Drukowane w 3D bioniczne uszy | CDhistory

Projektowanie i wdrażanie bionicznych organów i urządzeń, które zwiększają ludzkie możliwości, znane jako cybernetyka, jest obszarem rosnącego zainteresowania naukowego.1,2 Dziedzina ta ma potencjał do generowania dostosowanych części zamiennych dla ludzkiego ciała, a nawet tworzenia organów zawierających możliwości wykraczające poza to, co zwykle zapewnia ludzka biologia. W szczególności, rozwój metod bezpośredniej wielowymiarowej integracji funkcjonalnych elementów elektronicznych z tkanką biologiczną i organami może mieć ogromny wpływ na medycynę regeneracyjną, protetykę i interfejsy człowiek-maszyna.3,4 Ostatnio, w kilku raportach opisano sprzężenie elektroniki i tkanek przy użyciu elastycznych i/lub rozciągliwych urządzeń planarnych i czujników, które dopasowują się do powierzchni tkanek, umożliwiając takie zastosowania jak wykrywanie biochemiczne i sondowanie aktywności elektrycznej na powierzchniach serca,5 płuc,6 mózgu,7 skóry8 i zębów.9 Jednakże, osiągnięcie bezproblemowego trójwymiarowego splotu komponentów elektronicznych z tkankami biologicznymi i organami jest znacznie trudniejsze.4

Inżynieria tkankowa opiera się na zasadzie, że różne typy komórek można zmusić do syntezy nowej tkanki, jeśli zostaną one umieszczone na odpowiednim trójwymiarowym rusztowaniu hydrożelowym w odpowiednim środowisku wzrostu.10-15 Po hodowli in vivo lub in vitro powstają struktury tkankowe, które posiadają morfologię oryginalnego rusztowania.16 Jednak głównym wyzwaniem w tradycyjnych metodach inżynierii tkankowej jest wytworzenie implantów z posiewem komórek o strukturze naśladującej rodzimą tkankę, zarówno pod względem geometrii anatomicznej, jak i wewnątrztkankowego rozmieszczenia komórek.17 Do wytwarzania trójwymiarowych konstrukcji tkankowych o złożonej geometrii 3D wykorzystano techniki takie jak posiew komórek do form nieprzylepnych lub samozwijających się rusztowań.18,19. Jednak istniejące techniki nadal nie są w stanie łatwo tworzyć części narządów lub tkanek o wymaganej niejednorodności przestrzennej i dokładnej geometrii anatomicznej, aby sprostać niedoborowi dawców narządów do przeszczepów.20-22 Na przykład całkowita rekonstrukcja ucha zewnętrznego przy użyciu autogennej chrząstki – której celem jest odtworzenie ucha o wyglądzie podobnym do małżowiny usznej po stronie przeciwnej – pozostaje jednym z najtrudniejszych problemów w dziedzinie chirurgii plastycznej i rekonstrukcyjnej.23

Techniki wytwarzania przyrostowego, takie jak druk 3D, oferują potencjalne rozwiązanie poprzez możliwość szybkiego tworzenia modeli wspomaganego komputerowo projektowania (CAD) poprzez krojenie ich na warstwy i budowanie warstw w górę przy użyciu komórek biologicznych jako atramentów, w precyzyjnych geometriach anatomicznych narządów ludzkich.24-27 Odmiany druku 3D były wykorzystywane jako metody wytwarzania brył swobodnych, chociaż ich zastosowanie było głównie ograniczone do tworzenia pasywnych części mechanicznych.24,28 Druk 3D oparty na ekstruzji był wykorzystywany do tworzenia rusztowań z tkanek twardych, takich jak łąkotki kolanowe i dyski międzykręgowe, wypełnionych komórkami zamkniętymi.29-31 Technika ta oferuje możliwość tworzenia przestrzennie heterogenicznych struktur wielomateriałowych poprzez wykorzystanie narzędzi do osadzania, które mogą wytłaczać szeroką gamę materiałów.32 Co więcej, nanoskalowe funkcjonalne bloki konstrukcyjne umożliwiają wszechstronne oddolne łączenie makroskalowych komponentów posiadających przestrajalne funkcje. To mogłoby pozwolić na jednoczesne drukowanie materiałów nanoelektronicznych i komórek biologicznych, aby uzyskać trzy wymiary zintegrowanych tkanek cyborga i narządów wykazujących unikalne możliwości.33,34

Tutaj przedstawiamy koncepcyjnie nowe podejście, które odnosi się do wyżej wymienionych wyzwań, w pełni przeplatając funkcjonalne elementy elektroniczne z tkanką biologiczną poprzez drukowanie 3D materiałów nanoelektronicznych i żywych komórek posianych hydrożelami w precyzyjnej geometrii anatomicznej ludzkich narządów. Ponieważ obwody elektroniczne stanowią rdzeń urządzeń sensorycznych i przetwarzających informacje,35 hodowla in vitro drukowanej architektury hybrydowej umożliwia rozwój „organów cyborga” wykazujących zwiększoną funkcjonalność w stosunku do ludzkiej biologii. Nasze podejście oferuje możliwość definiowania i tworzenia przestrzennie heterogenicznych konstrukcji poprzez wytłaczanie szerokiej gamy materiałów w procesie warstwa po warstwie, aż do uzyskania ostatecznej stereolitograficznej geometrii. Koncepcja drukowania 3D żywych komórek wraz z komponentami elektronicznymi i hodowania ich w funkcjonalne organy reprezentuje nowy kierunek w łączeniu elektroniki z systemami biologicznymi. W rzeczy samej, takie organy cyborgów różnią się od tkanek inżynierskich lub konformalnej planarnej/elastycznej elektroniki i oferują unikalny sposób osiągnięcia trójwymiarowej fuzji elektroniki z tkanką.

Jako dowód koncepcji tego podejścia, oceniliśmy zdolność druku 3D do stworzenia żywej małżowiny usznej, która również zawiera elektronikę, która umożliwia alternatywne możliwości dla ludzkiego słuchu. Ludzkie organy składające się głównie z tkanki chrzęstnej, takie jak małżowina uszna, stanowią odpowiednich kandydatów na prototyp do zbadania wykonalności naszego podejścia. Wynika to z 1) nieodłącznej złożoności geometrii anatomicznej ucha, która czyni je trudnym do bioinżynierii poprzez tradycyjne metody inżynierii tkankowej, jak również 2) prostoty struktury na poziomie tkanki chrzęstnej ze względu na brak naczyń krwionośnych.23,36 Dodatkowo, oddolne składanie matryc nanoelektronicznych daje możliwość hierarchicznego generowania funkcjonalnych elementów elektronicznych w skali makro. W szczególności, demonstrujemy drukowanie 3D matrycy hydrożelowej z chondrocytów, nasączonej alginianem, z elektrycznie przewodzącą anteną indukcyjną z nanocząstkami srebra (AgNP), łączącą się z elektrodami w kształcie ślimaka, opartymi na silikonie. W rezultacie uzyskano trójwymiarową integrację funkcjonalnych elementów elektronicznych w obrębie złożonej i precyzyjnej geometrii anatomicznej ludzkiego ucha (Rys. 1).

W proces ten zaangażowane są następujące kroki. Po pierwsze, rysunek CAD bionicznego ucha (Rys. 1A) jest używany do przepisania geometrii anatomicznej i heterogeniczności przestrzennej różnych materiałów funkcjonalnych. Jak opisano powyżej, trzy materiały składają się na trzy funkcjonalne składniki (strukturalny, biologiczny i elektroniczny) bionicznego ucha. Materiały te zostały wprowadzone do strzykawkowej drukarki 3D Fab@Home (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (Rys. 1B). Wydrukowana bioelektroniczna hybrydowa konstrukcja ucha jest następnie hodowana in vitro, aby umożliwić wzrost tkanki chrzęstnej w celu utworzenia ucha cyborga z możliwością wyczuwania sygnałów elektromagnetycznych w zakresie częstotliwości radiowych (RF) za pomocą cewki indukcyjnej działającej jako antena odbiorcza (rysunek 1C).

Aby zademonstrować nasze podejście, wydrukowaliśmy konstrukcję bionicznego ucha w następujący sposób. Jako rusztowanie, wstępnie posialiśmy hydrożelową matrycę alginianową z żywymi chondrocytami w gęstości ~60 milionów komórek/mL (patrz Informacje pomocnicze). Matryca alginianowa jest trójwymiarowo stabilna w hodowli, nietoksyczna, kompatybilna z wstępnym posiewem i wytłaczaniem oraz stanowi odpowiedni nośnik dla komórek, ponieważ sieciowanie może być zainicjowane przed osadzeniem.37 Chondrocyty użyte do drukowania zostały wyizolowane z chrząstki stawowej jednomiesięcznych cieląt (Astarte Biologics, Redmond, WA). Rysunek CAD małżowiny usznej człowieka w formacie stereolitografii (STL) ze zintegrowaną anteną z cewką kołową podłączoną do elektrod w kształcie ślimaka wykorzystano do zdefiniowania ścieżek drukowania poprzez pocięcie modelu na warstwy konturów i ścieżek wypełnienia rastrowego. Sieciowanie zainicjowano w alginianowej matrycy hydrożelowej wstępnie posianej żywymi chondrocytami, która następnie została wydrukowana 3D wraz z przewodzącymi (nasyconymi AgNP) i nieprzewodzącymi roztworami silikonowymi (Film 1). Razem, ta metoda wytworzyła biologiczne, elektroniczne i strukturalne komponenty bionicznego organu w jednym procesie.

Rysunek 2A przedstawia wydrukowane 3D bioniczne ucho natychmiast po wydrukowaniu. Stwierdzono, że wiernie odwzorowuje ono rysunek CAD, z zachowaniem dokładnej przestrzenności dla każdego materiału, zgodnie z założeniami projektu. Konstrukcja wydrukowanego ucha została zanurzona w pożywce do hodowli chondrocytów zawierającej 10% lub 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), która była odświeżana co 1-2 dni (Zobacz Informacje Pomocnicze). Ucho hybrydowe wykazywało dobrą integralność strukturalną i zachowanie kształtu w warunkach hodowli (Rys. 2B). Z czasem konstrukcja stopniowo stawała się bardziej nieprzezroczysta; było to najbardziej widoczne po czterech tygodniach hodowli i jest brutto spójne z rozwojem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Morfologia brutto bionicznego ucha po 10 tygodniach hodowli in vitro jest pokazana w Informacjach pomocniczych.

Żywotność badano bezpośrednio przed i podczas różnych etapów procesu drukowania. Początkową żywotność komórek określono po hodowli przy użyciu testu wykluczenia komórek z błękitem trypanu (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) i stwierdzono, że wynosi ona 96,4 ± 1,7% (rys. 2C) (patrz: informacje dodatkowe). Wydrukowany ucho alginianowe nasycone komórkami zostało również przetestowane przy użyciu testu LIVE/DEAD® Viability Assay (Molecular Probes, Eugene, OR) i wykazało żywotność komórek 91,3 ± 3,9% z jednorodnym rozmieszczeniem chondrocytów. Wynik ten sugeruje, że proces drukowania, w tym enkapsulacja i osadzanie komórek, nie ma znaczącego wpływu na żywotność chondrocytów.

W szczególności, to podejście polegające na drukowaniu wstępnie posianej matrycy hydrożelowej eliminuje główne problemy związane z ograniczeniami głębokości posiewu i niejednolitym posiewem w tradycyjnych metodach posiewu wstępnie uformowanych rusztowań 3D. Posiew chondrocytów do bioabsorbowalnej matrycy alginianowej i kształtowanie jej za pomocą druku 3D lokalizuje komórki w pożądanej geometrii, umożliwiając wytwarzanie nowej ECM w określonych miejscach podczas hodowli w pożywkach. W miarę rozwoju tkanki, polimerowe rusztowanie jest ponownie wchłaniane (Rys. 2D), dzięki czemu nowa tkanka zachowuje kształt polimeru, w którym zostały zasiane komórki. Biodegradowalne rusztowanie zapewnia każdej komórce lepszy dostęp do składników odżywczych i skuteczniejsze usuwanie odpadów.

Następnie zastosowano ocenę histologiczną w celu porównania morfologii chondrocytów w neocartilage ucha bionicznego z morfologią rodzimej tkanki chrzęstnej. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) ujawniło równomierne rozmieszczenie chondrocytów w konstruktach (Rys. 2E) (Patrz: Informacje dodatkowe). Histologia tkanki ucha z barwieniem Safranin O wykazała względnie jednolitą akumulację proteoglikanów w hodowanej tkance ucha (Fig. 2F). Te biochemiczne dane są spójne z rozwojem nowej chrząstki.38 Wreszcie, pomiary fluorescencyjne zostały użyte, aby upewnić się co do żywotności wydrukowanej w 3D bionicznej tkanki ucha po 10 tygodniach hodowli in vitro, używając barwników dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidium (PI). Rysunki 2G i 2H przedstawiają odpowiednio tkankę pokrywającą antenę cewki oraz tkankę wewnętrzną, która jest w kontakcie z elektrodą biegnącą prostopadle przez tkankę. W obu przypadkach, wyhodowana chrząstka wykazywała doskonałą morfologię i żywotność na poziomie tkanki. Warto zauważyć, że takie podejście do hodowli tkanki w obecności abiotycznych materiałów elektronicznych może zminimalizować odpowiedź immunologiczną wyhodowanej tkanki.

Następnie scharakteryzowaliśmy właściwości mechaniczne chrząstki na różnych etapach wzrostu, ponieważ rozwój ECM silnie koreluje z właściwościami mechanicznymi rozwijającej się tkanki.39 Najpierw wykonano obszerne charakterystyki biochemiczne i histologiczne. Próbki zostały usunięte z hodowli zawierających 10% i 20% FBS w 2, 4, 6, 8 i 10 tygodniu i zamrożone w celu zmierzenia zawartości DNA w neocartilage i do biochemicznej oceny ECM (patrz Informacje pomocnicze). Akumulacja ECM w konstruktach była oceniana poprzez ilościowe oznaczenie dwóch ważnych składników ECM: 1) hydroksyproliny (HYP) jako markera zawartości kolagenu i 2) siarczanowanego glikozaminoglikanu (GAG) jako markera proteoglikanów. Do 10. tygodnia zawartość HYP wzrosła do 1,2 ± 0,1 μg/mg i 1,4 ± 0,2 μg/mg odpowiednio dla hodowli zawierających 10% i 20% FBS (ryc. 3A). Odpowiednie wartości zawartości GAG w 10. tygodniu wynosiły 10,6 ± 0,6 μg/mg i 12,2 ± 1,0 μg/mg (ryc. 3B). Ten wzrost zawartości GAG i HYP wskazuje, że chondrocyty są żywe i aktywne metabolicznie w hodowli.

Następnie analizowano właściwości rozciągania poprzez testowanie wydrukowanych w 3D próbek chondrocytów-alginianu kości psa w różnych punktach hodowli, w których kości psa zawierały te same gęstości komórek i identyczne warunki hodowli jak ucho (Zobacz Informacje Pomocnicze). Ocena właściwości mechanicznych wykazała, że moduł Younga kości pieska wzrastał wraz z upływem czasu z 14,16 kPa do 111,46 kPa w 10. tygodniu (ryc. 3C). W podobnych warunkach badano również kości psów o mniejszej gęstości chondrocytów, wynoszącej 20 milionów komórek/mL, aby zrozumieć wpływ początkowej gęstości chondrocytów na właściwości mechaniczne wyhodowanej tkanki. Stwierdzono, że w 10. tygodniu charakteryzują się one niższym modułem Younga wynoszącym 73,26 kPa. Następnie scharakteryzowano twardość wyhodowanej tkanki chrzęstnej wydrukowanej 3D małżowiny usznej za pomocą pomiarów nanoindentacyjnych. Wgłębienia wykonano w różnych miejscach anatomicznych małżowiny usznej (ryc. 3D). Jak pokazano w tabeli 1, wartości twardości okazały się względnie jednorodne, w zakresie od 38,50 kPa do 46,80 kPa, potwierdzając integralność strukturalną wydrukowanego ucha.40

Aby zademonstrować zwiększoną funkcjonalność wydrukowanego w 3D bionicznego ucha, przeprowadziliśmy serię charakterystyk elektrycznych. Po pierwsze, rezystywność anteny cewki została zmierzona przy użyciu czteropunktowych pomiarów sondą i okazała się być zależna od objętościowego natężenia przepływu użytego do drukowania przewodzącego silikonu nasyconego AgNP (Zobacz Informacje Pomocnicze). Przy optymalnym natężeniu przepływu rezystywność wydrukowanej cewki wynosiła 1,31 × 10-6 Ω-m, co jest wartością tylko o dwa rzędy wielkości większą niż w przypadku czystego srebra (1,59 × 10-8 Ω-m). Następnie przeprowadzono eksperymenty odbioru bezprzewodowych fal radiowych. Aby zademonstrować zdolność bionicznego ucha do odbierania sygnałów o częstotliwościach wykraczających poza normalne słyszalne częstotliwości (u ludzi 20 Hz do 20 kHz), utworzyliśmy zewnętrzne połączenia z elektrodami w kształcie ślimaka, wychodzące z cewki indukcyjnej bionicznego ucha (Rysunek 4A). Następnie ucho poddano działaniu fal sinusoidalnych o częstotliwościach z zakresu od 1 MHz do 5 GHz. Parametr S21 (forward transmission coefficient) anteny cewki został przeanalizowany przy użyciu analizatora sieci i okazało się, że transmituje ona sygnały w całym tym rozszerzonym spektrum częstotliwości (Rys. 4B).

Co najważniejsze, jako demonstracyjny przykład wszechstronności w modyfikowaniu ostatecznego organu poprzez modyfikację projektu CAD, wydrukowaliśmy komplementarne lewe ucho poprzez proste odzwierciedlenie oryginalnego modelu (patrz Informacje pomocnicze). Lewy i prawy kanał stereofonicznego sygnału audio był transmitowany do lewego i prawego bionicznego ucha poprzez nadawcze magnetyczne anteny pętlowe z rdzeniami ferrytowymi (Rys. 4C). Sygnały odbierane przez bioniczne uszy były zbierane z wyjścia sygnału z podwójnych elektrod w kształcie ślimaka i wprowadzane do oscyloskopu cyfrowego oraz odtwarzane przez głośnik w celu monitorowania słuchowego i wzrokowego. Fragmenty nadawanych i odbieranych sygnałów o czasie trwania 1 ms dla prawego i lewego ucha bionicznego pokazano na Rysunku 4D i stwierdzono, że wykazują one doskonałą reprodukcję sygnału audio. Co istotne, odtwarzana muzyka (Beethoven’s „Für Elise”) z sygnału odbieranego przez bioniczne uszy posiadała dobrą jakość dźwięku (Movie 2).

Podsumowując, wyprodukowano konstrukcyjne „uszy cyborga”, które są zdolne do odbierania sygnałów elektromagnetycznych w szerokim zakresie częstotliwości od Hz do GHz. Nasza strategia stanowi dowód zasady splatania wszechstronności technik wytwarzania addytywnego z montażem nanocząstek i koncepcjami inżynierii tkankowej. Rezultatem jest generowanie bionicznych organów zarówno pod względem formy, jak i funkcji, co potwierdzają testy porównawcze z zakresu inżynierii tkankowej oraz pomiary elektryczne. Takie hybrydy różnią się od tkanki inżynierskiej lub planarnej/elastycznej elektroniki i oferują unikalny sposób osiągnięcia bezproblemowej integracji elektroniki z tkankami w celu wygenerowania „gotowych” organów cyborga. Wreszcie, wykorzystanie druku 3D z innymi klasami nanoskalowych funkcjonalnych bloków konstrukcyjnych, w tym nanocząstek półprzewodnikowych, magnetycznych, plazmonicznych i ferroelektrycznych, może rozszerzyć możliwości inżynierii bionicznych tkanek i organów.