ten mógł wykrywać zmiany metaboliczne w komórkach. I tak, w komórkach β trzustki stosunek / wzrasta w odpowiedzi na wzrost stężenia glukozy we krwi, co prowadzi do zamknięcia kanału KATP, depolaryzacji błony, aktywacji kanałów Ca2+ zależnych od napięcia i uwalniania insuliny. Jednakże, gdy poziom glukozy we krwi jest niski, stosunek / zmniejsza się, kanały KATP są otwarte i wydzielanie insuliny spada .
Kanały katastroficzne w trzustce są aktywowane w następujący sposób; w przypadku, gdy poziom glukozy w komórce β jest zwiększony, wewnątrzkomórkowy stosunek ATP do ADP również wzrasta, co prowadzi do zamknięcia kanału KATP, depolaryzacji komórek i uwalniania insuliny .
Uważa się, że P-wrażliwy strumień K′(K + ) jest regulowany przez białka wiążące GTP (białka G), ale szlaki łączące receptor, białko G i kanał nie są zidentyfikowane. Regulacja wrażliwego na tolbutamid prądu K′ w miocytach komór szczura noworodka jest określona. Aktywowane ATP-wrażliwe kanały K + (K + ) są obecne w komórkach, gdy spada wewnątrzkomórkowy poziom ATP. Wewnątrzkomórkowe ATP występują, gdy wewnątrzkomórkowe poziomy ATP są zmniejszone w komórce, wewnątrzkomórkowym mięśniu szkieletowym, mózgu i trzustce. Niewiele wiadomo o funkcji kanałów K + w komórkach serca, chociaż ich ważna rola w kontrolowaniu wydzielania insuliny z komórek P trzustki została dobrze ustalona. Po farmakologicznej aktywacji, kanały te znacznie skracają czas trwania potencjału czynnościowego i zostały zaproponowane jako odpowiedzialne za skrócenie potencjału czynnościowego w metabolicznie niebezpiecznych niedokrwionych mięśniach. Jednakże stężenie ATP w zablokowanej metabolicznie kastcie pozostaje powyżej poziomu, który uniemożliwia działanie kanałów w wyciętych płatach błonowych. Możliwym wyjaśnieniem tej rozbieżności jest to, że wrażliwość kanałów na ATP może być modulowana przez mechanizmy wewnątrzkomórkowe .
ATP-responsywne kanały K+, zwane kanałami KATP, zapewniają połączenie między metabolizmem komórkowym a błonową aktywnością elektryczną w różnych tkankach. Izoformy kanałów są celem dla związków, które stymulują i hamują ich aktywność, powodując odpowiednio hiperpolaryzację i depolaryzację błony. Rozluźnienie mięśni gładkich naczyń krwionośnych i stymulowanie wydzielania insuliny są przykładami dla tych sytuacji powyżej. Agoniści adenozyny i otwieracze ATP-wrażliwego kanału potasowego (KATP) zostały zgłoszone do ograniczenia wielkości zawału (IS) . ATP-wrażliwe kanały potasowe (KATP) są dobrze zdefiniowane w sercu, szkielecie i mięśniach gładkich, komórkach trzustki, przysadce mózgowej, centralnym i obwodowym układzie nerwowym zarówno elektrofizjologicznie, jak i farmakologicznie. Ich aktywność, a tym samym różne funkcje komórkowe są kontrolowane przez metabolizm komórkowy. Ogólnie rzecz biorąc, uważa się, że zmiany w ATP (powodujące zamknięcie kanału) i w MgADP (aktywujące kanał) mają podwójny metabolizm na aktywność kanału 6. Opisano, że komórkowa lokalizacja dwóch transkryptów mRNA, które mają generować ATP-wrażliwe kanały K+ w mózgu myszy. Istnieją dowody na to, że kanał KATP w komórkach trzustki składa się z podjednostki Kir6.2 i kompleksu podjednostek SUR1. Kanały KATP o podobnej charakterystyce (typ I) zostały opisane w różnych neuronach, w tym w neuronach kory mózgowej, nigra podstawna, caudate i hipokampa .
Prawie wszystkie komórki nowotworowe i wszystkie komórki odpornościowe wyrażają receptory błony plazmatycznej dla zewnątrzkomórkowych nukleozydów (adenozyny) i nukleotydów (ATP, ADP, UTP, UDP i cukru UDP). Mikrośrodowisko nowotworu charakteryzuje się niezwykle wysokim stężeniem ATP i adenozyny. Adenozyna jest ważnym czynnikiem determinującym immunosupresyjne środowisko guza. Seryjna hydroliza pozakomórkowego ATP katalizowana przez CD39 i CD73 jest głównym szlakiem powstawania adenozyny w śródmiąższu guza. Zewnątrzkomórkowy ATP i forma adenozyny są odpowiedzią zarówno gospodarza, jak i guza. W zależności od aktywowanego specyficznego receptora, zewnątrzkomórkowe puryny pośredniczą w immunosupresji lub immunostymulacji po stronie gospodarza oraz w stymulacji wzrostu lub cytotoksyczności po stronie guza. Najnowsze osiągnięcia w tej dziedzinie stanowią klucz do rozszyfrowania tego złożonego scenariusza i wykorzystania potencjalnych korzyści z terapii. Dane przedkliniczne wskazują, że ukierunkowanie na szlak produkcji adenozyny lub receptory adenozynoergiczne osłabia immunosupresję i silnie hamuje wzrost guza. Z drugiej strony, wzrost guzów eksperymentalnych jest silnie hamowany przez ukierunkowanie na receptor P2X7 ATP selektywnych komórek nowotworowych i immunologicznych. Rola zewnątrzkomórkowych puryn (sygnalizacja purynergiczna) działa w interakcji gospodarz-nowotwór i podkreśla nowe możliwości leczenia z ostatnich postępów. Obecnie panuje zgoda co do tego, że ATP i adenina są głównymi składnikami mikrośrodowiska guza (TME), w którym TME w różny sposób wpływa na wzrost guza, funkcje komórek odpornościowych i interakcję guz-gospodarz. Wobec powszechnej obserwacji, że wiele nowotworów złośliwych nadekspresjonuje kilka podtypów P1R lub P2R, proste podejście wymagałoby skierowania na te receptory selektywnych receptorów w celu zahamowania wzrostu receptorów nowotworowych. Na tej samej linii ingerencji postrzegane są enzymy zaangażowane w metabolizm zewnątrzkomórkowych nukleotydów i nukleozydów (CD39, CD73 i deaminaza adenozyny). Chociaż skuteczność kilku prostych modeli przedklinicznych została udowodniona, to to proste podejście jest wyraźnie bardzo czyste. P1Rs, P2Rs i enzymy zaburzające ATP/adenozynę ulegają ekspresji wraz z komórkami immunostymulacyjnymi i zrębowymi gospodarza, które pełnią bardzo ważne funkcje w tworzeniu zintegrowanego kompleksu gospodarza wokół guza. Staranny dobór kandydata na receptor purynergiczny w połączeniu z modulatorami zewnątrzkomórkowych szlaków adenozynoergicznych może pozwolić na zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych i jednoczesne zwiększenie odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza. Ten środek przeciwnowotworowy zapewni dodatkową potężną broń w leczeniu kombinowanym .
Nukleotydy i ich receptory wyłaniają się jako potencjalni aktorzy w interakcji gospodarz-nowotwór, tacy jak nowe i ważne modulatory zapalne i immunologiczne. Duża liczba receptorów P2 i P1 wyrażanych przez komórki nowotworowe i zapalne wykazujące różne powinowactwa do ligandów dla podtypów receptorów P2 i P1 są modulowane przez lokalne czynniki uzyskane z ektonukleotydów i ADA na stężenie nukleotydów i adenozyny. Dane in vivo potwierdzają dowody in vitro, że zmniejszenie stężenia adenozyny wewnątrz guza i ukierunkowanie na receptor P2X7 ma silny efekt przeciwnowotworowy. Dlatego też badanie sygnalizacji purynergicznej w nowotworach otwiera obiecujące perspektywy rozwoju innowacyjnych terapii .
Sygnalizacja purynergiczna koncentrowała się na odpowiedzi immunologicznej związanej z nowotworem; nukleotydy i nukleozydy mają silne bezpośrednie działanie na same komórki nowotworowe. Stymulacja receptorów P2Y (P2Y1 i P2Y2) promuje wzrost, dlatego też, w zależności od ekspresji podtypów receptorów P2Y, akumulacja ATP w mikrośrodowisku guza może promować jego wzrost. Oprócz receptorów P2Y, rolę we wzroście guza odgrywa P2X7. Od dawna wiadomo, że większość nowotworów złośliwych wykazuje nadekspresję receptora P2X7. Wiadomo, że receptor ten pośredniczy w silnej odpowiedzi cytotoksycznej. Nie wiadomo zatem, dlaczego guz miałby nadmiernie eksprymować „samobójczy” receptor. Jednak cytotoksyczność jest najczęściej wyzwalana przez farmakologiczne (tj. bliskie milimolarnym) dawki ATP. Z kolei aktywacja P2X7 przez endogennie uwalniany ATP wywołuje efekt troficzny, promujący wzrost .
Nukleotydy i nukleozydy w płynie powierzchniowym dróg oddechowych regulują czynności klirensu mukocytarnego (MCC), podstawowego naturalnego mechanizmu obronnego, który usuwa obce cząstki i patogeny z powierzchni dróg oddechowych. W tych działaniach w drogach oddechowych pośredniczą głównie dwa podtypy receptorów purynergicznych, sprzężony z Gq receptor P2Y2 reagujący na ATP/UTP oraz sprzężony z Gs receptor adenozyny A2b. Aktywacja receptora A2b powoduje zależną od cyklicznego AMP aktywację kanału Cın1 transmembranowego regulatora mukowiscydozy (CFTR) i stymulację częstotliwości pulsu rzęskowego. Agonistyczna aktywacja receptora P2Y2 promuje hamowanie CFTR-zależnego i CFTR-niezależnego wydzielania Cl, bicia rzęsek i wydzielania mucyny oraz absorpcji Na+ .
Zjawisko dotyczące procesu ujawnia udział kaskady biologicznej. W tym kontekście, agoniści adenozyny i otwieracze ATP-wrażliwego kanału K+ (KATP) naśladują niektóre efekty ochronne procesu kondycjonowania wstępnego. Co więcej, efekty te są odwracane przez antagonistów adenozyny i blokerów KATP; sugeruje to, że uwalnianie adenozyny i aktywacja kanałów KATP przez receptory adenozyny Al może stanowić wczesny krok w niedokrwiennym mózgowym prekondycjonowaniu .
Aktywacja receptora adenozyny, kinazy białkowej C (PKC) i ATP-wrażliwego kanału potasowego (KATP) jest znana z wywoływania prekondycjonowania. Dane te dostarczają bezpośrednich dowodów na to, że kanał KATP, a nie receptor adenozyny, jest efektorem downstream PKC w inicjowaniu prekondycjonowania indukowanego przez PKC. Zarówno receptor adenozyny, jak i kanał KATP są wymagane do promowania rzeczywistego efektu ochronnego podczas ciągłej hipoksji. Ocenia się możliwość dołączenia do biologicznego etapu zdarzenia ochronnego udziału receptorów adenozyny A1 i kanałów KATP, związanego z tolerancją krzyżową między tolerancją padaczkową indukowaną KA lub padaczką indukowaną KA i globalnym niedokrwieniem .