Nowe techniki izolacji mikroorganizmów z naciskiem na druk laserowy | CDhistory

Nowe metody izolacji

Współcześnie stosuje się wiele różnych metod w celu wyeksponowania nowych, wcześniej nieuprawianych mikroorganizmów. W szczególności, stosowane są nowe pożywki zawierające specyficzne substancje; hodowla prowadzona jest w różnych warunkach fizycznych i chemicznych środowiska, takich jak skład atmosfery, temperatura i pH. Ponadto, badano zastosowanie rozcieńczonych pożywek w połączeniu z długimi okresami inkubacji, jak również wspólną hodowlę mikroorganizmów różnych gatunków. W ostatnich latach opracowano kilka zasadniczo nowych metod hodowli opartych na umieszczaniu mikroorganizmów w środowisku naturalnym bez stosowania pożywek. Metody takie wykorzystują komory dyfuzyjne i powłoki polimerowe, w których umieszczane są komórki mikroorganizmów. W tym przypadku mikroorganizmy otrzymują wszystkie niezbędne składniki odżywcze z naturalnego środowiska, pozostając od niego odizolowane. Wydzielenie przy użyciu takich metod nowego producenta antybiotyku (teiksobaktyny) uważane jest za ważne osiągnięcie. Inne podejście obejmuje jednoczesną hodowlę i badania przesiewowe dziesiątek i setek tysięcy mikrokolonii bakteryjnych na porowatych polimerowych lub ceramicznych chipach izolacyjnych. Do hodowli mikroorganizmów „niekulturowych” można również wykorzystać metody pozwalające na izolację pojedynczych komórek ze środowisk naturalnych. Wśród tych metod najpopularniejsze są metody oparte na rozcieńczaniu zawiesiny mikroorganizmów, cytometrii przepływowej i sortowaniu komórek, mikrodysekcji laserowej, kompartmentalizacji oraz zastosowaniu mikromanipulatorów. Oprócz hodowli wcześniej nieuprawianych gatunków mikroorganizmów, izolacja pojedynczych komórek drobnoustrojów jest niezbędna do badania fizjologii komórek, interakcji między komórkami, a także do poszukiwania nowych metabolitów, takich jak antybiotyki i enzymy.

Współczesny postęp naukowy i technologiczny stwarza wiele możliwości w zakresie rozwoju nowych metod hodowli, izolacji, manipulacji i badania pojedynczych komórek bakteryjnych oraz ich konsorcjów. Nowe podejścia mogą znacznie przyspieszyć proces pracy z mikroorganizmami i umożliwić prowadzenie ich pełniejszych i bardziej kompleksowych badań. Należy zauważyć, że do tej pory niewiele metod zostało zaproponowanych do pozycjonowania matryc bakteryjnych z mikrometrową dokładnością. W pracy Akselrod i wsp. trójwymiarowe (3D) sieci żywych komórek w hydrożelu były formowane bez utraty ich żywotności za pomocą matryc multipleksowanych holograficznych pułapek optycznych (pęset) z niespotykaną dotąd dokładnością (<400 nm). Do formowania pułapek optycznych użyto dwóch laserów: laser Ar+ (20 W, długość fali 514 nm) oraz laser o fali ciągłej Ti: Sapphire, przestrajany w zakresie λ = 850-900 nm, a także kombinację dwóch elementów dyfrakcyjnych, połączonych z różnymi soczewkami w odwróconym mikroskopie optycznym. Utworzono sieci fibroblastów 3T3 otoczonych pierścieniem bakterii. Zademonstrowano również możliwość manipulowania setkami bakterii Pseudomonas aeruginosa jednocześnie w matrycach dwuwymiarowych (2D) i trójwymiarowych (3D). Metoda holograficznego pułapkowania optycznego jest bardzo dokładna, ale trudna technicznie do wykonania.

W pracy Rowan i wsp. zaproponowano metodę heterogenicznej funkcjonalizacji powierzchni, która jest czteroetapowym procesem litograficznym opartym na mikronadruku monowarstw organicznych, implantacji hiperrozgałęzionego polimeru i jego dalszej funkcjonalizacji. W rezultacie otrzymuje się struktury, na których przeprowadza się ukierunkowaną inokulację komórek bakteryjnych. Badania przeżywalności komórek wykazały, że pozostają one żywotne na otrzymanych powierzchniach strukturalnych. Uzyskano duże izolaty bakterii zawierające 18 ± 5 bakterii oraz małe izolaty zawierające 2 ± 1 bakterie. Jak wynika z niniejszej pracy, zademonstrowana metoda może być wykorzystana do badań przesiewowych o wysokiej wydajności oraz do biosensingu. Trudno jest jednak połączyć heterogeniczną funkcjonalizację powierzchni tą metodą z rutynowymi badaniami biologicznymi i warunkami hodowli mikroorganizmów (temperatura, pH, składniki odżywcze itp.). Należy zaznaczyć, że zadanie znalezienia prostych sposobów zapewnienia wysokiej rozdzielczości matryc żywych bakterii z możliwością prowadzenia różnorodnych badań biologicznych zostało rozwiązane w niektórych publikacjach. Zaproponowane w tych pracach podejścia są w istocie zwiastunami druku 3D.

W pracy Weibela i wsp. zaproponowano technikę stemplowania żywych bakterii na płytkach agarozowych. Drukowano tablice bakterii (wielkość pojedynczej plamki z bakteriami >200 µm) na obszarze do 50 cm2. Stemple z polidimetylosiloksanu (PDMS) wytwarzano techniką fotolitograficzną. Uzyskano minimalną wielkość wypukłości nadruku 190 µm przy wysokości 140 µm, co jednak jest dalekie od wielkości wymaganej do separacji bakterii. Metoda ta jest szybka, powtarzalna i wygodna i może być stosowana do kontroli wzoru, odstępów i orientacji pomiędzy koloniami różnych bakterii. W badaniach Xu i wsp. tablice żywych bakterii o rozdzielczości komórkowej zostały wydrukowane na podłożu agarozowym przy użyciu elastomerowych (PDMS) stempli o wysokim współczynniku kształtu, uzyskanych metodą odwróconej litografii in situ (RISL). Rysunek 1 przedstawia zalety metody RISL w porównaniu ze standardową fotolitografią ultrafioletową. Jedynym ograniczeniem technologii RISL jest średnica protruzji, która może wynosić zaledwie <1 µm ze względu na granicę dyfrakcji optycznej.

Metoda mikrokontaktowego drukowania matryc bakteryjnych działa w następujący sposób: Kroplę bakterii Escherichia coli w podłożu hodowlanym LB osadza się na żelu agarozowym (3 % wag. w LB) i na podłożu agarozowym tworzy się monowarstwę bakterii (płyn jest absorbowany przez żel agarozowy). Następnie, stempel PDMS styka się z monowarstwą bakterii pokrywającą żel agarozowy. Stempel jest usuwany, a część bakterii pozostaje na nim. Następnie, po zetknięciu stempla z warstwą żelu agarozowego (4 wt% w LB, grubość 200 µm), bakterie przenoszone są do warstwy agarozy. W ten sposób w ciągu kilku sekund można nadrukować bezpośrednio na podłoże agarozowe tablice bakterii E. coli z mikronową rozdzielczością, aż do pojedynczych bakterii, na dużej powierzchni (cm2). Wykazano, że po wydrukowaniu wzoru bakterie nadal rosną i dzielą się, tak jak w warunkach hodowli masowej, tzn. bakterie zachowują swoje normalne zachowanie fizjologiczne po wydrukowaniu. Wykazano również, że stężenie agarozy jest kluczowe dla dobrej wydajności drukowania. Zbyt małe stężenie prowadzi do zniekształcenia drukowanego wzoru, podczas gdy zbyt duże stężenie nie jest odpowiednie do hodowli bakterii. Aby uzyskać tablice pojedynczych bakterii, zbadano efekt zmniejszenia początkowego stężenia bakterii w kropli podłoża hodowlanego LB. Dla początkowych stężeń 109 i 108 komórek/ml, średnia liczba bakterii na plamkę wynosiła odpowiednio 12,1 i 1,4. Przy niskich stężeniach bakterii uzyskano bardzo wąski rozkład: 44,6% plamek miało tylko jedną komórkę E. coli, a 40,1% plamek miało 0 lub 2 komórki. Wyniki te wykazały, że druk mikrokontaktowy pozwala na wytwarzanie regularnych macierzy pojedynczych bakterii. Co więcej, wykazano, że takie podejście do separacji matryc bakteryjnych pozwala na analizę tempa wzrostu poszczególnych linii bakterii. Metodologia ta zapewnia prosty sposób na dowolny pożądany przestrzenny dwuwymiarowy rozkład bakterii i może być wykorzystana zarówno do badań przesiewowych, jak i do badań nad zmiennością fenotypową bakterii, dynamiką populacji i ewolucją ekosystemów.

Szybko rozwijająca się dziedzina – socjomikrobiologia – zidentyfikowała mechanizmy, za pomocą których bakterie uczestniczą w relacjach współpracy i konkurencji, wpływając na pobliskich sąsiadów poprzez kontakt fizyczny i modyfikację składu chemicznego ich wspólnego mikrośrodowiska. W celu zbadania zachowania małych agregatów mikroorganizmów, opracowano różne technologie mikroprocesów, które ograniczają bakterie w urządzeniach mikroprzepływowych, mikrorezonatorach i ultra-niskich objętościach kropel cieczy. Możliwość zintegrowania systemów analitycznych z mikroprzepływami uczyniła te platformy izolacyjne atrakcyjnymi dla wysokowydajnych badań przesiewowych w kierunku oporności na antybiotyki i analizy aktywności enzymatycznej. Na przykład, w pracy Eun i wsp. opisano wysokowydajną analizę i izolację komórek bakteryjnych zamkniętych w mikrocząsteczkach agarozy z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencyjnie (FACS). Do wytworzenia monodyspersyjnych mikrocząstek o średnicy ≈30 µm wykorzystano systemy mikrofluidyczne z ogniskowaniem przepływowym. Rozmiary tych cząstek umożliwiły ich współpracę z cytometrią przepływową i FACS, a czułość tych metod pozwoliła na skrócenie czasu inkubacji do replikacji komórek przed przeprowadzeniem analiz. Mała objętość mikrocząstek (≈1-50 pikolitrów) minimalizowała liczbę odczynników potrzebnych do badań bakteryjnych. Platforma ta pozwoliła na efektywną alokację i izolację bakterii, jak również na wykorzystanie kombinacji metod do szybkiej identyfikacji celów dla biologicznie aktywnych małych cząsteczek. Jako eksperymentalna demonstracja tej metody, komórki E. coli zostały zamknięte w mikrocząstkach agarozy, inkubowane w obecności różnych stężeń rifampicyny i analizowane przy użyciu FACS. Wyznaczono minimalne stężenie hamujące rifampicyny, a spontaniczne mutanty wykazujące oporność na antybiotyk wyizolowano za pomocą FACS i scharakteryzowano za pomocą sekwencjonowania DNA. Dzięki tej metodzie czas i ilość antybiotyków potrzebnych do izolacji mutantów zostały zredukowane odpowiednio 8 i 150 razy w porównaniu do tradycyjnych metod mikrobiologicznych z użyciem płytek z agarem odżywczym. Tak więc, metoda ta jest ważna w dziedzinach biologii chemicznej, chemii produktów naturalnych, jak również w odkrywaniu i charakteryzowaniu biologicznie aktywnych metabolitów wtórnych.

Podejścia wymienione powyżej były użyteczne w ograniczaniu rozmiaru, kształtu i atrybutów fizycznych (mikrosiedliska); jednakże, żadne z nich nie zapewniło możliwości określenia geometrii 3D agregatów bakteryjnych lub orientacji wielu populacji w sposób arbitralny. Dodatkowo, proces hermetyzacji komórek w ultra-niskich objętościach często ogranicza transport masy, prowadząc do warunków, które są niekompatybilne z rozwojem i sygnalizacją pomiędzy fizycznie izolowanymi populacjami. Rosnąca liczba dowodów podkreśla znaczenie mikrokolonii w rozmnażaniu bakterii, jednak obserwuje się brak narzędzi do systematycznej oceny zachowania komórek w takich zbiorowiskach. Nowe strategie tworzenia środowiska kulturowego 3D w skali mikroskopowej mogą odegrać kluczową rolę w określeniu, w jaki sposób bakterie zarządzają opornością na antybiotyki i innymi zachowaniami społecznymi w małych, gęstych agregatach.

W pracach Connell i wsp. oraz Connell i wsp. opisano metodę laserowego formowania mikroskopijnych komór 3D opartą na litografii wielofotonowej (MPL). Metoda MPL charakteryzuje się wysoką przepustowością i możliwością wytwarzania dowolnych wzorów. Stwarza ona możliwości przemysłowej produkcji mikrourządzeń 3D, takich jak elementy mikrooptyczne, rusztowania dla inżynierii tkankowej czy układy mikroprzepływowe. W badaniach Connell i wsp. albumina surowicy bydlęcej (BSA), wysoce rozpuszczalne białko, które może być usieciowane w porowate, trwałe i biokompatybilne hydrożele, została użyta do stworzenia mikroskopijnych trójwymiarowych komór bakteryjnych. W komorach BSA o objętości 1 pl zamknięto kilka oddzielnych bakterii, które następnie hodowano w klonalnych populacjach. Ze względu na dyfuzję biologicznie istotnych cząsteczek i antybiotyków przez ścianki BSA, jak również wymianę sygnałów wrażliwych na kworum, badano zachowanie społeczne społeczności bakteryjnych w odniesieniu do wielkości i gęstości populacji, kształtu pojemnika i szybkości przepływu środowiska.

W ciele ludzkim bakterie zwykle istnieją w zorganizowanych społecznościach 3D składających się z kilku gatunków bakterii. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wpływu geometrii na patogenność, w Connell et al. opisano strategię drukowania 3D dla społeczności bakteryjnych, w której fizycznie odrębne, ale chemicznie interaktywne populacje o określonym rozmiarze, kształcie i gęstości mogą być zorganizowane w dowolną formę (rysunek 2). Stosując to podejście wykazano, że stabilność jednego patogennego gatunku bakterii na antybiotyk może wzmacniać odporność drugiego gatunku ze względu na ich trójwymiarowe relacje. Przy pomocy techniki litografii laserowej, mikroskopijne pojemniki o objętości do 1 pl i grubości ścianki pojemnika do 2 µm wokół wybranych bakterii zawieszonych w żelatynie zostały uformowane poprzez usieciowanie cząsteczek polipeptydów w obszarze ogniskowym w wyniku nieliniowej absorpcji promieniowania laserowego przez cząsteczki fotouczulacza. Wynikiem tej wielofotonowej absorpcji jest powstawanie tlenu singletowego, który stymuluje wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe reakcje kowalencyjnego sieciowania pomiędzy BSA i żelatyną. Unikalne właściwości fizyczne i chemiczne żelatyny spowodowały zainteresowanie jej wykorzystaniem do różnych zastosowań, w tym do przechowywania, unieruchamiania i trójwymiarowej hodowli bakterii. Po usunięciu nadmiaru odczynnika, bakterie są lokalizowane w szczelnych zagłębieniach utworzonych przez usieciowaną żelatynę, która jest wysoce porowatym materiałem i wspiera szybki wzrost w pełni zamkniętych populacji komórek. Jest ona łatwo przepuszczalna dla polipeptydów, antybiotyków oraz dla sygnałów fizycznych i chemicznych, za pomocą których zachodzi interakcja między bakteriami. Izolacja komórek w mikropojemnikach stwarza możliwości osadzania różnych typów/gęstości pojemników jeden na drugim, jak również dynamicznych zmian orientacji całych populacji bakterii w obrębie społeczności.

Autorzy wykazali, że przestrzennie zlokalizowane interakcje Gram-dodatniego Staphylococcus aureus i Gram-ujemnych bakterii P. aeruginosa (dwa ludzkie patogeny, które często tworzą trwałe koinfekcje wewnątrz ran, cewników i płuc pacjentów z mukowiscydozą) mogą zwiększyć przeżywalność Staphylococcus w leczeniu antybiotykami β-laktamowymi.

Mikro-3D drukowanie komórek zasadniczo rozszerza możliwości badania oporności na antybiotyki, gdy pojedyncza mikrogrupa bakteryjna może wpływać na wrażliwość na antybiotyki sąsiednich otaczających lub osadzonych populacji – kwestia szczególnie istotna w przypadku infekcji in vivo (np, rany, jama ustna i mukowiscydoza płuc), gdzie tkanki są często kolonizowane przez kilka gatunków bakterii jednocześnie. Prawdziwa moc druku 3D polega na możliwości organizowania społeczności mikrobiologicznych w nieograniczonym zakresie geometrii. Drukowanie komórek mikro-3D może być również cennym narzędziem do badania mechanizmów i dynamiki odpowiedzi adaptacyjnych na warunki środowiskowe.