ORIGINAL PAPERS
Description of a widespread outbreak of aseptic meningitis due to echovirus 30 in Rio de Janeiro state, Brazil
Vitor Laerte Pinto JuniorI; Maria Cristina RebeloII; Eliane Veiga da CostaIII; Edson Elias da SilvaIII; Márcio Neves BóiaIV
IDiretoria Regional de Brasília, Fiocruz, Brasília, DF
IILaboratório de Referência Estadual para Meningites, Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião, Rio de Janeiro, RJ
IIILaboratório de Enterovirus, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ
IVPós-graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ; Brazylia
Adres do korespondencji
ABSTRACT
Echowirus 30 należy do rodzaju Enterovirus i jest szeroko związany z ogniskami aseptycznego zapalenia opon mózgowych (AM). W Brazylii epidemie spowodowane tym serotypem zostały zgłoszone w kilku stanach, ale w Rio de Janeiro, przed przeprowadzeniem tego badania, był on zaangażowany tylko w sporadyczne epizody. Zebraliśmy retrospektywnie dane z kart zgłoszeń AM i bazy danych izolacji enterowirusów z Departamentu Zdrowia Stanu Rio de Janeiro (RJSHD) i Laboratorium Referencyjnego Enterowirusów w 2005 roku. Ognisko AM zostało wykryte w marcu, kwietniu i maju, co wiązało się z wysokim wskaźnikiem izolacji w hodowlach komórkowych echowirusa 30 (17,4%). Bardziej dotknięte były dzieci płci męskiej w wieku od 1 do 9 lat. Spośród 22 pacjentów z potwierdzoną chorobą wywołaną echowirusem 30, informacje kliniczne były dostępne u ośmiu; gorączka, ból głowy i wymioty były najczęstszymi objawami. Analiza płynu mózgowo-rdzeniowego wykazała typowy wzorzec infekcji wirusowej z medianą komórkowości 100 komórek/mm3 i przewagą komórek jednojądrzastych w 64,7% przypadków. Mediana stężenia białka i glukozy wynosiła 49 mg/dl i 56,5 mg/dl. Wskaźnik śmiertelności był zerowy. Pomimo łagodnego przebiegu i braku możliwości leczenia, nadzór nad aseptycznym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych ma kluczowe znaczenie dla wczesnej identyfikacji czynników sprawczych ognisk choroby, co pozwala uniknąć dodatkowych badań i niewłaściwego stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych.
Słowa kluczowe: Aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, enterowirusy, echowirusy, płyn mózgowo-rdzeniowy.
Aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (AM) jest zespołem chorobowym charakteryzującym się ostrym początkiem gorączki i meningizmem wraz z analizą płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), w którym zwykle stwierdza się przewagę komórek jednojądrowych i ujemny wynik badania bakteriologicznego. Obecnie, przy powszechnym stosowaniu szczepionek wirusowych (głównie przeciwko polio, śwince i odrze), enterowirusy non-polio stały się główną przyczyną zakaźnych AM, będąc odpowiedzialnymi zarówno za przypadki sporadyczne, jak i epidemiczne. Diagnostyka enterowirusów non-polio w Brazylii jest ograniczona do ośrodków badawczych, w których próbki kliniczne są badane dla celów nadzoru epidemiologicznego tylko poprzez hodowlę wirusów lub PCR.
Echowirus 30 należy do rodzaju Enterovirus i jest związany głównie z przypadkami AM o charakterze epidemicznym. Ten serotyp zwiększa swoją częstość występowania i w ostatnich latach jest jednym z najczęściej wykrywanych enterowirusów. W Brazylii został już zgłoszony jako czynnik sprawczy ognisk AM w kilku stanach (Rio Grande do Sul, Parana, São Paulo, Pernambuco i Pará), dotykając częściej starsze dzieci i dorosłych, przy niskim współczynniku śmiertelności przypadków. Materiał i metody Przedmioty W tym retrospektywnym badaniu dane epidemiologiczne i demograficzne 573 zgłoszonych przypadków AM w 2005 roku zostały przejrzane i przeanalizowane z bazy danych komitetu doradczego ds. Zapalenia opon mózgowych Departamentu Zdrowia Stanu Rio de Janeiro (RJSHD). AM rozpatrywano we wszystkich przypadkach spełniających następujące kryteria: pacjenci w każdym wieku z objawami ostrego zapalenia opon mózgowych (gorączka, ból głowy, wymioty, sztywność karku i drażliwość lub senność) wraz z profilem płynu mózgowo-rdzeniowego wykazującym liczbę białych krwinek > 10 komórek/mm3 i ujemnym wynikiem badania bakteriologicznego. Analiza CSF próbek klinicznych Wszyscy pacjenci przeszli nakłucie lędźwiowe w celu oceny zapalenia opon mózgowych; żaden pacjent nie został poddany tej procedurze tylko w celu zebrania próbek do badania. Płyn mózgowo-rdzeniowy był analizowany pod kątem zawartości komórek, poziomu białka i glukozy oraz testów bakteriologicznych przy użyciu rutynowych metod laboratoryjnych. Izolacja i identyfikacja wirusa Wszystkie próbki (CSF i ekstrakty kału od pacjentów badających AM) zostały zaszczepione w objętości 0,2 mL na hodowle komórkowe w celu izolacji wirusa. Ciągłe linie komórkowe RD (human rhabdomyosarcoma) i HEp2 (human laryngeal carcinoma) zostały wybrane ze względu na ich zdolność do wspierania replikacji większości serotypów Enterowirusów. Probówki utrzymywano w temperaturze 36ºC przez siedem dni, poddawano ślepemu pasażowi i utrzymywano w temperaturze 36ºC przez kolejne siedem dni. Hodowle komórkowe wykazujące efekt cytopatyczny (CPE) były przechowywane w temperaturze -20ºC do czasu dalszej identyfikacji. Reakcje sekwencjonowania cyklicznego przeprowadzono przy użyciu ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied-Biosystems) w termocyklerze GeneAmp®, z cyklami 1” w 95ºC, 3” w 42ºC i 3” w 60ºC. Produkty sekwencji uzyskane przy użyciu obu starterów (222 i 292) w poszczególnych reakcjach, oczyszczano przez precypitację alkoholem izopropylowym i analizowano przy użyciu analizatora genetycznego ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Serotypy enterowirusów otrzymano porównując sekwencje z tymi znajdującymi się w GenBank przy użyciu programu Blast . Konstrukcja diagramu endemicznego i analiza statystyczna Wszystkie dane z kart pacjentów oraz z RJSHD zostały wprowadzone i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS, wersja 13.0 dla windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Zastosowano narzędzia statystyki opisowej (średnia, mediana i odchylenie standardowe). Roczna zapadalność na aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych została oceniona przy użyciu jako mianownika danych populacyjnych zaczerpniętych z szacunków Brazylijskiego Instytutu Geografii i Statystyki (IBGE) z 2007 roku. Do budowy schematu endemicznego AM w Rio de Janeiro przeanalizowano zgłoszone przypadki AM w latach 2000-2004. Uzyskano średnią i odchylenie standardowe rozkładu częstości przypadków dla każdego miesiąca w roku, a następnie dodano do każdej średniej miesięcznej jej SD pomnożone przez 1,96 (z rozkładu normalnego o czułości 95%) w celu skonstruowania górnej granicy diagramu, która stanowiła próg epidemii. Etyka Badanie to było projektowane zgodnie z brazylijskim prawem dotyczącym badań z udziałem ludzi i zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Instytutu Badań Klinicznych Evandro Chagas, FIOCRUZ, Rio de Janeiro. Wyniki Dane demograficzne i epidemiologiczne W 2005 roku w stanie Rio de Janeiro zgłoszono 573 przypadki aseptycznego zapalenia opon mózgowych; zapadalność wynosiła 3,71 przypadków/100 000 mieszkańców. Dane dotyczące rozkładu wieku i płci przedstawiono w tabeli 1. Większość przypadków wystąpiła u dzieci w wieku od jednego do dziewięciu lat; w tej grupie wiekowej mężczyźni stanowili 60,7% przypadków, a kobiety 39,3%. Powyżej tej grupy wiekowej nie obserwowano przewagi płci. Przypadki AM występowały przez cały badany okres, koncentrując się na regionie metropolitalnym Rio de Janeiro. Rozkład częstości występowania przypadków AM wskazuje na okres epidemiczny pomiędzy miesiącami marzec i maj (ryc. 1). Początkowy okres epidemii rozpoczął się w marcu z 99 przypadkami (oczekiwano 36 przypadków), wzrost nastąpił w kwietniu z 122 przypadkami (oczekiwano 38), a zakończenie w maju z 58 przypadkami (oczekiwano 39). W Brazylii okres ten odpowiada końcowi lata i początkowi jesieni. Izolacja i identyfikacja enterowirusów W roku 2005, 171 próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i kału z przypadków AM było analizowanych w kierunku enterowirusów, liczba próbek wysłanych do izolacji wirusa wahała się w tym okresie od żadnej do 85 miesięcznie; z 48 (28.Z 48 (28. 0% wszystkich przesłanych próbek) wyizolowanych enterowirusów innych niż polio, echowirus 30 został zidentyfikowany w 17 CSF i 5 kałach (45,8% próbek dodatnich). Identyfikacja tego czynnika wystąpiła wyłącznie w okresie epidemicznym, a średni wskaźnik izolacji wynosił 17,4% (22/ 126). Niesekwencjonowany enterowirus non-polio został wykryty poza okresem epidemii w pozostałych 26 (54,2%) próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 2). Aspekty kliniczne Wśród 22 pacjentów z potwierdzoną chorobą wywołaną przez echowirus 30, dane kliniczne były dostępne u ośmiu, a wyniki analizy płynu mózgowo-rdzeniowego były we wszystkich siedemnastu próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego. Wśród pacjentów przeważali mężczyźni (54,5%), a ich wiek wahał się od 2 do 36 lat (mediana 4,5 roku). Najczęstszymi objawami były: ból głowy, 100,0% (8/8); gorączka, 87,5% (7/8); wymioty, 62,5% (5/8); i sztywność karku, 52,5% (5/8). Analiza płynu mózgowo-rdzeniowego wykazała pleocytozę z medianą 100 leukocytów/mm3 (32 do 325 leukocytów/mm3) z przewagą komórek jednojądrzastych w 64,7% (11/17). Poziom białka był nieznacznie podwyższony z medianą 49 mg/dl (28 do 84 mg/dl) i medianą poziomu glukozy 56,5 mg/dl (43 do 92 mg/dl). Współczynnik śmiertelności był zerowy. Dyskusja Nasze badanie przedstawia pierwsze ognisko związane z echowirusem 30 w stanie Rio de Janeiro, które wystąpiło w roku 2005, ukazując jego aspekty kliniczne, laboratoryjne i epidemiologiczne. Ognisko to rozpoczęło się w marcu z progresją do końca kwietnia i powrotem do poziomu endemicznego w czerwcu. W naszym badaniu, rozkład płci i wieku przypadków AM wykazał podobny wzór opisany w innych badaniach dotyczących chorób ośrodkowego układu nerwowego wywołanych przez enterowirusy, z przewagą mężczyzn i dotykających dzieci w wieku od 1 do 9 lat. Przyczyna przewagi mężczyzn nie jest znana, ale istnieje hipoteza, że ta płeć ma większy stopień narażenia na czynniki ryzyka związane z transmisją. AM przypadki w obszarach klimatu umiarkowanego są zgłaszane do mają rozkład sezonowy ze szczytem zachorowań w lecie, prawdopodobnie związane z okresem wakacji szkolnych i działalności rekreacyjnej . W obszarach tropikalnych i subtropikalnych przypadki AM mają równomierny rozkład w ciągu roku, jak pokazano na diagramie endemicznym skonstruowanym w naszym badaniu. W poprzednim badaniu dos Santos i wsp. wykazali podobny wzór, ale istniała tendencja do występowania przypadków w okresach wyższych temperatur. Echowirus 30 ma epidemiczny wzór występowania, a AM jest jego najczęściej zgłaszanym zespołem. Ten serotyp był odpowiedzialny, w poprzednich latach, za ogniska AM w kilku brazylijskich stanach (Parana, Rio Grande do Sul, Pernambuco e Pará), zawsze z łagodnym przebiegiem klinicznym i wynikiem. W innych regionach świata echowirus 30 jest już najczęściej izolowanym serotypem z płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów z AM, a dane z nadzoru ze Stanów Zjednoczonych wskazują, że echowirus 30 powodował duże ogniska, przeplatane okresami spokoju. Badania epidemiologii molekularnej przeprowadzone podczas ognisk wykazały pięć różnych genotypów echowirusa 30, co jest proponowanym wyjaśnieniem tego zachowania epidemiologicznego. W stanie Rio de Janeiro krążenie echowirusa 30 w związku ze sporadycznymi przypadkami AM zostało zgłoszone od 2001 roku. W 2005 roku pomiędzy miesiącami marzec i maj zaobserwowano wzrost liczby zgłoszonych przypadków AM powyżej poziomu epidemii dla tego okresu. Jednocześnie echowirus 30 został wyizolowany z próbek klinicznych przesłanych do Laboratorium Enterowirusowego w proporcji znacznie przekraczającej (17,4%) proporcję uznawaną za normalną dla sporadycznych przypadków, która wynosi mniej niż 10%. Ten wysoki wskaźnik izolacji był podobny do opisanego w ognisku związanym z echowirusem 30 na Tajwanie w 2001 roku. Fakty te potwierdzają wystąpienie ogniska wywołanego przez echowirusa 30 po raz pierwszy w tym państwie. Dane obserwacyjne przedstawione w tej pracy reprezentują wszystkie zgłoszone przypadki, w tym te prawdopodobnie nie wywołane przez enterowirusy, ponieważ inne czynniki sprawcze nie są rzadkością w naszym kraju, takie jak Leptospira sp., wirus dengi, Bartonella sp. i wirus Herpes simplex . Dane epidemiologiczne dotyczące czynników etiologicznych odpowiedzialnych za AM w Rio de Janeiro są w dużej mierze nieznane, więc rzeczywiste rozszerzenie udziału enterowirusów w przypadkach AM w naszym otoczeniu jest nierozwiązaną kwestią. Innym ważnym aspektem, którego nie byliśmy w stanie opisać w tym ognisku, był sposób przenoszenia choroby; enterowirusy są nabywane w większości przypadków przez skażenie kałowo-oralne, które może być związane z kontaktem ze wspólnym źródłem, takim jak żywność i woda, lub przez kontakt między osobami. Oba mechanizmy mogły być odpowiedzialne za rozprzestrzenianie się przypadków w naszym badaniu, jednak ograniczenia metodologiczne narzucone przez retrospektywny projekt nie pozwoliły na taką analizę. Echowirus 30 jest związany z ogniskami aseptycznego zapalenia opon mózgowych z łagodnym wynikiem; oczekuje się wzrostu częstości tego serotypu w Brazylii, objawiającego się dużymi ogniskami AM między okresami spokoju. Intensyfikacja i poprawa nadzoru nad AM ma kluczowe znaczenie dla wczesnej identyfikacji czynników sprawczych ognisk, co pozwala uniknąć dodatkowych badań i niepotrzebnego stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych. Konieczne są dalsze badania w celu ustalenia innych czynników sprawczych AM w Brazylii i wyjaśnienia mechanizmów ich przenoszenia. Podziękowania Do Marii de Fátimy Calderaro z RJSDH za dostarczenie danych z nadzoru epidemiologicznego. 1. Connolly KJ, Hammer SM. The acute aseptic meningitis syndrome. Infect Dis Clin North Am 1990;4(4):599-622. 2. Lee BE, Davies HD. Aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Curr Opin Infect Dis 2007;20(3):272-7. 3. Khetsuriani N, Lamonte-Fowlkes A, Oberst S, Pallansch MA. Enterovirus surveillance-United States, 1970-2005. MMWR Surveill Summ 2006;55(8):1-20. 4. Dos Santos GP, Skraba I, Oliveira D, Lima AA, de Melo MM, Kmetzsch CI, et al. Enterovirus meningitis in Brazil, 1998-2003. J Med Virol 2006;78(1):98-104. 5. Gomes Mde L, Ferreira LL, Gomes RH, Lamarao LM, da Silveira E, Rodrigues Lda S, et al. RT-PCR for confirmation of echovirus 30 isolated in Belem, Brazil. Braz J Infect Dis 2007;11(4):403-6. 6. Brasil, Ministério da Saúde. Meningites. In: Guia de vigilância epidemiológica. Brasília; 2005. s. 541-569. 7. Dagan R, Jenista JA, Prather SL, Powell KR, Menegus MA. Viremia in hospitalized children with enterovirus infections. J Pediatr 1985;106(3):397-401. 8. Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Flemister MR, Brown BA, Pallansch MA. Typing of human enteroviruses by partial sequencing of VP1. J Clin Microbiol 1999;37(5):1288-93. 9. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990;215(3):403-10. 10. Berlin LE, Rorabaugh ML, Heldrich F, Roberts K, Doran T, Modlin JF. Aseptic meningitis in infants < 2 years of age: diagnosis and etiology. J Infect Dis 1993;168(4):888-92. 11. Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH, Figueiredo LT. Viral infections of the central nervous system in Brazil. J Infect 2007;54(6):589-96. 12. Nery-Guimaraes R, Bittencourt LC, Pastor MV. . Rev Saude Publica 1981;15(4):379-94. 13. Rotbart HA. Wirusowe zapalenie opon mózgowych. Semin Neurol 2000;20(3):277-92. 14. Center for Disease Control and Prevention. Outbreaks of aseptic meningitis associated with echoviruses 9 and 30 and preliminary surveillance reports on enterovirus activity-United States, 2003. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2003;52(32):761-4. 15. Center for Disease Control and Prevention. Enterovirus surveillance-United States, 1997-1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000;49(40):913-6. 16. Antona D, Leveque N, Chomel JJ, Dubrou S, Levy-Bruhl D, Lina B. Surveillance of enteroviruses in France, 2000-2004. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007;26(6):403-412. 17. Oberste MS, Maher K, Kennett ML, Campbell JJ, Carpenter MS, Schnurr D, et al. Molecular epidemiology and genetic diversity of echovirus type 30 (E30): genotypes correlate with temporal dynamics of E30 isolation. J Clin Microbiol 1999;37(12):3928-33. 18. Wang JR, Tsai HP, Huang SW, Kuo PH, Kiang D, Liu CC. Laboratory diagnosis and genetic analysis of an echovirus 30-associated outbreak of aseptic meningitis in Taiwan in 2001. J Clin Microbiol 2002;40(12):4439-44. 19. Silva HR, Tavares-Neto J, Bina JC, Meyer R. . Rev Soc Bras Med Trop 2003;36(2):227-33. 20. Rotbart HA. Enteroviral infections of the central nervous system. Clin Infect Dis 1995;20(4):971-81. 
