Choć testy białkowe mają wiele zastosowań w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych, nie ma jednej metody testowej, która byłaby odpowiednia dla wszystkich aplikacji. Pomimo wszystkich postępów w nowoczesnej nauce, nie istnieje metoda badania białek, na którą nie mają wpływu żadne składniki niebiałkowe lub różnice w składzie białek. Z tego powodu laboratoria białkowe uważają, że konieczne jest posiadanie więcej niż jednego typu testu białkowego do zastosowań badawczych.
Każdy test ma swoje zalety i ograniczenia. Tak więc, jeśli chcesz uzyskać dokładne wyniki swojego eksperymentu, powinieneś być w stanie wybrać najbardziej odpowiedni test do swojego zastosowania.
Typy kolorymetrycznych testów białkowych
W oparciu o zaangażowaną chemię, dwie najbardziej powszechne metody kolorymetrycznego wykrywania i ilościowego oznaczania białka całkowitego to test wiązania białka z barwnikiem i/lub test chelatowania oparty na jonach miedzi.
Atesty wiązania barwnika
Atesty wiązania barwnika, takie jak Bradford (Coomassie) i testy białkowe 660 nm, są oparte na wiązaniu cząsteczek białka z barwnikiem Coomassie w warunkach kwaśnych. Gdy cząsteczki białka zwiążą się z barwnikiem, kolor zmienia się z brązowego (Amax= 465nm) na niebieski (Amax= 610nm). Zmiana gęstości koloru (odczytywana przy długości fali 595nm) jest proporcjonalna do stężenia białka.
Aminokwasy podstawowe (arginina, lizyna i histydyna) odgrywają istotną rolę w tworzeniu kompleksów barwnik-białko i wynikającym z tego przesunięciu spektralnym, podczas gdy mniejsze białka (poniżej 3kDa) i aminokwasy nie powodują zmiany koloru.
Atesty oparte na jonach miedzi
W testach białkowych opartych na jonach miedzi, roztwór białka jest mieszany z alkalicznym roztworem soli miedzi w celu ułatwienia chelatowania jonów miedziowych (Cu2+) z wiązaniami peptydowymi, a następnie redukcji jonów miedziowych (Cu2+) do jonów miedziowych (Cu+). Nadmiar jonów miedzi pozostanie niezwiązany z wiązaniami peptydowymi i będzie dostępny do wykrycia.
Znaczenia białkowe oparte na jonach miedzi można podzielić na dwie grupy – (1) oznaczenia, które wykrywają zredukowane jony miedziowe (Cu+) i (2) oznaczenia, które wykrywają niezwiązane jony miedziowe (Cu2+). Do wykrywania jonów miedziowych można stosować kwas bicynchoninowy (BCA) lub odczynnik Folina (kwas fosfomolibdenowy/fosfotungstowy). Po redukcji stosowanego odczynnika powstaje niebieski kolor. Ilość powstałego koloru można odczytać przy 650nm do 750nm i jest ona proporcjonalna do ilości wiązań peptydowych.
Uwaga: Obecność tyrozyny, tryptofanu, cysteiny, histydyny i aspargininy w białku zwiększa gęstość powstałego koloru.
W oznaczeniach opartych na wykrywaniu niezwiązanych jonów miedziowych, miedź alkaliczna jest mieszana z roztworem białka, a niezwiązane jony miedziowe są następnie wykrywane za pomocą odczynnika wytwarzającego kolor, który reaguje z jonami miedziowymi. Ilość wytworzonego koloru jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wiązania peptydowego w próbce.
Selecting Protein Assays: Some Factors to Consider
Istnieje wiele czynników, które należy rozważyć przy wyborze testu. Oto niektóre z nich.
- Zgodność z typem próbki i składnikami. Charakter próbki białkowej i obecność czynników niebiałkowych w roztworach białkowych może znacząco wpłynąć na wyniki Twojego eksperymentu. Należy pamiętać, że obecność środków redukujących, środków chelatujących metale, barwników, amin i cukrów zakłóca testy białkowe oparte na miedzi, podczas gdy roztwory białkowe zawierające detergenty zakłócają testy białkowe oparte na barwnikach.
- Zakres analizy i wymagana objętość próbki. Większość testów kolorymetrycznych wymaga co najmniej 0.5µg białka dla wiarygodnego oszacowania. W związku z tym, w przypadku próbek trudnych do uzyskania, należy rozważyć metody, które wymagają najmniejszej ilości próbki do wiarygodnego oszacowania.
- Jednolitość między białkami. Oznaczenia białek oparte na barwnikach oraz te obejmujące redukcję jonów miedziowych do jonów miedziowych charakteryzują się znaczną zmiennością między białkami.
- Względy czasowe. Złożoność próbki i wybrana metoda analizy dyktują ilość czasu potrzebnego do wykonania analizy białek. Próbki białek zawierające czynniki zakłócające oraz analizy wykorzystujące standardowe wykresy lub krzywe będą wymagały więcej czasu.
- Wymagania dotyczące oprzyrządowania. Dostępność spektrofotometru lub czytnika płytek niezbędnego do pomiaru koloru wytworzonego (absorbancji) przez test może również wpłynąć na wybór.
.