Genetyczne polimorfizmy cytochromu P450 2D6 (CYP2D6): konsekwencje kliniczne, aspekty ewolucyjne i różnorodność funkcjonalna

Farmakogenetyka zajmująca się dziedzicznymi różnicami w celach farmakologicznych oraz dyspozycją leków w postaci receptorów i transporterów leków rozwija się w szybkim tempie.1, 2, 3, 4, 5 Obecnie nasza wiedza jest najbardziej zaawansowana w odniesieniu do wpływu polimorficznie rozmieszczonych genów kodujących enzymy metabolizujące leki, chociaż wiedza na temat receptorów i transporterów leków szybko się powiększa. Największe znaczenie dla międzyosobniczych różnic w odpowiedzi na leki mają obecnie różnice w zdolności metabolizowania leków spowodowane polimorfizmem genetycznym lub zahamowaniem bądź indukcją metabolizmu leków. Poza interakcjami lek-lek, czynnikami patofizjologicznymi i środowiskowymi, genetyka enzymów metabolizujących leki odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu międzyosobniczych różnic w odpowiedzi na leki i niepożądanych działań leków. Największy wpływ wśród enzymów metabolizujących leki wywierają cytochromy P450, główne enzymy fazy I.6, 7 Wśród nich CYP2C9, CYP2C19 i CYP2D6 są wysoce polimorficzne i odpowiadają łącznie za około 40% wątrobowego metabolizmu fazy I u ludzi. Ponadto polimorfizmy CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 i CYP2C8 również przyczyniają się do różnic międzyosobniczych w metabolizmie leków. CYP2D6 jest prawdopodobnie najszerzej badanym polimorficznie enzymem metabolizującym leki u ludzi; jego polimorfizm ma duże znaczenie kliniczne i był pierwszym spośród polimorficznych P450, który został scharakteryzowany na poziomie molekularnym. Obecnie zidentyfikowano ponad 48 różnych substratów lekowych dla tego enzymu (Tabela 1), a CYP2D6 jest odpowiedzialny za około 25% metabolizmu znanych leków. Może to być jednak nieco zawyżona wartość, ponieważ w przeszłości poszukiwano przede wszystkim leków metabolizowanych przez ten enzym, ze względu na jego polimorficzną ekspresję. W niniejszym przeglądzie opisano aktualną wiedzę i konsekwencje genetyki molekularnej CYP2D6, jak również wiedzę na temat wpływu na leczenie farmakologiczne.

Ogólna charakterystyka CYP2D6

CYP2D6 jest polipeptydem o długości 497 aminokwasów. Enzym ten stanowi jedynie niewielki procent wszystkich wątrobowych P450, ale jego rola w metabolizmie leków jest znacznie większa niż jego względna zawartość (patrz Zanger i wsp.8). Różne modele enzymu oparte na trójwymiarowej strukturze cytochromu P450 BM-3 lub CYP2C5 oraz wyniki mutagenezy site directed znacznie różnią się od siebie. Pomimo sukcesu, jakim było uzyskanie dobrze dyfrakcyjnych kryształów CYP2B4, CYP2C5, CYP2C9 i CYP3A4 ssaków, nie udało się dotychczas uzyskać dobrych kryształów CYP2D6. Uważa się, że takie kryształy są niezbędne do uzyskania wzorca dla modeli o wystarczającej rozdzielczości i dokładności, aby np. przewidzieć leki, które będą substratami dla tego enzymu. Taki model miałby ogromne znaczenie dla przemysłu farmaceutycznego, ponieważ projekt leku, w którym unika się związków będących substratami o wysokim powinowactwie do CYP2D6, jest kluczowy dla udanego produktu na rynku.

Substraty CYP2D6 to lipofilowe zasady z protonowalnym atomem azotu. Reakcja hydroksylacji zachodzi w odległości 5 lub 7 Å od atomu azotu. Eksperymenty mutagenezy ukierunkowanej na miejsce reakcji wskazują, że Asp301 jest ujemnie naładowanym aminokwasem odpowiedzialnym za wiązanie się z azotem substratu.8 Ponadto, również Ser304, Thr309 i Val370 wydają się być zaangażowane w wiązanie substratu9 , chociaż do potwierdzenia wymagane są dalsze modele.

CYP2D6 ma bardzo wysokie powinowactwo do alkaloidów (patrz Tabela 1).10 Ekspresja enzymu, w przeciwieństwie do innych wątrobowych cytochromów P450 metabolizujących ksenobiotyki, nie jest regulowana przez żaden znany czynnik środowiskowy i nie jest indukowana przez znane hormony. Ponieważ wśród osób pozbawionych CYP2D6 lub posiadających do 13 aktywnych kopii genu nie opisano żadnego fenotypu, można wnioskować, że enzym ten nie pełni żadnej istotnej funkcji endogennej. Sugeruje się rolę w metabolizmie niektórych neuroprzekaźników. Rzeczywiście, ostatnio przedstawiono dowody na to, że CYP2D6 jest specyficzną O-demetylazą 5-metoksyindoliny,11 a także wykazano, że substratem jest 5-metoksytryptamina12. Oprócz takich substratów, prawdopodobnie enzym ten odgrywa ważną rolę w metabolizmie składników żywności, w szczególności alkaloidów (patrz poniżej).

Działanie CYP2D6 na substraty o potencjalnej aktywności w mózgu implikowałoby funkcjonalny fenotyp u osób, czyli słabych metabolizerów (PMs) pozbawionych enzymu. W rzeczywistości w dwóch badaniach wykazano istotny związek między zachowaniem przy użyciu testów psychologicznych a obecnością CYP2D6.13, 14 Powstaje pytanie, czy taka aktywność jest niezbędna. Co ciekawe, Pai i wsp.15 dostarczyli ostatnio dowodów, że wspólny wariant pseudogenu CYP2D7P może ulegać ekspresji w aktywnej formie w ludzkim mózgu, dając funkcjonalny produkt enzymatyczny, aktywny w metabolizmie, na przykład, kodeiny. Czy jest to produkt o prawdziwym znaczeniu funkcjonalnym, pozostaje do wyjaśnienia, chociaż samo odkrycie jest interesujące.

Polimorfizm CYP2D6 – aspekty historyczne

Polimorfizm CYP2D6 został niezależnie odkryty w trzech różnych laboratoriach. Laboratorium Folke Sjöqvista wykazało, że metabolizm nortryptyliny i desimipraminy, które później okazały się substratami CYP2D6, wykazywał ogromną międzyosobniczą zmienność poziomów w osoczu przy tej samej dawce i zidentyfikowano dwa fenotypy.16 Kolejne badania przeprowadzone przez grupę Sjöqvista z wykorzystaniem bliźniąt wykazały, że różnica ta miała charakter genetyczny. Bob Smith i współpracownicy z Londynu badali metabolizm dwóch leków przeciwnadciśnieniowych betanidyny i debryzochiny, które były stosowane w leczeniu nadciśnienia tętniczego. Kiedy Bob Smith w maju 1975 r. zażył 40 mg debryzochiny, zakręciło mu się w głowie, zemdlał i doznał silnego niedociśnienia. W kolejnym badaniu z użyciem 10 mg debrisochiny u 94 osób zidentyfikowano dwa fenotypy.17 Michel Eichelbaum w Bonn badał antyarytmiczne działanie sparteiny i dwóch badanych skarżyło się na nieprzyjemne efekty uboczne, takie jak niewyraźne widzenie, diploida, zawroty i ból głowy. Analiza poziomów osocza ujawniła, że mieli oni 4-5 razy wyższe poziomy niż pozostali, a dwa fenotypy zostały opublikowane w 1978 i 1979 roku.18, 19

Podstawa genetyczna polimorfizmu debryzochiny została wyjaśniona 10-15 lat później. W badaniach prowadzonych wspólnie przez laboratoria Ursa Meyersa i Franka Gonzaleza poliklonalne szczurze przeciwciała CYP2D opracowane w Bazylei wykorzystano jako narzędzia do sklonowania ludzkiego CYP2D6 cDNA z biblioteki cDNA ludzkiej wątroby λgt 11, a wyrażone cDNA wykazywało oczekiwaną aktywność hydroksylazy bufuralolu.20 Wykorzystując RFLP, laboratorium Meyersa mogło potwierdzić zmienione wzory RFLP w PMs dla debryzochiny,21 podczas gdy pełna identyfikacja alleli CYP2D6*3 i CYP2D6*4 została opublikowana w 1990 roku.22

Pod koniec lat 80. zidentyfikowaliśmy w owocnej współpracy z Leifem Bertilssonem i Folke Sjöqvistem wzór RFLP u Chińczyków aktywny w metabolizmie CYP2D6, wskazujący na PM u osób rasy kaukaskiej23, a następnie scharakteryzowaliśmy najczęstszy częściowo wadliwy allel CYP2D6 u osób rasy orientalnej, CYP2D6*10.24 Jako francuska grupa sprzeciwiła się naszej identyfikacji wielkości chińskich fragmentów XbaI i ponownie przesiewaliśmy kilka różnych próbek DNA przez XbaI RFLP przy użyciu niższej gęstości żelu agarozowego i znaleźliśmy kilka próbek, które, jak sądziliśmy, miały nie oczyszczone DNA (patrz Ingelman-Sundberg25 dla dalszych szczegółów). Jednak badanie ich pochodzenia ujawniło, że pochodziły one od osób bardzo szybkich dla metabolizmu debryzochiny i zidentyfikowano osoby z maksymalnie 12 dodatkowymi kopiami genu CYP2D6. Okazało się, że jest to pierwszy opis stabilnie amplifikowanego aktywnego genu u ludzi26 i zdefiniowano termin ultrarapid metabolisers (UMs).27 Późniejsze badania częstotliwości w różnych populacjach wykazały 30% u Etiopczyków,28 10% u Hiszpanów i 10% populacji we Włoszech i Turcji, podczas gdy UMs są rzadkie (1-2%) w Europie Północnej i zasadniczo nieobecne w Azji (patrz6 dla referencji). U Etiopczyków nie stwierdzono osobników homozygotycznych dla wadliwych genów CYP2D6, ale allele zawierające 2, 3, 4, a także 5 kopii genu CYP2D6.28 Podobną sytuację zaobserwowano również wśród Arabów Saudyjskich.29 Ocena liczby osób będących nosicielami duplikacji genów CYP2D6 w Europie Zachodniej wskazuje, że 5,5% Europejczyków jest nosicielami więcej niż dwóch aktywnych kopii genów CYP2D6 i są to UMs (Tabela 2).

Polimorfizm genetyczny CYP2D6

Gen CYP2D6 zlokalizowany jest na chromosomie 22q13.1. Locus zawiera dwa sąsiadujące pseudogeny, CYP2D7 i CYP2D8.30 Ewolucja ludzkiego locus CYP2D obejmowała eliminację trzech genów i inaktywację dwóch (CYP2D7P i CYP2D8P) oraz częściową inaktywację jednego (CYP2D6). Obecnie znanych jest ponad 46 różnych głównych polimorficznych alleli CYP2D6. Obecność bardzo podobnych, blisko położonych pseudogenów niosących szkodliwe mutacje, poprzez np. nierównomierne reakcje krzyżowania, doprowadziła do powstania wielu wariantów alleli CYP2D6, które najczęściej kodują wadliwe produkty genu. Aktywność” locus CYP2D jest wysoka w porównaniu np. z locus CYP2C, w związku z czym w stosunkowo krótkim czasie powstało wiele alleli wariantowych. Najczęstsze allele wariantowe rozpowszechnione w różnych grupach etnicznych wymieniono w tabeli 3, a wszystkie allele wariantowe przedstawiono na stronie domowej komitetu ds. nazewnictwa alleli ludzkiego CYP (http://www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm). Warianty alleli CYP2D6 można podzielić na kategorie, które powodują zniesioną, zmniejszoną, prawidłową, zwiększoną lub jakościowo zmienioną aktywność kateksylacyjną. Do najważniejszych wariantów należą CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 i CYP2D6*41.

Najczęstszym allelem u Azjatów (częstość alleli >50%) i tym samym prawdopodobnie najczęstszym allelem CYP2D6 na świecie jest CYP2D6*10.24 Enzym CYP2D6.10 ma szkodliwą mutację P34S znoszącą ważną sekwencję PPGP niezbędną do składania P450 i dlatego jest bardzo niestabilny,24 ale ma również zmniejszone powinowactwo do substratów.31 Wśród czarnych CYP2D6*17, opisany po raz pierwszy w 1996 roku32 , jest głównym wariantem allelu CYP2D6. Koduje on, oprócz dwóch mutacji typu missense występujących w CYP2D6*2, także mutację T107I, która najwyraźniej powoduje zmianę struktury miejsca aktywnego. Powoduje to zmienioną specyficzność substratową,33 która jest widoczna in vitro33 , ale także gdy osoby o genotypie CYP2D6*17 są fenotypowane in vivo.34, 35 Ogólnie rzecz biorąc, aktywność enzymu CYP2D6.17 jest niższa niż enzymu typu dzikiego.

CYP2D6*41 jest wariantem CYP2D6*2 posiadającym -1584 C zamiast G. Ulega on mniejszej ekspresji niż odpowiadający mu allel CYP2D6*2 (patrz Zanger i wsp.36). Jest prawdopodobne, że -1584G>C jest w sprzężeniu z innym SNP, który powoduje wadliwe splicing mRNA, chociaż musi to być wyraźnie wykazane. Efekt in vivo CYP2D6*41 jest jednak dość wyraźny, a osoby homozygotyczne dla tego allelu są fenotypowo podobne do osobników o fenotypie pośrednim (IM) z jednym wadliwym allelem CYP2D6.36

Ewolucja loci CYP2D

Między gryzoniami a ludźmi istnieje drastyczna różnica w liczbie aktywnych genów CYP2D. Podczas gdy mysz posiada dziewięć różnych aktywnych genów Cyp2d,37 człowiek posiada tylko jeden, który w rzeczywistości jest nieobecny u 7% populacji kaukaskiej (ryc. 1). Wiadomo, że enzym CYP2D6 wykazuje bardzo wysokie powinowactwo do toksyn roślinnych, takich jak alkaloidy.10 Można przypuszczać, że mysz zachowała aktywne geny z powodu potrzeby dietetycznego potencjału detoksykacyjnego, podczas gdy bardziej ograniczona żywność przyjmowana przez ludzi w przeszłości, w tym intelektualnej zdolności do przekazywania informacji dotyczących odpowiedniej żywności między pokoleniami, spowodowała utratę presji selekcyjnej, aby utrzymać aktywne geny.

Gen CYP2D6 nie jest indukowalny w potocznym rozumieniu poprzez zwiększoną ekspresję produktu genu. U Drosophila dochodzi do selektywnej selekcji szczepów żyjących np. w rejonie kaktusa Senita wydzielającego toksyczne alkaloidy izochinolinowe i na tym terenie przeżywa tylko Drosophila mettleri, ale nie przeżywa żaden szczep Drosophila melanogaster ze względu na ich zdolność do indukowania CYP6 i CYP28.38 Ciekawa selekcja genetyczna zachodzi również u Drosophila będących odpornymi na insektycydy. Od 1930 do 1960 roku plamy odporne na insektycydy szybko ewoluowały. Co ciekawe, molekularnym podłożem genetycznym wydaje się być selekcja na insercję transpozomu (elementu akordeonowego) w regionie 5′-regulacyjnym genu Cyp6b, powodująca 40- do 100-krotne zwiększenie ekspresji produktu genu.39 Inny mechanizm nabywania oporności na insektycydy u Drosophila jest egzemplifikowany przez selekcję na trzy kluczowe mutacje w CYP6A2, czyli R335S, L336V i V476L, czyniące enzym aktywnym w kierunku metabolizmu DDT.40 Ilustrację trzech różnych mechanizmów odpowiedzi adaptacyjnej na stres substratowy przedstawia rysunek 2.

Podobnie, zaproponowaliśmy, że taka selekcja wystąpiła dla alleli niosących wiele aktywnych genów CYP2D6 w Afryce Północno-Wschodniej. Podstawą tej selekcji byłaby zdolność enzymu CYP2D6 do detoksykacji alkaloidów, co zwiększyłoby dostępność potencjalnego pożywienia wśród nosicieli wielu kopii genu CYP2D6. Byłoby to bardzo korzystne dla przetrwania w okresach głodu, gdy tylko część populacji w tym regionie osiąga dojrzałość. Badanie tempa metabolizmu debryzochiny u Etiopczyków mieszkających w Etiopii w porównaniu z Etiopczykami mieszkającymi w Szwecji wykazało, że rodowici Etiopczycy o tym samym genotypie byli wolniejsi w metabolizmie w porównaniu z Etiopczykami w Szwecji, natomiast nie stwierdzono istotnych różnic w tempie reakcji katalitycznych zależnych od CYP2C19, mierzonych za pomocą S-mefenytoiny.41 Można to interpretować w ten sposób, że składniki etiopskiej żywności, przypuszczalnie alkaloidy, hamują aktywność CYP2D6 i że takie składniki rzeczywiście mogą być czynnikiem wyzwalającym selekcję genetyczną. Proponujemy, że populacja Etiopii rozszerzyła się około 10 000-20 000 lat temu do tego stopnia, że żywność wykazywała istotne ograniczenie. Podczas okresów głodu, presja selekcyjna wystąpiła faworyzując przetrwanie podmiotów zdolnych do detoksykacji toksyn roślinnych w większym stopniu, zwiększając liczbę roślin, które są w stanie zapewnić użyteczne jedzenie (rysunek 3). Spowodowało to ekspansję subpopulacji niosących wiele aktywnych kopii genu CYP2D6, a także pozbawionych nieaktywnych genów CYP2D6. Ponieważ zdecydowanie najczęstszymi wariantami genu CYP2D6 duplikowanymi i multiduplikowanymi są CYP2D6*2 i CYP2D6*41, oba tworzące dwie substytucje aminokwasowe w porównaniu do CYP2D6*1, można spekulować, że specyficzność substratowa tej formy enzymu jest korzystna dla metabolizmu niektórych produktów roślinnych. Kolejne migracje osób z Afryki Północno-Wschodniej do obszaru śródziemnomorskiego spowodowały wysoką częstość występowania UMs w Europie Południowej (por. tab. 2).

.