Moc diagnostyczna testów laboratoryjnych dla dziedzicznej sferocytozy: a comparison study in 150 patients grouped according to molecular and clinical characteristics

Abstract

Wstęp Diagnostyka laboratoryjna dziedzicznej sferocytozy powszechnie opiera się na testach kruchości osmotycznej krwinek czerwonych opartych na NaCl lub glicerolu; ostatnio zaproponowano badanie bezpośrednio ukierunkowane na defekt molekularny dziedzicznej sferocytozy (test wiązania eozyny-5′-maleimidu). Żaden z dostępnych testów nie identyfikuje wszystkich przypadków dziedzicznej sferocytozy.Projekt i metody Porównaliśmy wydajność testu wiązania eozyny-5′-maleimidu, badania kruchości NaCl-osmotycznej na świeżej i inkubowanej krwi, testu lizy glicerolu, testu lizy zakwaszonego glicerolu i testu Pink na serii 150 pacjentów z dziedziczną sferocytozą, pogrupowanych zgodnie z fenotypem klinicznym i wadliwym białkiem, z ostatecznym celem znalezienia kombinacji testów związanych z najwyższą mocą diagnostyczną, nawet w najłagodniejszych przypadkach dziedzicznej sferocytozy.Wyniki Test wiązania eozyny-5′-maleimidu charakteryzował się czułością 93% i swoistością 98% w wykrywaniu dziedzicznej sferocytozy: czułość była niezależna od rodzaju i wielkości defektu molekularnego oraz fenotypu klinicznego. Test zakwaszonej lizy glicerolowej i test Pink’a wykazywały porównywalną czułość (95% i 91%). Czułość testów na kruchość osmotyczną NaCl, powszechnie uważanych za złoty standard w diagnostyce dziedzicznej sferocytozy, wynosiła 68% dla krwi świeżej i 81% dla krwi inkubowanej, i dalej spadała w przypadkach skompensowanych (odpowiednio 53% i 64%). Połączenie testu wiązania eozyny-5′-maleimidu i testu lizy zakwaszonego glicerolu umożliwiło identyfikację wszystkich pacjentów z dziedziczną sferocytozą. Test wiązania eozyny-5′-maleimidu wykazał największą swoistość choroby.Wnioski Każdy rodzaj testu nie pozwala zdiagnozować niektórych przypadków dziedzicznej sferocytozy. Połączenie testu wiązania eozyny-5′-maleimidu z testem lizy zakwaszonego glicerolu umożliwiło identyfikację wszystkich pacjentów z dziedziczną sferocytozą w tej serii i dlatego stanowi obecnie skuteczną strategię diagnostyczną dla dziedzicznej sferocytozy, w tym przypadków łagodnych / skompensowanych.

Wprowadzenie

Sferocytoza dziedziczna jest najczęstszą wrodzoną niedokrwistością hemolityczną u osób rasy kaukaskiej, występującą u około 1 na 1000-2000 osób.1,2 Defekt molekularny jest wysoce heterogenny i obejmuje geny kodujące spektrynę, ankirynę, pasmo 3 i białko 4.2,3 a stopień hemolizy jest bardzo zróżnicowany, od w pełni wyrównanej do niedokrwistości zależnej od transfuzji.

Typowym laboratoryjnym znakiem rozpoznawczym dziedzicznej sferocytozy, chociaż nieswoistym, jest obecność sferocytów w rozmazie krwi obwodowej, które są wykrywalne u 97% pacjentów.4 Jednak u niektórych pacjentów sferocyty mogą być bardzo nieliczne4,5 i dlatego do ich wykrycia niezbędni są wykwalifikowani operatorzy; co więcej, w dobie automatyzacji laboratoriów coraz częściej pomija się badanie mikroskopowe krwinek czerwonych. Laboratoryjna diagnostyka dziedzicznej sferocytozy opiera się zatem powszechnie na testach wykorzystujących stosunek powierzchni do objętości, zwykle zmniejszony w erytrocytach sferycznych, w szczególności na testach kruchości osmotycznej krwinek czerwonych przy różnych stężeniach chlorku sodu (NaCl) na świeżej i inkubowanej krwi,6 oraz testach mierzących zakres lub szybkość lizy krwinek czerwonych zawieszonych w zbuforowanych roztworach glicerolu, tj.tj. test lizy glicerolu (GLT)7 , test zakwaszonej lizy glicerolu (AGLT)8 oraz test Pink’a9. Testy te nie wychwytują jednak zmiennego odsetka przypadków sferocytozy dziedzicznej, szczególnie tych najłagodniejszych,6,10-12 i nie różnicują sferocytozy dziedzicznej od sferocytozy wtórnej związanej z innymi schorzeniami, głównie autoimmunologicznymi niedokrwistościami hemolitycznymi.13-Ostatnio jako nowe metody identyfikacji dziedzicznej sferocytozy zaproponowano test kriohemolizy,16,17 oparty na obserwacji, że krwinki czerwone pochodzące od pacjentów z dziedziczną sferocytozą są szczególnie podatne na chłodzenie w temperaturze 0° C w warunkach hipertonicznych, oraz cytometryczną analizę przepływową nienaruszonych krwinek czerwonych znakowanych eozyną-5′-maleimidem (test wiązania EMA)18 . Szczególnie ten ostatni okazał się czułym i swoistym testem diagnostycznym dla dziedzicznej sferocytozy12,18,20-29 bezpośrednio ukierunkowanym na zmiany strukturalne tej choroby, ponieważ sonda fluorescencyjna, eozyno-5′-maleimid, oddziałuje z kompleksem białkowym pasma 3.30

Wydajność dostępnych bezpośrednich lub pośrednich testów diagnostycznych była w większości oceniana indywidualnie i na ograniczonej liczbie przypadków. Czułość testów jest bardzo różna, a każda metoda nie pozwala zidentyfikować kilku pacjentów z dziedziczną sferocytozą.4,6,12 W tym badaniu porównano wyniki testów wiązania EMA, kruchości osmotycznej krwi świeżej i inkubowanej indukowanej NaCl, GLT, AGLT i testu Pink na serii 150 pacjentów z dziedziczną sferocytozą, pogrupowanych według fenotypu klinicznego i zmian molekularnych, z ostatecznym celem znalezienia kombinacji testów związanych z najwyższą mocą diagnostyczną dla dziedzicznej sferocytozy, w tym najłagodniejszych przypadków, które są zwykle trudne do zdiagnozowania.

Projekt i metody

Przedmioty

Badano stu pięćdziesięciu kolejnych pacjentów z dziedziczną sferocytozą (79 mężczyzn i 71 kobiet, mediana wieku 26 lat, zakres 0-79 lat) należących do 128 niespokrewnionych rodzin. W momencie badania 22 pacjentów poddano splenektomii, a 128 nie poddano splenektomii.

Wszystkich pacjentów poddano ocenie klinicznej i przedmiotowej oraz wykonano następujące badania laboratoryjne: pełną morfologię krwi, badanie rozmazu krwi, liczbę retikulocytów, oznaczenia stężenia bilirubiny i haptoglobiny, ocenę statusu żelaza, bezpośredni test antyglobulinowy (DAT), badanie przesiewowe w kierunku nieprawidłowych lub niestabilnych hemoglobin, test kruchości osmotycznej NaCl na świeżej i inkubowanej krwi, GLT, AGLT, test różowy i test wiązania EMA. W niektórych przypadkach badano aktywność najważniejszych enzymów szlaku glikolitycznego i pentozo-fosforanowego. U kilku pacjentów wykonano również stymulowany mitogenem test DAT31, aby wykluczyć rozpoznanie DAT-ujemnej niedokrwistości hemolitycznej.

Sferocytozę dziedziczną rozpoznawano na podstawie klinicznych i laboratoryjnych objawów przewlekłej hemolizy, obecności sferocytów w badaniu rozmazu krwi obwodowej, dodatniego wyniku co najmniej jednego testu kruchości krwinek czerwonych, rodzinnego wywiadu w kierunku dziedzicznej sferocytozy, jeśli taki istnieje, oraz wykluczenia innych przyczyn sferocytozy wtórnej.19 Niedokrwistość zdefiniowano jako ciężką (Hb<8 g/dl), umiarkowaną (Hb 8-10 g/dl), łagodną (Hb>10 i <11,5 g/dl dla kobiet i Hb>10 i <13,5 g/dl dla mężczyzn) i wyrównaną (Hb>11,5 g/dl dla kobiet i >13,5 g/dl dla mężczyzn).

Próbki od wszystkich pacjentów poddano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) w celu analizy białek błonowych krwinek czerwonych i podzielono je w zależności od tego, czy występował niedobór pasma 3, spektryny lub ankyryny, połączony niedobór spektryny/ankryny oraz brak wykrywalnego defektu.4

Pięćset siedemdziesiąt pięć zdrowych dawców krwi i 84 przypadki z niedokrwistością hemolityczną inną niż dziedziczna sferocytoza (17 z autoimmunologiczną niedokrwistością hemolityczną, 10 z zaburzeniami enzymatycznymi krwinek czerwonych, 10 z dziedziczną eliptocytozą, 15 z wrodzoną niedokrwistością dyserytropoetyczną, 9 z napadową nocną hemoglobinurią, 3 ze stomatocytozą, 3 z niedokrwistością mechaniczną i 17 z niedokrwistością o nieznanej przyczynie).

Atesty hematologiczne

Krew obwodowa została pobrana od pacjentów i kontroli podczas procedur diagnostycznych po uzyskaniu świadomej zgody i zatwierdzeniu przez Institutional Human Research Committee. Stosowane procedury były zgodne z międzynarodowymi standardami etycznymi Helsinek dotyczącymi eksperymentów na ludziach. Zdecydowana większość próbek została pobrana w naszym instytucie; próbki pobrane z innych ośrodków były wysyłane w temperaturze 4°C i zawsze przetwarzane w ciągu 24 h. Wszystkie badania były wykonywane w jednym miejscu. Żaden z pacjentów nie był poddany transfuzji w ciągu 3 miesięcy poprzedzających badanie. Parametry hematologiczne oznaczano na automatycznym analizatorze hematologicznym (Automatic Beckman Coulter LH-750, CA, USA). Rutynowe badania hematologiczne przeprowadzono według Dacie & Lewis.32 Poziom bilirubiny, haptoglobiny i ferrytyny oznaczono przy użyciu aparatu Integra 800 (Roche, Mannheim, Niemcy). Liczba sferocytów we krwi obwodowej została oceniona przez dwóch niezależnych i biegłych operatorów. Kruchość osmotyczną krwinek czerwonych oceniano, wykonując test kruchości osmotycznej NaCl zarówno na świeżej, jak i inkubowanej krwi,6 standardowy GLT,7 AGLT8 i test Pink9 na próbkach od każdego pacjenta.

Test wiązania EMA przeprowadzono zgodnie z opisem King i wsp.18 z niewielkimi modyfikacjami. W szczególności intensywność fluorescencji, wyrażona jako mediana fluorescencji kanału, została określona dla 10 000 zdarzeń w kanale FL-1, przy użyciu cytometru przepływowego FACSCanto II firmy Becton Dickinson (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Roztwór podstawowy barwnika EMA był przechowywany w małych podwielokrotnościach w temperaturze -80° C przez okres 6 miesięcy. Test wykonywano raz w tygodniu grupując wszystkie przypadki w tym samym dniu25 po potwierdzeniu odtwarzalności wyników na próbkach krwi przechowywanych do 6 dni w temperaturze 4°C.

W celu zmniejszenia zmienności wewnątrz oznaczenia, próbki pacjentów porównywano z próbkami sześciu normalnych kontroli. Wyniki wyrażono jako procent redukcji fluorescencji próbki pacjenta w porównaniu ze średnią fluorescencją sześciu prawidłowych kontroli, jak zaproponowali Girodon i wsp.25 Do określenia optymalnego punktu odcięcia między wartościami uzyskanymi od pacjentów z dziedziczną sferocytozą a wartościami uzyskanymi od osób zdrowych wykorzystano krzywą ROC (receiver operating characteristic) opartą na analizie regresji logistycznej. Zgodnie z analizą krzywej ROC optymalny spadek fluorescencji pozwalający na oddzielenie osób zdrowych od pacjentów z dziedziczną sferocytozą wynosił 11%. W tych warunkach swoistość testu obliczona na 575 zdrowych osobach wynosiła 98%.

Duchy krwinek czerwonych przygotowywano w ciągu 24 h od pobrania krwi, stosując metodę opisaną przez Dodge’a i wsp.33 z niewielkimi modyfikacjami.4 Białka błonowe krwinek czerwonych analizowano w ciągu 15 dni od przygotowania ducha za pomocą SDS-PAGE, stosując gradient akrylamidu od 4% do 12% zgodnie z Fairbanksem i wsp.34 oraz nieciągły system buforowy Laemmli35 z liniowym gradientem akrylamidu od 6% do 14%, jak wcześniej opisano.4 Aktywność enzymów szlaku glikolitycznego i pentozo-fosforanowego oznaczano za pomocą metod opisanych przez Beutlera.36

Wyniki

W tabeli 1 przedstawiono dane hematologiczne i biochemiczne pacjentów z dziedziczną sferocytozą, pogrupowanych zgodnie z tym, czy nie poddano ich splenektomii, czy poddano splenektomii przed czasem badania, oraz zgodnie z fenotypem klinicznym (tylko u pacjentów niepoddanych splenektomii). Większość pacjentów bez splenektomii miała łagodną lub wyrównaną hemolizę; 18% miało bardzo mało sferocytów (≤3%). Najczęstszymi nieprawidłowościami białkowymi były niedobory spektryny i pasma 3 zarówno u pacjentów nie splenektomizowanych, jak i splenektomizowanych. Defekt białka błonowego był niewykrywalny u dziewięciu (7%) osób bez splenektomii, z których siedem miało dodatni wywiad rodzinny w kierunku dziedzicznej sferocytozy; pozostałe dwie osoby wykazywały łagodną niedokrwistość, retikulocytozę i 5% sferocytów, przy braku innych przyczyn przewlekłej niedokrwistości hemolitycznej.

Tabela 2 porównuje czułość diagnostycznych testów laboratoryjnych dla dziedzicznej sferocytozy. Wiązanie EMA nie pozwoliło zidentyfikować 10/150 (7%) przypadków (4 z niedoborem pasma 3, 5 z niedoborem spektryny i 1 z niewykrytym defektem). Średni spadek fluorescencji wynosił 27% ± 10% u pacjentów z dziedziczną sferocytozą w porównaniu do 0% ± 8% u osób z grupy odniesienia (P<0,001). Procentowe zmniejszenie fluorescencji było bezpośrednio związane z liczbą sferocytów i pośrednio ze średnią objętością ciałka żółtego; nie stwierdzono korelacji ze stężeniem hemoglobiny, bezwzględną liczbą retikulocytów ani szerokością dystrybucji krwinek czerwonych. Czułość testu była niezależna od rodzaju i wielkości defektu molekularnego, chociaż była nieco niższa u pacjentów z niewykrytymi defektami, u których mediana spadku fluorescencji była najmniejsza (15% w porównaniu z 30% i 28% odpowiednio w niedoborze pasma 3 i spektryny). Warto zauważyć, że czułość testu wiązania EMA była nieco wyższa u pacjentów po splenektomii niż u pacjentów bez splenektomii (Figura 1).

Czułość różnych badanych testów kruchości krwinek czerwonych była bardzo zmienna i ogólnie wyższa u pacjentów po splenektomii niż u pacjentów bez splenektomii z dziedziczną sferocytozą i niższa (z wyjątkiem AGLT) u pacjentów z niewykrytymi defektami niż u pacjentów z wykrywalnymi defektami (Tabela 2A). Jeśli chodzi o test kruchości osmotycznej NaCl, czułość była większa, gdy był wykonywany na krwi inkubowanej niż na krwi świeżej. Ogólnie rzecz biorąc, testy kruchości osmotycznej NaCl (zarówno na krwi świeżej, jak i inkubowanej) miały niższą czułość niż częściej stosowane testy oparte na glicerolu. Wśród tych ostatnich testów AGLT miał najwyższą czułość, również w przypadkach z niewykrytymi defektami, porównywalną z czułością testu wiązania EMA.

Tabela 1.Dane hematologiczne i biochemiczne pacjentów z dziedziczną sferocytozą, pogrupowanych w zależności od tego, czy wykonano u nich splenektomię, czy nie.

Wszyscy pacjenci z dziedziczną sferocytozą byli pozytywni dla co najmniej dwóch różnych testów, z wyjątkiem dwóch pacjentów (1 z niedoborem pasma 3 i 1 z niedoborem spektryny), którzy byli pozytywni tylko w teście wiązania EMA. Stwierdziliśmy, że połączenie EMA i AGLT umożliwiło identyfikację wszystkich pacjentów z dziedziczną sferocytozą (Tabela 2B). W szczególności, 133/150 (88%) przypadków dziedzicznej sferocytozy było EMA-dodatnich, AGLT-dodatnich, 7/150 (5%) było EMA-dodatnich, AGLT-ujemnych i 10/150 (7%) było EMA-ujemnych, AGLT-dodatnich.

Gdy wydajność różnych testów była analizowana u pacjentów bez splenektomii jako funkcja fenotypu klinicznego, wiązanie EMA, AGLT i test Pink utrzymywały wysoką czułość w różnych podgrupach klinicznych, podczas gdy czułość testu kruchości osmotycznej NaCl na świeżej krwi i po inkubacji wyraźnie spadła w przypadkach skompensowanych (Figura 1).

Wyniki różnych testów w serii 84 pacjentów z warunkami hemolitycznymi innymi niż dziedziczna sferocytoza są przedstawione na rycinie 2. Wiązanie EMA wykazało większą swoistość choroby, będąc ujemne u wszystkich pacjentów z autoimmunologiczną niedokrwistością hemolityczną, nawet w obecności wyraźnej sferocytozy.

Dyskusja

Jest to pierwsze obszerne badanie porównawcze najbardziej obecnie stosowanych metod laboratoryjnych do diagnozowania dziedzicznej sferocytozy, przeprowadzone na dużej liczbie pacjentów pogrupowanych zgodnie z defektem molekularnym, stopniem hemolizy i obecnością lub brakiem śledziony. Stwierdzenie, że połowa badanych pacjentów miała łagodną/skompensowaną niedokrwistość, a zatem była trudniejsza do zdiagnozowania, oraz że 18% miało bardzo mało sferocytów w rozmazie krwi obwodowej, czyni badaną populację szczególnie odpowiednią do badań wrażliwości. W niniejszej pracy nie uwzględniliśmy testu kriohemolizy17 , ponieważ do tej pory nie wyjaśniono podstawy wrażliwości krwinek czerwonych z dziedziczną sferocytozą na chłodzenie, a opinie na temat jego rutynowego stosowania w diagnostyce dziedzicznej sferocytozy są kontrowersyjne.4,5,16,17,19,37,38

Tabela 2.(A) Czułość pojedynczych testów u pacjentów z dziedziczną sferocytozą (HS) pogrupowanych według defektu biochemicznego. (B) Czułość testów łączonych w całkowitej liczbie przypadków HS. Liczba reprezentuje stosunek pozytywnych przypadków / całkowitych przypadków z wartościami procentowymi w nawiasach.

Rysunek 1.Czułość różnych testów diagnostycznych u 22 splenektomowanych i 128 nie splenektomowanych pacjentów z dziedziczną sferocytozą (HS). Nie splenektomizowani pacjenci z HS zostali podzieleni według fenotypu klinicznego.

Wśród rozważanych metod diagnostycznych z pewnością najbardziej interesujący jest ostatnio zaproponowany test wiązania EMA, który jest coraz częściej stosowany przez specjalistyczne laboratoria ze względu na wysoką czułość i swoistość.12,18,23-Metoda ta jest bezpośrednio skierowana na zmiany strukturalne choroby, ponieważ sonda fluorescencyjna eozyno-5′-maleimidu oddziałuje z białkami transmembranowymi pasma 3, białkiem Rh, glikoproteiną Rh i CD47, które są zmniejszone w krwinkach czerwonych od pacjentów z dziedziczną sferocytozą;30 defekty innych białek cytoszkieletowych, takich jak spektryna i białko 4.2, również powodują zmniejszenie intensywności fluorescencji, prawdopodobnie dlatego, że wywołują efekt modulacji dalekiego zasięgu na miejsce wiązania barwnika w białku pasma 3.39 Czułość testu wiązania EMA w tej serii jest wyższa niż ostatnio zgłoszona przez Crisp i wsp.,12 i podobna do stwierdzonej przez innych;18,23-29 ponadto wydajność testu wydaje się być niezależna od rodzaju niedoboru białek błonowych krwinek czerwonych i zmniejsza się tylko nieznacznie u pacjentów z dziedziczną sferocytozą z niewykrywalnym defektem, zgodnie z tym, co zaobserwowali King i wsp.,18 i Girodon i wsp.25 Co ciekawe, czułość jest niezależna od fenotypu klinicznego, będąc wysoką również u pacjentów z niedokrwistością skompensowaną. Oddzielna analiza pacjentów z dziedziczną sferocytozą nie poddanych splenektomii i pacjentów poddanych splenektomii wykazała, że czułość wzrosła w tej drugiej grupie, co jest ogólnie wspólne dla wszystkich badanych testów; ta obserwacja wskazuje na potrzebę dokładnego zdefiniowania charakterystyki klinicznej pacjentów podczas testowania wydajności metod diagnostycznych dla dziedzicznej sferocytozy i ewentualnie ograniczenia analizy do osób nie poddanych splenektomii. Kolejną zaletą testu wiążącego EMA jest to, że na wyniki nie ma wpływu transport lub przechowywanie przez okres do 6 dni, jak pokazano na rycinie 3, umożliwiając w ten sposób transport próbek, jak podali Girodon i wsp.25. Ponadto na wyniki nie mają wpływu niedawne transfuzje, ponieważ metoda dyskryminuje różne populacje krwinek czerwonych.20

Rycina 2.Wyniki poszczególnych testów diagnostycznych u pacjentów z niedokrwistościami hemolitycznymi innymi niż dziedziczna sferocytoza (HS), w porównaniu z pacjentami z HS. Obszar zacieniony reprezentuje normalne przedziały referencyjne. CDA: wrodzona niedokrwistość dyserytropoetyczna; AIHA: autoimmunologiczna niedokrwistość hemolityczna; HE: dziedziczna eliptocytoza; PNH: napadowa nocna hemoglobinuria

Jeśli chodzi o testy kruchości osmotycznej NaCl, stwierdziliśmy, że nie udało się ich zidentyfikować prawie jednej czwartej pacjentów z dziedziczną sferocytozą, potwierdzając wyniki innych badaczy,12,13,19,40,41 i że ich czułość była ogólnie niższa niż czułość innych diagnostycznych testów laboratoryjnych ocenianych w tej serii. Mimo to kruchość osmotyczna w inkubowanym NaCl jest nadal powszechnie uważana za złoty standard w rozpoznawaniu dziedzicznej sferocytozy u pacjentów z ujemnymi niedokrwistościami hemolitycznymi Coombsa.5,11,42 Analiza piśmiennictwa wykazała, że w przeszłości nie przeprowadzono systematycznych badań nad czułością tego testu, a twierdzenie, że jest to najlepsza metoda diagnostyki dziedzicznej sferocytozy, opiera się na badaniach przeprowadzonych na ograniczonej liczbie pacjentów o nie do końca zdefiniowanej charakterystyce klinicznej; ponadto interpretacja krzywych kruchości osmotycznej NaCl może być trudna w mniej typowych przypadkach.8 Duża liczba pacjentów uwzględnionych w tej serii umożliwiła nam skorelowanie wyników testu kruchości osmotycznej NaCl z kliniczną ekspresją choroby: obserwacja, że w przypadkach skompensowanej dziedzicznej sferocytozy czułość testu kruchości osmotycznej zmniejszyła się do prawie 60%, znacznie więcej niż podał Korones & Pearson,13 dodatkowo ogranicza przydatność tej metody w najłagodniejszych i mniej typowych przypadkach. Potwierdza to również stwierdzenie, że czułość spada do 30% u pacjentów z dziedziczną sferocytozą z niewykrywalnym defektem biochemicznym.

Testy kruchości krwinek czerwonych oparte na glicerolu, z wyjątkiem oryginalnej wersji GLT, są bardziej czułe niż test kruchości osmotycznej NaCl; w szczególności w tej serii AGLT miał czułość 95%, podobną do stwierdzonej przez innych1,15,43,44 i wyższą niż zgłoszona przez Cynobera i wsp.10 oraz Bucxa i wsp.45. oraz Bucx i wsp.45 Czułość AGLT była również wysoka w przypadkach skompensowanych i z niewykrytym defektem biochemicznym. Ponadto warto zauważyć, że AGLT zidentyfikowała dziesięć EMA-ujemnych przypadków dziedzicznej sferocytozy.

Kojarzenie wiązania EMA i AGLT umożliwiło identyfikację wszystkich przypadków dziedzicznej sferocytozy w tej serii; ponieważ cytometr przepływowy nie jest dostępny we wszystkich laboratoriach diagnostycznych, warto wspomnieć, że AGLT plus test kruchości osmotycznej NaCl na inkubowanej krwi podnosi czułość diagnostyczną do 97%, podobną do zgłoszonej wcześniej w większej serii pacjentów4: w każdym przypadku wartość ta jest wyższa niż uzyskana przez połączenie testu wiązania EMA i testu kriohemolizy, jak ostatnio podali Crisp i wsp.12

Rysunek 3.(A) Średnie wartości fluorescencji kanału w normalnych kontrolach i u pacjentów z dziedziczną sferocytozą (HS) w różnych dniach przechowywania. (B-C) Wyniki testu wiązania EMA w próbkach od 150 pacjentów z HS, pogrupowanych według wysyłki (B) i dni przechowywania przed testem (C). ■ Kontrole, – HS nie wysłany, ○ HS wysłany.

Rycina 4.Schemat przepływu diagnostyki laboratoryjnej dziedzicznej sferocytozy (HS).

Swoistość chorobowa testów diagnostycznych dla dziedzicznej sferocytozy została oceniona poprzez włączenie dużej grupy pacjentów z różnymi typami niedokrwistości hemolitycznej, które mogą wykazywać cechy morfologiczne i laboratoryjne podobne do tych występujących w dziedzicznej sferocytozie. Zgodnie z oczekiwaniami, wyniki wiązania EMA, pod względem procentowej redukcji fluorescencji, były bezpośrednio związane z liczbą sferocytów tylko u pacjentów z dziedziczną sferocytozą, ale nie u pacjentów z autoimmunologiczną niedokrwistością hemolityczną, nawet u tych z wyraźną sferocytozą: ta obserwacja jest zgodna z wysoką specyficznością chorobową tego testu opisaną przez innych.19-21,25 Stwierdziliśmy, że inne testy, w szczególności te oparte na glicerolu, są mniej specyficzne niż wiązanie EMA, ponieważ, jak opisano wcześniej,8,9,14,15,46 są one często pozytywne również w nabytych niedokrwistościach hemolitycznych. Warto wspomnieć, że żaden z dostępnych testów diagnostycznych dla sferocytozy dziedzicznej, zarówno bezpośrednich, jak i pośrednich, nie różnicuje sferocytozy dziedzicznej z wrodzoną niedokrwistością dyserytropoetyczną typu II. To ostatnie zaburzenie, chociaż mniej powszechne niż dziedziczna sferocytoza, może naśladować obraz kliniczny, morfologię krwinek czerwonych i zwiększoną kruchość osmotyczną krwinek czerwonych w dziedzicznej sferocytozie i może wymagać analizy SDS-PAGE w celu identyfikacji: Mariani i wsp. podali, że 13% przypadków skierowanych do laboratorium referencyjnego z tymczasowym oznaczeniem dziedzicznej sferocytozy okazało się być wrodzoną niedokrwistością dyserytropoetyczną typu II po zbadaniu metodą SDS-PAGE.47

Wytyczne diagnostyczne dotyczące dziedzicznej sferocytozy opracowane przez British Committee for Standards in Hematology,19 jedyne jak dotąd dostępne, zalecają jako metodę przesiewową wiązanie EMA lub test kriohemolizy,16 czynnikiem decydującym o wyborze jest dostępność cytometru przepływowego. Wytyczne nie precyzują, czy w przypadku niejednoznacznych lub granicznych wyników należy wykonać oba testy. W każdym razie nawet skojarzenie tych dwóch testów daje czułość 93%, podobną do czułości EMA-binding lub AGLT stosowanych oddzielnie i znacznie niższą niż czułość uzyskana przez połączenie EMA-binding plus AGLT.

Jak widać na rycinie 4, w przypadku pacjenta z DAT-ujemną przewlekłą hemolizą ze sferocytami, ujemność zarówno EMA, jak i AGLT umożliwia wykluczenie dziedzicznej sferocytozy. Pozytywność wiązania EMA (z pozytywnym lub negatywnym AGLT) prowadzi do rozpoznania dziedzicznej sferocytozy, z wyjątkiem tych niedominujących przypadków z nieadekwatną retikulocytozą11, które wymagają analizy SDS-PAGE w celu wykluczenia wrodzonej niedokrwistości dyserytropoetycznej typu II. Analiza SDS-PAGE może być również wymagana w rzadkich przypadkach EMA-ujemnych, AGLT-poistywnych z ujemnym wywiadem rodzinnym, ze względu na mniejszą swoistość AGLT.

Podsumowując, żaden pojedynczy test nie jest w stanie zidentyfikować wszystkich przypadków dziedzicznej sferocytozy. Powiązanie wiązania EMA, które jest bezpośrednio ukierunkowane na defekt strukturalny dziedzicznej sferocytozy, i AGLT, które wykorzystuje stosunek powierzchni krwinek czerwonych do ich objętości, pozwoliło nam zidentyfikować wszystkich pacjentów z dziedziczną sferocytozą w tej serii i dlatego stanowi bardzo skuteczną strategię diagnostyczną dziedzicznej sferocytozy również w łagodnych/skompensowanych przypadkach. Należy jednak podkreślić, że rozpoznanie sferocytozy dziedzicznej jest ostatnim etapem diagnostyki opartej nie tylko na badaniach laboratoryjnych, ale także na badaniu klinicznym, wywiadzie rodzinnym i wykluczeniu możliwych przyczyn sferocytozy wtórnej.

Footnotes

• Funding: This work was supported by a grant from the Foundation IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico of Milan, RC2009 160/01 and ENERCA III project, EC 2008, convention n. 210.
• Authorship and DisclosuresInformacje dostarczone przez autorów o wkładzie osób wymienionych jako autorzy i w podziękowaniach są dostępne wraz z pełnym tekstem pracy na stronie www.haematologica.org.
• Informacje finansowe i inne ujawnione przez autorów przy użyciu ICMJE (www.icmje.org) Uniform Format for Disclosure of Competing Interests są również dostępne na stronie www.haematologica.org.

• Received August 4, 2011.
• Revision received October 11, 2011.
• Accepted October 26, 2011.

1. Eber SW, Pekrun A, Neufeldt A, Schröter W. Prevalence of increased osmotic fragility of erythrocytes in German blood donors: screening using a modified glycerol lysis test. Ann Hematol. 1992; 64(2):88-92. PubMedhttps://doi.org/10.1007/BF01715351Google Scholar
2. Tse WT, Lux SE. Zaburzenia błony komórkowej krwinek czerwonych. Br J Haematol. 1999; 104(1):2-13. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1999.01130.xGoogle Scholar
3. Gallagher PG. Zaburzenia błony komórkowej czerwonych krwinek. Hematologia Am Soc Hematol Educ Program. 2005;13-8. Google Scholar
4. Mariani M, Barcellini W, Vercellati C, Marcello AP, Fermo E, Pedotti P. Cechy kliniczne i hematologiczne 300 pacjentów dotkniętych dziedziczną sferocytozą pogrupowanych według typu defektu białka błonowego. Haematologica. 2008; 93(9):1310-7. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.12546Google Scholar
5. Hematologia niemowlęctwa i dzieciństwa. Saunders: Philadelphia; 2009. Google Scholar
6. Parpart AK, Lorenz PB, Parpart ER, Gregg JR, Chase AM. Opór osmotyczny (kruchość) ludzkich krwinek czerwonych. J Clin Invest. 1947; 26(4):636-40. PubMedhttps://doi.org/10.1172/JCI101847Google Scholar
7. Gottfried EL, Robertson NA. Czas lizy glicerolu inkubowanych erytrocytów w diagnostyce dziedzicznej sferocytozy. J Lab Clin Med. 1974; 84(5):746-51. PubMedGoogle Scholar
8. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Zakwaszony test lizy glicerolu: test przesiewowy dla sferocytozy. Br J Haematol. 1980; 45(3):481-6. PubMedGoogle Scholar
9. Vettore L, Zanella A, Molaro GL, De Matteis MC, Pavesi M, Mariani M. A new test for the laboratory diagnosis of spherocytosis. Acta Haematol. 1984; 72(4):258-63. PubMedGoogle Scholar
10. Cynober T, Mohandas N, Tchernia G. Nieprawidłowości krwinek czerwonych w dziedzicznej sferocytozie: znaczenie dla diagnozy i zrozumienia zmiennej ekspresji klinicznej ciężkości. J Lab Clin Med. 1996; 128(3):259-69. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-2143(96)90027-XGoogle Scholar
11. Perrotta S, Gallagher PG, Mohandas N. Dziedziczna sferocytoza. Lancet. 2008; 372(9647):1411-26. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61588-3Google Scholar
12. Crisp RL, Solari L, Vota D, García E, Miguez G, Chamorro ME. Badanie prospektywne w celu oceny wartości predykcyjnej dla dziedzicznej sferocytozy przy użyciu pięciu testów laboratoryjnych (test kriohemolizy, cytometria przepływowa eozyny-5′-maleimidu, test kruchości osmotycznej, test autohemolizy i SDS-PAGE) na 50 rodzinach dziedzicznej sferocytozy w Argentynie. Ann Hematol. 2011; 90(6):625-34. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s00277-010-1112-0Google Scholar
13. Korones D, Pearson HA. Normalna kruchość osmotyczna erytrocytów w dziedzicznej sferocytozie. J Pediatr. 1989; 114(2):264-6. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-3476(89)80794-2Google Scholar
14. Apel D, Maria ska B, Maj S. Wartość diagnostyczna zakwaszonego testu lizy glicerolu (AGLT) w dziedzicznej sferocytozie i wybranych chorobach hematologicznych. Acta Haematol Pol. 1993; 24(3):267-71. PubMedGoogle Scholar
15. Brabec V, Marík T, Feixová H, Slavíková V. New tests for laboratory diagnosis of spherocytosis. Vnitr Lek. 1991; 37(11-12):883-7. PubMedGoogle Scholar
16. Iglauer A, Reinhardt D, Schröter W, Pekrun A. Test kriohemolizy jako narzędzie diagnostyczne w dziedzicznej sferocytozie. Ann Hematol. 1999; 78(12):555-7. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s002770050557Google Scholar
17. Streichman S, Gescheidt Y. Cryohemolysis for the detection of hereditary spherocytosis: correlation studies with osmotic fragility and autohemolysis. Am J Hematol. 1998; 58(3):206-12. PubMedhttps://doi.org/10.1002/(SICI)1096-8652(199807)58:3<206::AID-AJH8>3.0.CO;2-VGoogle Scholar
18. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K. Szybki test cytometryczny przepływu do diagnozowania niedokrwistości hemolitycznej związanej z cytoszkieletem błonowym. Br J Haematol. 2000; 111(3):924-33. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02416.xGoogle Scholar
19. Bolton-Maggs PH, Stevens RF, Dodd NJ, Lamont G, Tittensor P, King MJ, Wytyczne dotyczące diagnostyki i zarządzania dziedziczną sferocytozą. Br J Haematol. 2004; 126(4):455-74. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05052.xGoogle Scholar
20. King MJ, Telfer P, MacKinnon H, Langabeer L, McMahon C, Darbyshire P, Dhermy D. Using the eosin-5-maleimide binding test in the differential diagnosis of hereditary spherocytosis and hereditary pyropoikilocytosis. Cytometry B Clin Cytom. 2008; 74(4):244-50. PubMedGoogle Scholar
21. King MJ, Bruce L, Whiteway A. Zmutowane białko pasma 3 erytrocytów w południowo-wschodniej azjatyckiej owalocytozie nie wiąże eozyny-5-maleimidu. Int J Lab Hematol. 2009; 31(1):116-7. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2007.01019.xGoogle Scholar
22. King MJ, Jepson MA, Guest A, Mushens R. Wykrywanie dziedzicznej piropoikilocytozy przez test wiązania eozyny-5-maleimidu (EMA) jest przypisywane znacznemu zmniejszeniu liczby białek transmembranowych reagujących na EMA. Int J Lab Hematol. 2011; 33:205-211. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2010.01270.xGoogle Scholar
23. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, Ghosh K, Mohanty D. Doświadczenie z eozyną-5′-maleimidem jako narzędziem diagnostycznym dla zaburzeń cytoszkieletu błony komórkowej czerwonych krwinek. Clin Lab Haematol. 2003; 25(6):373-6. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.0141-9854.2003.00557.xGoogle Scholar
24. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, Baumann E, Linss W. Cytometria przepływowa jako narzędzie diagnostyczne dla dziedzicznej sferocytozy. Acta Haematol. 2006; 116(3):186-91. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000094679Google Scholar
25. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, Largier M, Delaunay J, Fénéant-Thibault M. Usefulness of the eosin-5′-maleimide cytometric method as a first-line screening test for the diagnosis of hereditary spherocytosis: comparison with ektacytometry and protein electrophoresis. Br J Haematol. 2008; 140(4):468-70. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06944.xGoogle Scholar
26. Kar R, Mishra P, Pati HP. Ocena testu cytometrycznego przepływu eozyny-5-maleimidu w diagnostyce dziedzicznej sferocytozy. Int J Lab Hematol. 2010; 32(1 Pt 2):8-16. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2008.01098.xGoogle Scholar
27. Riley CH, Nikolajsen K, Kjaersgaard E, Klausen TW, Mourits-Andersen T, Clausen N, Lausen B, Rosthøj S, Birgens H. Diagnostyka cytometryczna przepływu w dziedzicznej sferocytozie. Ugeskr Laeger. 2009; 171(49):3610-4. PubMedGoogle Scholar
28. D’Alcamo E, Agrigento V, Sclafani S, Vitrano A, Cuccia L, Maggio A. Wiarygodność testu wiązania EMA w diagnostyce dziedzicznej sferocytozy u włoskich pacjentów. Acta Haematol. 2011; 125(3):136-40. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000322253Google Scholar
29. Tachavanich K, Tanphaichitr VS, Utto W, Viprakasit V. Szybki test cytometryczny przepływu przy użyciu eozyny-5-maleimidu do diagnozowania zaburzeń błony komórkowej krwinek czerwonych. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009; 40(3):570-5. PubMedGoogle Scholar
30. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eozyna-5-maleimid wiążący się z pasmem 3 i białkami związanymi z Rh stanowi podstawę testu przesiewowego dla dziedzicznej sferocytozy. Br J Haematol. 2004; 124(1):106-13. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2003.04730.xGoogle Scholar
31. Barcellini W, Clerici G, Montesano R, Taioli E, Morelati F, Rebulla P, Zanella A. Kwantyfikacja in vitro produkcji przeciwciał przeciwko czerwonym krwinkom w idiopatycznej autoimmunologicznej anemii hemolitycznej: wpływ stymulacji mitogenami i cytokinami. Br J Haematol. 2000; 111(2):452-60. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02380.xGoogle Scholar
32. Dacie JV, Lewis SM. Praktyczna hematologia. Churchill Livingston: Londyn; 2001. Google Scholar
33. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan Dj. Przygotowanie i charakterystyka chemiczna pozbawionych hemoglobiny duchów ludzkich erytrocytów. Arch Biochem Biophys. 1963; 100:119-30. PubMedhttps://doi.org/10.1016/0003-9861(63)90042-0Google Scholar
34. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DF. Analiza elektroforetyczna głównych polipeptydów błony ludzkiego erytrocytu. Biochemistry. 1971; 10(13):2606-17. PubMedhttps://doi.org/10.1021/bi00789a030Google Scholar
35. Laemmli UK. Rozszczepienie białek strukturalnych podczas montażu głowy bakteriofaga T4. Nature. 1970; 227(5259):680-5. PubMedhttps://doi.org/10.1038/227680a0Google Scholar
36. Beutler E. Metabolizm krwinek czerwonych: podręcznik metod biochemicznych. Grune &amp; Stratton Inc: New York, NY; 1984. Google Scholar
37. Iolascon A, Avvisati RA. Korelacja genotypu / fenotypu w dziedzicznej sferocytozie. Haematologica. 2008; 93(9):1283-8. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.13344Google Scholar
38. Romero RR, Poo JL, Robles JA, Uriostegui A, Vargas F, Majluf-Cruz A. Przydatność testu kriohemolizy w diagnostyce dziedzicznej sferocytozy. Arch Med Res. 1997; 28(2):247-51. PubMedGoogle Scholar
39. Golan DE, Corbett JD, Korsgren C, Thatte HS, Hayette S, Yawata Y, Cohen CM. Control of band 3 lateral and rotational mobility by band 4.2 in intact erythrocytes: release of band 3 oligomers from low-affinity binding sites. Biophys J. 1996; 70(3):1534-42. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79717-5Google Scholar
40. Godal HC, Gjønnes G, Ruyter R. Czy preinkubacja krwinek czerwonych przyczynia się do zdolności testu kruchości osmotycznej do wykrywania bardzo łagodnych form dziedzicznej sferocytozy? Scand J Haematol. 1982; 29(1):89-93. PubMedGoogle Scholar
41. Hematologia praktyczna. Churchill Livingstone; 1991. Google Scholar
42. Iolascon A, Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Alloisio N, Morlé L, Delaunay J. Dziedziczna sferocytoza: od defektów klinicznych do molekularnych. Haematologica. 1998; 83(3):240-57. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000015191Google Scholar
43. Mittler U, Radig K, Kluba U, Aumann V, Röppnack R. Doświadczenie z testem lizy glicerolu w kwaśnym podłożu w diagnostyce dziedzicznej sferocytozy. Kinderarztl Prax. 1993; 61(6):219-22. PubMedGoogle Scholar
44. Hoffmann JJ, Swaak-Lammers N, Breed WP, Strengers JL. Diagnostic utility of the pre-incubated acidified glycerol lysis test in heemolytic and non-haemolytic anaemias. Eur J Haematol. 1991; 47(5):367-70. PubMedGoogle Scholar
45. Bucx MJ, Breed WP, Hoffmann JJ. Comparison of acidified glycerol lysis test, Pink test and osmotic fragility test in hereditary spherocytosis: effect of incubation. Eur J Haematol. 1988; 40(3):227-31. PubMedGoogle Scholar
46. Rutherford CJ, Postlewaight BF, Hallowes M. An evaluation of the acidified glycerol lysis test. Br J Haematol. 1986; 63(1):119-21. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1986.tb07501.xGoogle Scholar
47. Mariani M, Vercellati C, Bianchi P, Marzorati S, Caneva L, Soligo C. Wrodzona niedokrwistość dyserytropoetyczna typu II (CDA II) naśladująca dziedziczną sferocytozę (HS): raport z 12 przypadków wykrytych przez SDSPAGE. Hematol J. 2002; 3:353. Google Scholar

.