Structural Implications
W wyniku modyfikacji zmutowanego białka zawierającego cysteinę (K41C) za pomocą bromoetyloaminy otrzymano enzym dość blisko spokrewniony z dzikim typem RNazy A. Jednak wartość kcat/Km dla katalizy przez K41S-etyloaminocysteinową RNazę A wynosi tylko 8% wartości enzymu dzikiego typu. Różnica w tych dwóch białkach musi leżeć w różnicach pomiędzy grupą tioeterową a grupą metylenową. Chociaż kąty wiązań C-S-C są zwykle bardziej ostre niż wiązań C-CH2-C, różnica ta jest kompensowana przez większą długość wiązań C-S.3g,14 Modelowanie molekularne wskazuje, że pierwszorzędowe grupy aminowe w S-etyloaminocysteinie i lizynie mogą być nałożone na siebie z dokładnością do 0,1 Å. Bardziej znaczącą różnicą pomiędzy S-etyloaminocysteiną i lizyną jest ich względna preferencja dla kątów skręcania gauche, a nie anty.15 Antykonformacja wiązań CC-CC jest preferowana przez około 0,8 kcal/mol w związkach modelowych.16 Rzeczywiście, średni kąt skręcania K41 wynosi (175 ± 3)° w kompleksie RNase A z cyklicznym 2′,3′-uridine vanadate (U>v), przypuszczalnym analogiem stanu przejściowego (Rysunek 2). W przeciwieństwie do wiązań CC-CC, konformacja gauche wiązań CS-CC jest faworyzowana o 0,05-0,20 kcal/mol.17 Modelowanie molekularne wskazuje, że wiązanie CS-CC reszty S-etyloaminocysteinowej w pozycji 41 może znajdować się w konformacji gauche bez zaburzania struktury natywnego białka. Tak więc, tioeterowe łańcuchy boczne w pozycji 41 są prawdopodobnie mniej sztywne i wydłużone niż alkilowe łańcuchy boczne. Dlatego przypuszczamy, że kataliza przez enzym S-etyloaminocysteiny nie jest tak wydajna jak przez RNazę A typu dzikiego z powodu kosztu entropowego związania tioeteru w konformacji all anti.
Struktura miejsca aktywnego RNazy A związanego z 2′,3′-cyklicznym wanadanem urydyny. Struktura została uściślona na 2.0 Å z danych dyfrakcji rentgenowskiej i neutronowej zebranych z kryształów hodowanych w pH 5.3. Łańcuch boczny fenyloalaniny 120 i baza uracylowa nie są pokazane.
Wydajność katalityczna zależy od długości łańcucha bocznego reszty 41. Warianty RNazy A, które prezentują grupę aminową na końcu łańcucha bocznego dłuższego niż lizyna, są bardziej aktywnymi katalizatorami niż niemodyfikowana K41C RNaza A. W ten sposób dodatkowa długość jest tolerowana w miejscu aktywnym. Jednak enzymy, w których grupa aminowa w pozycji 41 jest oddzielona od łańcucha głównego o 4 atomy są bardziej aktywne niż te, w których jest ona oddzielona o 5 atomów. Wynik ten może wynikać z dodatkowej entropii konformacyjnej lub niekorzystnych kątów skręcania dłuższych łańcuchów bocznych.
Nie ma znaczącej przewagi, jeśli reszta 41 może oddać drugie wiązanie wodorowe. Grupy guanidynowe i acetamidynowe mogą oddziaływać jednocześnie z więcej niż jednym tlenem grupy fosforanowej. Na przykład, grupa guanidynowa jest używana do wiązania grup fosforowych przez białko HIV-1 Tat18 i przez sztuczne receptory.19 Ponadto, w nukleazie gronkowcowej i rybonukleazach z rodziny T1, arginina wydaje się pełnić rolę K41 w RNazie A.20 Zastąpiliśmy K41 resztą argininową i S-acetamidynową, która jest krótkim analogiem argininy. Wartości ΔΔG‡ dla tych enzymów są mniejsze niż dla analogicznych enzymów z tylko pierwszorzędową grupą aminową w łańcuchu bocznym w pozycji 41. Tak więc, jedno wiązanie wodorowe wydaje się być wystarczające do efektywnej katalizy. Wynik ten jest zgodny z krystalicznym kompleksem RNazy A z U>v (Rysunek 2). Grupa wanadylowa w U>v jest w przybliżeniu trygonalną dwupiramidą z dwoma niemostkującymi równikowymi oksygenami, O1V i O3V. Tlen O1V przyjmuje wiązanie wodorowe z łańcucha bocznego glutaminy 11, podczas gdy O3V przyjmuje wiązanie wodorowe z łańcucha głównego fenyloalaniny 120. Tylko O1V jest w pozycji do przyjęcia wiązania wodorowego z K41.
Mechanistic Implications. Rola katalityczna najczęściej przypisywana K41 polega na stabilizacji nadmiaru ładunku ujemnego zgromadzonego na niemostkujących oksygenach fosforylowych podczas rozszczepiania RNA (Rysunek 2). Gromadzenie ładunku może mieć miejsce w pentakordynacyjnym stanie przejściowym (lub w fosforanowym stanie pośrednim), gdy grupa hydroksylowa 2′ atakuje fosfor, na drodze do wyparcia 5′ nukleozydu. Zakładano, że stabilizacja ta zachodzi poprzez oddziaływania kulombowskie.12c,21 Ale ostatnio zaproponowano również, że stabilizacja zachodzi poprzez krótkie, silne wiązanie wodorowe obejmujące częściowe przeniesienie protonu z K41.22
Szczególnymi cechami reszt lizyny są jej dodatni ładunek i zdolność do oddawania wiązań wodorowych. Trzy z pięciu półsyntetycznych enzymów, jak również K41R mają te cechy wspólne. Rozróżnienie pomiędzy oddziaływaniem opartym wyłącznie na siłach kulombowskich a oddziaływaniem opartym na wiązaniach wodorowych pomiędzy dwoma naładowanymi gatunkami nie jest sprawą prostą. Poniżej podano najprostsze wyjaśnienie, które jest zgodne z danymi w tabeli 1.
Różnica między wiązaniami wodorowymi a siłami kulombowskimi jest najbardziej widoczna nigdzie bardziej niż w porównaniu enzymu S-etylo-trimetyloaminocysteiny, który posiada terminalny ładunek dodatni, ale nie ma zdolności do oddawania wiązania wodorowego, i enzymu S-acetamidocysteiny, który posiada amid N-H do potencjalnego oddawania wiązania wodorowego, ale nie posiada ładunku dodatniego. Niska aktywność katalityczna enzymu S-etylo-trimetyloaminocysteiny przemawia zdecydowanie przeciwko skuteczności sił kulombowskich w stabilizacji stanu przejściowego. Energia oddziaływania ładunek-ładunek maleje tylko jako odwrotno¶ć odległo¶ci. Zwiększona odległość pomiędzy ładunkiem dodatnim na łańcuchu bocznym a oksygenami fosforylowymi, w porównaniu z tą w enzymie S-etyloaminocysteiny, jest narzucona przez grupy metylowe. Jest jednak mało prawdopodobne, aby odległość ta była wystarczająco duża, aby spowodować obserwowane >103-krotne zmniejszenie kcat/Km, zwłaszcza że trzy grupy metylowe można było łatwo pomieścić w pobliżu oksygenów fosforylowych (rysunek 2).
Siła wiązania wodorowego powinna odwrotnie korelować z pKa oddawanego protonu, ponieważ wiązanie wodorowe obejmuje pewien zakres przeniesienia protonu.23 Jak pokazano w Tabeli 1, wzrostowi pKa rzeczywiście odpowiada spadek ΔΔG‡ dla enzymów półsyntetycznych o łańcuchach bocznych o porównywalnej długości. W przypadku enzymów półsyntetycznych, w których długość łańcucha bocznego jest porównywalna do lizyny, korelacja jest jednak nieliniowa. Ten brak liniowości może wynikać z faktu, że pKa każdego łańcucha bocznego zależy od jego konkretnego środowiska w natywnym białku. Rzeczywiście, pKa Lys41 zostało określone jako 9,0,24 a nie 10,6 jak podano dla jonu butyloamoniowego w Tabeli 1. Różne łańcuchy boczne mogą być dotknięte w różnym stopniu. Innym, być może bardziej znaczącym, źródłem nieliniowości jest fakt, że naładowane gatunki mają tendencję do uczestniczenia w silniejszych wiązaniach wodorowych niż gatunki nienaładowane. Zjawisko to zostało zaobserwowane dla białek25 , jak również małych cząsteczek, w tym amin.26 Porównanie półsyntetycznych enzymów z łańcuchami bocznymi, które są izosteryczne, ale różnią się ładunkiem formalnym, powinno ujawnić taką tendencję. Na przykład, w enzymach S-acetamidynocysteiny i S-acetamidocysteiny, łańcuchy boczne w pozycji 41 są identyczne, z wyjątkiem jednego z dwóch heteroatomów dołączonych do końcowego węgla. Jednak różnica w zdolności tych dwóch izologicznych łańcuchów bocznych do wiązania się ze stanem przejściowym jest większa niż można by się spodziewać na podstawie samej kwasowości. Wiązanie wodorowe oddane przez naładowaną acetamidynę jest o 4 kcal/mol silniejsze niż wiązanie oddane przez nienaładowany amid. Wartość ta jest zgodna z innymi danymi dotyczącymi względnej siły naładowanych i nienaładowanych wiązań wodorowych w oddziaływaniach białko-ligand.21 Wreszcie, warto zauważyć, że chociaż łańcuch boczny S-acetamido pozbawiony jest ładunku formalnego i ma stosunkowo wysokie pKa, nadal przyczynia się (choć w niewielkim stopniu) do katalizy. Wynik ten dostarcza kolejnych dowodów na znaczenie dla katalizy wiązania wodorowego przekazanego przez resztę 41.
.