Pirosekwencjonowanie jest metodą sekwencjonowania DNA (określania kolejności nukleotydów w DNA) opartą na zasadzie „sekwencjonowania przez syntezę”, w której sekwencjonowanie odbywa się poprzez wykrywanie nukleotydu włączonego przez polimerazę DNA. Pirosekwencjonowanie opiera się na detekcji światła w oparciu o reakcję łańcuchową, gdy uwalniany jest pirofosforan. Stąd nazwa pirosekwencjonowanie.
Zasada pirosekwencjonowania została po raz pierwszy opisana w 1993 r. przez Bertila Petterssona, Mathiasa Uhlena i Påla Nyrena poprzez połączenie metody sekwencjonowania w fazie stałej przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną z rekombinowaną polimerazą DNA pozbawioną aktywności 3´do 5´eksonukleazy (proof-reading) i wykrywania luminescencji przy użyciu enzymu lucyferazy Firefly’a. Mieszanina trzech enzymów (polimeraza DNA, sulfurylaza ATP i lucyferaza firefly’a) oraz nukleotyd (dNTP) są dodawane do jednoniciowego DNA, które ma być sekwencjonowane, a wbudowywanie nukleotydu jest śledzone przez pomiar emitowanego światła. Intensywność światła określa, czy 0, 1 lub więcej nukleotydów zostało włączonych, pokazując w ten sposób, ile komplementarnych nukleotydów jest obecnych na nici szablonu. Mieszanina nukleotydów jest usuwana przed dodaniem następnej mieszaniny nukleotydów. Proces ten powtarza się z każdym z czterech nukleotydów, aż do ustalenia sekwencji DNA jednoniciowego szablonu.
Druga metoda pirosekwencjonowania oparta na roztworze została opisana w 1998 roku przez Mostafę Ronaghi, Mathiasa Uhlena i Påla Nyrena. W tej alternatywnej metodzie, dodatkowy enzym apyrase jest wprowadzony w celu usunięcia nukleotydów, które nie są włączone przez polimerazę DNA. Dzięki temu mieszanina enzymów zawierająca polimerazę DNA, lucyferazę i apyrazę może być dodawana na początku i utrzymywana przez cały czas trwania procedury, co zapewnia prostą konfigurację nadającą się do automatyzacji. Zautomatyzowane urządzenie oparte na tej zasadzie zostało wprowadzone na rynek w następnym roku przez firmę Pyrosequencing.
Trzeci mikroprzepływowy wariant metody Pyrosequencing został opisany w 2005 roku przez Jonathana Rothberga i współpracowników z firmy 454 Life Sciences. To alternatywne podejście do Pyrosekwencjonowania było oparte na oryginalnej zasadzie dołączania DNA, które ma być sekwencjonowane do stałego nośnika i wykazali oni, że sekwencjonowanie może być wykonywane w sposób wysoce równoległy przy użyciu mikrofabrykowanej mikromacierzy. Pozwoliło to na sekwencjonowanie DNA o wysokiej wydajności, a na rynek wprowadzono zautomatyzowane urządzenie. Stał się on pierwszym instrumentem do sekwencjonowania następnej generacji, rozpoczynając nową erę w badaniach genomicznych, przy szybko spadających cenach sekwencjonowania DNA, umożliwiając sekwencjonowanie całego genomu po przystępnych cenach.