Procedury ekspresji białka, oczyszczania i oznaczania hAASS-SDH
Wektor: pFB-LIC-Bse
Linia komórkowa: DH10Bac
Tagi i dodatki: N-terminalny, TEV protease cleavable hexahistidine tag
Sekwencja białka konstrukcyjnego:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(podkreślona sekwencja zawiera kodowany przez wektor znacznik His-i miejsce rozszczepienia proteazy TEV*)
Zebrane komórki zawieszano w buforze do lizy (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 20 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP, 1 µL na 1 mL koktajlu inhibitora proteazy bez EDTA).
Pelet komórkowy rozpuszczano w około 200 mL buforu do lizy i rozbijano przez homogenizację 2-krotnie przy 12 000 psi. Szczątki komórkowe były granulowane przy 35000 x g, 1h, a supernatant był używany do oczyszczania na kolumnie Ni-NTA o przepływie grawitacyjnym (5 mL).
Używane bufory są wyszczególnione poniżej;
Bufor wiążący: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 20 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Wash Buffer: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 40 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Elution Buffer: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 250 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Klarowany ekstrakt komórkowy dodawano do 5 ml żywicy Ni-NTA wstępnie skalibrowanej buforem lizującym i przepuszczano przez szklaną kolumnę. Następnie kolumnę przemywano Binding Bufferem (2 x 50 mL) i Wash Bufferem (2 x 50 mL). Białko było eluowane za pomocą Elution Buffer we frakcjach 5 x 5 mL. Eliminowane frakcje z kolumny 1 zostały połączone i zatężone do 5 mL za pomocą koncentratora spinowego o MWCO 30 kDa i wstrzyknięte do kolumny S200 16/60 (wstępnie skalibrowanej w GF Buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% Glicerol)) z prędkością 1,0 mL/min. Zebrano 1,5 mL-frakcji. Eluowane białko było rozszczepiane przez noc w 4 °C przez proteazę TEV (1/20 (w/w)). Następnego dnia próbka białka została załadowana na 0,5 ml kolumnę nisko-sefarozową, wstępnie skalibrowaną buforem GF w celu usunięcia nie rozszczepionego białka. Połączone frakcje białkowe zostały skoncentrowane do 13 mg / mL przy użyciu koncentratora mwco 30 kDa.
Activity assay and screening
Aktywność SDH hAASS została zmierzona przez śledzenie redukcji NAD+ do NADH, wykorzystując fakt, że zredukowana forma NADH jest fluorescencyjna, gdy jest wzbudzona światłem 340 nm. Zaadaptowaliśmy test do formatu 384-dołkowego, z detekcją przy użyciu czytnika fluorescencyjnego PheraStar (BMG Labtech) (wzbudzenie/emisja = 340/480 nm). Test ten dał liniową odpowiedź przy stężeniu białka do 150 nM. Typowa reakcja składa się z 100 nM oczyszczonego enzymu, 0.2 mM NAD+, 1.3 mM sacharopiny. Bufor reakcyjny składa się z 25 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS. Biblioteki związków (LOPAC (Sigma) i NIH Clinical Collections I&II) zostały przebadane we własnym zakresie przy stężeniu związku 20 μM.
Różnicowa fluorymetria skaningowa
DSF została przeprowadzona na płytce 96 dołkowej przy użyciu maszyny Mx3005p RT-PCR (Stratagene) z filtrami wzbudzenia i emisji odpowiednio 492 i 610 nm. Każda studzienka zawierała 2 µL białka w 2 µM buforze DSF (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGE rozcieńczonego 1000-krotnie w buforze DSF z zapasów producenta (Invitrogen) i (jeśli dotyczy) 2 µL ligandu w różnych stężeniach. Intensywność fluorescencji mierzono od 25 do 96°C z szybkością rampy 3°C/min.
Krystalizacja
Kryształy Apo przygotowywano mieszając 50 nL białka hAASS-SDH (80 mg/mL) ze 100 nL roztworu zbiornika zawierającego 20% PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 i 0,2-0,33 M malonianu sodu. Kryształy związane z NAD+ przygotowano przez zmieszanie 100 nL hAASS-SDH (18 mg/mL, w molowym nadmiarze NAD+) z 50 nL roztworu zbiornika zawierającego 25% PEG3350, 0.2M NaCl i 0.1M tris pH 8.5. Kryształy były zabezpieczane krio w 9% butanodiolu przed zamrożeniem w ciekłym azocie. Do kampanii przesiewania fragmentów, kryształy były nasączane związkami (10/50/500 mM) w roztworze krystalizacyjnym uzupełnionym 8% butanodiolem przez 5-30 min, a następnie zamrażane w ciekłym azocie.
Procedury wyznaczania struktury
kryształy hAASS-SDH apo i NAD+-bound należą do różnych grup przestrzennych (P43212 vs P212121). Strukturę hAASS-SDH rozwiązano metodą podstawienia molekularnego za pomocą programu PHASER, wykorzystując jako model wyszukiwania grzybową reduktazę sacharopinową z S.cerevisiae (kod PDB 2AXQ) (identyczność sekwencji 38%). Znaleziono dwie cząsteczki w jednostce asymetrycznej (j.w.). Początkowy model został przebudowany przy użyciu programu phenix.autobuild. Związana cząsteczka NAD+ w miejscu aktywnym została zidentyfikowana metodą różnic Fouriera i ręcznie umieszczona w gęstości elektronowej za pomocą programu Coot. W celu ukończenia modelu wykonano iteracyjne cykle phenix.refine, włączając w to rafinację TLS, a następnie ręczne budowanie modelu dla brakujących reszt przy użyciu Coot. Nie zastosowano ograniczeń NCS ze względu na różnice konformacyjne w domenie III (res 278-376) dwóch kopii w a.u. Atomy rozpuszczalnika zostały umieszczone podczas ostatnich czterech rund rafinacji przy użyciu phenix.refine. Do kampanii przesiewania fragmentów, ligandy zostały zidentyfikowane przez DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) przy użyciu map gęstości różnic. Słabsze wiązania o niskiej zajętości były oceniane przy użyciu PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), opartego na modelach statystycznych w celu znalezienia gęstości ligandów obecnych w danym zestawie danych, które nie są obecne w większości zestawów danych. Współrzędne i współczynniki struktury dla wszystkich zestawów danych są zdeponowane w RCSB Protein Data Bank. Statystyki zbierania danych i rafinacji są dostępne na stronach PDB.
Odczynniki dostępne komercyjnie
Plazmidy knockoutCRISPR/Cas9
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157
.