Okularna odpowiedź na iniekcję wewnątrzgałkową
Zasugerowano, że komórki monocytarne F4/80+ centralne dla indukcji ACAID były komórkami rezydującymi w tęczówce i ciele rzęskowym, które wyemigrowały z tęczówki przez kanał Schlemm’a1,6,10 do krążenia. Ponieważ antygen jest obecny w oku przez co najmniej 24 godziny, antygen może mieć efekt „depot”, chociaż niektóre antygeny znajdują się w krążeniu szybko po wstrzyknięciu wewnątrzgałkowym antygenu.8 Ponieważ wewnątrzgałkowe wstrzyknięcie antygenu indukuje pojawienie się PBMC indukujących ACAID, jest prawdopodobne, że te komórki monocytarne, a nie krążący antygen sam indukują ACAID.
Wewnątrzgałkowe wstrzyknięcie antygenu indukuje infiltrację komórek monocytarnych do siatkówki jako wczesny etap zapalenia błony naczyniowej.11,12 Co więcej, infekcja oczna wywołuje silny naciek zapalny w tylnej lub przedniej komorze.12-14 Konsekwencją takiego stanu zapalnego jest wzrost stężenia cytokin zapalnych w płynach ocznych, takich jak ciecz wodnista. Odpowiednio, śródgałkowe wstrzyknięcie cząstek antygenu indukuje wzrost mRNA dla TNF-α, sugerując wczesną odpowiedź zapalną w komorze przedniej.14,15 Dodatkowo, systemowe tłumienie nadwrażliwości typu opóźnionego nie jest indukowane u myszy otrzymujących śródgałkowe wstrzyknięcie przeciwciał przeciwko TNF-α wraz z antygenem, co sugeruje, że TNF-α jest wymagany podczas indukcji ACAID. Ponadto indukcja ACAID w tych badaniach zależała od rozmiaru igły użytej do iniekcji śródszpikowej rozpuszczalnych białek oraz od tego, czy antygen był w postaci cząsteczkowej czy rozpuszczalnej.15 Autorzy ci zasugerowali, że iniekcja śródszpikowa antygenów cząsteczkowych i / lub rozmiar igły użytej do iniekcji śródszpikowych wywołuje uraz wymagany do wywołania ACAID. Makrofagi i komórki dendrytyczne wyrażające marker komórek dendrytycznych CD11c są rezydentami tęczówki, ciała rzęskowego i naczyniówki w odcinku przednim.8,10,16,17 Antygen wstrzyknięty do komory przedniej jest szybko pobierany przez te komórki. Dodatkowo, makrofagi i komórki dendrynowe znajdują się w pobliżu Kanału Schlemm’a17,18 uważanego za miejsce wyjścia komórek F4/80+ z komory przedniej do krążenia.1 Jednakże, wyjście komórek rezydujących w tęczówce, które pochłaniają antygen do krążenia zostało zakwestionowane.16 Rozpuszczalny antygen szybko opuszcza komorę przednią przez krążenie i rozprzestrzenia się podobnie do antygenu podawanego dożylnie.8 Część antygenu, który wychodzi z oka, może być w formie tolerogennej.19 Jednak prawdopodobne jest, że antygen wewnątrzgałkowy jest prezentowany w grasicy i śledzionie przez tak zwane „tolerogenne komórki prezentujące antygen”, które wyszły z oka z antygenem. Ponadto TGF-β w wodnistym humorze lub wytwarzany przez komórki F4/80+ tęczówki indukuje fenotyp supresyjny w obwodowych komórkach F4/80+10,20,21 sugerując, że indukcja fenotypu supresyjnego w komórkach F4/80+ występuje w komorze przedniej.
Podobnie do traktowania obwodowych komórek F4/80+ z wodnistym humorem i antygenem, inkubacja komórek F4/80+ wysięku otrzewnowego z antygenem i TGF-β in vitro nakłada na komórki fenotyp supresyjny. Kiedy te komórki są wstrzykiwane dożylnie naiwnym myszom, indukują swoiste dla antygenu limfocyty T regulatorowe śledziony, podobne do tych uzyskanych przez śródszpikowe wstrzyknięcie antygenu.21 ACAID jest indukowany przez bardzo niewiele komórek F4/80+ traktowanych w ten sposób1, co sugeruje, że (niewykrywalne) komórki emigrujące z tęczówki i ciała rzęskowego mogą indukować ACAID. Co więcej, komórki F4/80+ tęczówki odzyskane od myszy, które otrzymały domaciczne wstrzyknięcie antygenu, indukują indukcję ACAID lub nadają F4/80+ PBMC fenotyp supresyjny podobny do tych krążących komórek odzyskanych od myszy, które otrzymały domaciczne wstrzyknięcie antygenu.9,21 Jest prawdopodobne, że antygen pobrany i przetworzony przez komórki prezentujące antygen w tęczówce mógł być przeniesiony do PBMC, które infiltrowały komorę przednią, w taki sam sposób, w jaki antygen jest przenoszony do komórek B indukujących ACAID w śledzionie przez komórki wysięku otrzewnowego poddane działaniu TGF-β i zawierające antygen.22 Łącznie, obserwacje te sugerują, że zdarzenia zachodzące w komorze przedniej mogą indukować fenotyp supresyjny na nierezydentnych komórkach zapalnych, które infiltrują komorę przednią.
Na podstawie powyższych rozważań zbadaliśmy możliwość, że śródszpikowe wstrzyknięcie antygenu indukuje napływ krążących PBMC do komory przedniej z powodu urazu wstrzyknięcia. Te naciekające komórki byłyby narażone na działanie immunosupresyjnego TGF-β w cieczy wodnistej i rezydujących w tęczówce/ciele rzęskowym komórek dendrynowych, które mogłyby prezentować wstrzyknięty antygen naciekającym PBMC. Zgodnie z tą hipotezą, komórki, które zostały zrekrutowane do komory przedniej z powodu urazu spowodowanego iniekcją, następnie recyrkulują i kierują się do grasicy i śledziony, gdzie indukują regulatorowe limfocyty T.
W ciągu 3 godzin po wewnątrzgałkowym wstrzyknięciu owalbuminy (OVA) stwierdziliśmy również wzrost TNF-α w wodnistym humorze, jak opisali Ferguson i wsp.15. Dodatkowo zaobserwowaliśmy wzrost chemokiny MCP-1 w wodnistym płynie mózgowo-rdzeniowym sześć godzin po iniekcji domięśniowej (ryc. 1). Nakłucie igłą bez wstrzyknięcia PBS indukowało pojawienie się TNF-α w wodnistym humorze, a wstrzyknięcie PBS zwiększyło ilość TNF-α tylko pięciokrotnie bardziej niż uzyskane przez nakłucie igłą. TNF-α w wodnistym płynie mózgowym szybko się zmniejsza i nie jest wykrywany 12 godzin po domięśniowym wstrzyknięciu owalbuminy (OVA) (dane nie pokazane). MCP-1 utrzymuje się w wodnistym płynie mózgowo-rdzeniowym przez dłuższy czas. Jednakże, w przeciwieństwie do TNF-α, szczytowe poziomy MCP-1 są osiągane w cieczy wodnistej do 12 godz. i utrzymują się do 16 godz. po domacicznej iniekcji OVA (dane nie pokazane). Ten wzrost poziomu TNF-α i MCP-1 w wodnistym płynie mózgowo-rdzeniowym po domacicznej iniekcji antygenu sugeruje rozpoczęcie odpowiedzi zapalnej w komorze przedniej. Co więcej, TNF-α nie jest zwiększony w wodnistym humorze, ani nie jest wywołany ACAID, jeśli igła użyta do iniekcji wewnątrzgałkowej jest zbyt mała i/lub antygen nie jest zapalny.15
Wstrzyknięcie wewnątrzgałkowe antygenu podnosi TNF-a i MCP-1 w wodnistym humorze. Trzy-sześć godzin po tym, jak 6-8 tygodniowe naiwne samice myszy BALB/c otrzymały dożylnie 5 × 106 – 1 × 107 PBMC znakowanych CFSE, myszy zostały znieczulone wstrzyknięciem ip ketaminy/ksylazyny7 i otrzymały iniekcję domięśniową PBS, PBS + 50 μg OVA lub tylko nakłucie igłą o masie 24 g. Sześć godzin po tym, jak myszy naiwne otrzymały iniekcję domięśniową, wodnisty płyn odzyskano od eutanazowanych myszy i 10 μl oznaczono metodą ELISA dla TNF-α i MCP-1. Dane przedstawiają średnią +/- S.E.M. pg wykrytych z 4-6 powtórzeń/grupa w 2-3 eksperymentach.
Aby określić, czy istnieje równoczesny napływ komórek zapalnych do komory przedniej po wstrzyknięciu antygenu do komory przedniej, myszy wstrzyknięte dożylnie z PBMC znakowane barwnikiem fluorescencyjnym CFSE również otrzymały iniekcję śródszpikową. Stosując to podejście, zaobserwowaliśmy znaczący napływ znakowanych CFSE i nieznakowanych (gospodarz) komórek monocytarnych F4/80+, które wykazują ekspresję receptorów chemokinowych CCR2 i CCR5, jak wykazano przez odzyskanie tych komórek z tęczówek myszy 24 godziny po tym, jak myszy otrzymały iniekcję antygenu do komory wewnątrzoczodołowej. Nie było wzrostu tych komórek w kontrolach, które otrzymały dożylne PBMC znakowane CFSE, ale nie otrzymały domacicznego wstrzyknięcia antygenu.23 Około 48 godzin po domacicznym wstrzyknięciu antygenu liczba komórek naciekających w tęczówce zmniejsza się i wzrasta w grasicy i śledzionie (ryc. 2). Ten wzrost krążących komórek monocytarnych przy tęczówce jest prawdopodobnie spowodowany infiltracją krążących monocytów w odpowiedzi na uraz wstrzyknięcia śródszpikowego +/- drażniącego PBS i / lub antygenu/PBS, ponieważ liczba naciekanych komórek monocytarnych wzrosła, gdy myszy otrzymały antygen śródszpikowy: infiltracja PBMC znakowanych CFSE wywołana tylko wstrzyknięciem była < wstrzyknięcie PBS < wstrzyknięcie TNP-BSA/PBS. Komórki monocytarne rekrutowane do tęczówki po domacicznym wstrzyknięciu antygenu wykazują ekspresję zarówno CCR2, jak i CCR5.23 Migracja komórek do tęczówki wymaga ekspresji CCR2, ale nie CCR5, ponieważ CCR2 -/- PBMC nie wracają do tęczówki, ale CCR5 -/- PBMC wracają do tęczówki po domacicznym wstrzyknięciu antygenu. Ponadto, domaciczna iniekcja OVA myszom CCR2 -/- nie indukuje krążących komórek monocytarnych, które przenoszą supresję nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH) na OVA, gdy wstrzykuje się ją dożylnie biorcom wildtype.23
Migracja PBMC po iniekcji domacicznej. Znieczulonym myszom7 BALB/c wstrzyknięto domięśniowo trinitrofenylową albuminę bydlęcą sześć godzin po tym, jak myszy otrzymały dożylnie 5 × 106 -1 × 107 PBMC znakowanych CFSE. Dwadzieścia cztery godziny po iniekcji domięśniowej myszy poddano eutanazji przez inhalację CO2, usunięto tęczówki, śledziony i grasice, połączono je i przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki były następnie znakowane fikocyjaniną anty-F4/80 i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Procentowy wzrost liczby komórek CFSE, F480+ obliczono jako:
.