Raport przypadku
63-letni mężczyzna z rozpoznanym w lipcu 2001 roku gruczolakorakiem płuc został przyjęty do Szpitala Uniwersyteckiego Hôtel Dieu w Paryżu. Rozpoczęto piąty kurs dożylnej chemioterapii złożonej z cisplatyny (50 mg/m2 powierzchni ciała) i winorelbiny (30 mg/m2) przez komorę cewnika, który został wszczepiony 12 tygodni wcześniej. Od 2 miesięcy chory otrzymywał kortykosteroidy z powodu bólu w klatce piersiowej spowodowanego uciskiem guza. W dniu następnym po przyjęciu do szpitala (1. doba) jego stan pogorszył się z gorączką (39,5°C) i dreszczami połączonymi ze wzrostem liczby białych krwinek (15 × 103 komórki na μl z 90% neutrofilów), stężenia białka C-reaktywnego (9,5 mg/dl) i fibrynogenu (0,51 mg/dl). W związku z tym przez 2 dni otrzymywał cefotaksym (3 g na dobę) i gentamycynę (180 mg na dobę). Analiza moczu była prawidłowa. Badanie radiologiczne klatki piersiowej oraz badanie echograficzne jamy brzusznej i serca nie uległy zmianie. Szczep bakterii Acinetobacter sp. wyizolowano z pięciu próbek krwi, w tym dwóch uzyskanych z komory cewnika. Komora cewnika została usunięta, ale jej posiew był jałowy. W 3. dobie zmieniono leczenie przeciwbakteryjne na imipenem (2 g na dobę) i amikacynę (900 mg na dobę) na 2 tygodnie, zgodnie z wrażliwością szczepu. W 5. dobie dołączono rifampinę (1,2 g na dobę), ponieważ pacjent nadal gorączkował. W 7. dniu pacjent był bezgorączkowy, z normalizacją liczby białych krwinek i białka C-reaktywnego.
Próbki krwi były inokulowane do fiolek z tlenowymi i beztlenowymi kulturami krwi (BACTEC PLUS; BD Diagnostic Systems, Sparks, Md.). Fiolki tlenowe były pozytywne i były hodowane na pożywce agarowej w temperaturze 37°C. Po 24 godzinach inkubacji kolonie miały średnicę od 1 do 1,5 mm, były okrągłe, wypukłe, gładkie i lekko nieprzezroczyste z całymi brzegami. Barwienie bakterii wykazało obecność Gram-ujemnych pałeczek okrężnicy. Wzrost w bulionie BHI (brain heart infusion) obserwowano w temperaturze 37°C, ale nie w 41 i 44°C. Drobnoustrój (izolat 954) był niemotylny, ściśle tlenowy i ujemny pod względem oksydazy. Wyrastał na agarze MacConkey (bezbarwne kolonie), był niehemolityczny na agarze z krwią owczą, nie utleniał d-glukozy, nie redukował azotanów oraz był ujemny na ureazę i żelatynę. W próbie identyfikacji tego izolatu użyto pasków API 20 NE i API ID 32 GN (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francja) zgodnie z zaleceniami producenta. Powtarzającymi się identyfikacjami bakterii uzyskanymi przy użyciu pasków API 20 NE i API ID 32 GN były Acinetobacter junii lub Acinetobacter johnsonii (nr kodu. 0000071; odsetek identyfikacji = 63,5%; wskaźnik typowości = 0,77) i A. johnsonii (nr kodu 00270063062; p = 90,5%; T = 0,87), odpowiednio. Wyniki te skłoniły nas do określenia sekwencji genu 16S rRNA (16S ribosomal DNA ) izolatu zgodnie z wcześniejszymi opisami (3, 6). W skrócie, 16S rDNA amplifikowano metodą PCR przy użyciu starterów Ad (5′-AGAGTTGATCTGCTCAG-3′) i rJ (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′). W sumie określono 1,484 ciągłych nukleotydów 16S rDNA. Kompletna sekwencja 16S rDNA izolatu została porównana z wszystkimi sekwencjami bakteryjnymi dostępnymi w bazie GenBank przy użyciu programu Blast (National Center for Biotechnology Information) i wykazała 99% podobieństwo do sekwencji typu szczepu Acinetobacter ursingii (GenBank accession no. AJ275038). Sekwencje 16S rDNA szczepów spokrewnionych filogenetycznie uzyskano z bazy danych GenBank. Wszystkie sekwencje 16S rDNA wyrównano przy użyciu programu CLUSTAL X, a drzewo filogenetyczne skonstruowano przy użyciu programu DENDROGRAF z pakietu Taxotron (Taxolab Institut Pasteur, Paryż, Francja) (ryc. 1).1). Wrażliwość przeciwdrobnoustrojową izolatów oznaczano metodą dyfuzji agarowej z zastosowaniem testu Epsilometer (E test; AB BIODISK, Solna, Szwecja) na agarze Mueller-Hinton zgodnie z zaleceniami producenta. Wyniki MIC były następujące: amoksycylina, 16 μg/ml; piperacylina, 12 μg/ml; cefotaksym, 32 μg/ml; cefepim, 24 μg/ml; ceftazydym, 128 μg/ml; imipenem, 0.125 μg/ml; gentamycyna, 0,25 μg/ml; amikacyna, 1 μg/ml; tobramycyna, 0,5 μg/ml; ryfampina, 3 μg/ml; cyprofloksacyna, 0,19 μg/ml. Test wykrywający beta-laktamazę przy użyciu krążka nitrocefinowego (BD Cefinase; BD Diagnostic Systems) był pozytywny.
Drzewo filogenetyczne izolatu 954 A. ursingii i szczepów typu gatunków pokrewnych oparte na analizie porównawczej sekwencji genu 16S rRNA. Wyrównanie sekwencji przeprowadzono metodą CLUSTAL. Dendrogram wygenerowano przy użyciu algorytmu sąsiedzkiego łączenia, wybierając Pseudomonas aeruginosa jako grupę zewnętrzną. %Knuc, procent substytucji nukleotydów.
Członkowie rodzaju Acinetobacter należą do poddziału gamma klasy Proteobacteria. W 1986 r. Bouvet i Grimont opisali cztery nowe gatunki Acinetobacter, mianowicie Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, A. johnsonii i A. junii (2). Ponadto, autorzy ci zmienili opisy dwóch innych gatunków, Acinetobacter calcoaceticus i Acinetobacter lwoffii. W 1988 r. opisano Acinetobacter radioresistens, pochodzącą z otoczenia (9). Ostatnio wyodrębniono A. ursingii i Acinetobacter schindleri, wyizolowane z ludzkich próbek klinicznych (7, 8). Tak więc, obecnie, rodzaj Acinetobacter składa się z powyższych dziewięciu gatunków. Jednakże, nie wystarcza to do nazwania wszystkich członków tego rodzaju, o czym świadczy 21 różnych grup DNA (genomospecies), o których wcześniej donoszono (5). W laboratoriach klinicznych identyfikacja niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych jest zwykle przeprowadzana przy użyciu systemów identyfikacyjnych, takich jak API 20 NE i API ID 32 GN (bioMérieux). A. baumannii, najczęstszy gatunek Acinetobacter występujący w zakażeniach szpitalnych, jest łatwo identyfikowany przy użyciu tych systemów. Jednakże, moc dyskryminacyjna testów wykorzystujących paski API okazała się niewystarczająca do dokładnej identyfikacji innych gatunków Acinetobacter (1). W tym przypadku, wstępna błędna identyfikacja była spowodowana brakiem A. ursingii w bazach danych pasków API 20 NE i API ID 32 GN. Dodatkowe testy fenotypowe, takie jak wzrost w bulionie BHI w temperaturze 37 i 41°C oraz utlenianie glutaranu i l-asparaginianu, mogą pomóc w odróżnieniu A. ursingii od A. junii i A. johnsonii (Tabela (Tabela1).1).
TABELA 1.
Testy fenotypowe do różnicowania pomiędzy A. ursingii, A. junii, i A. johnsoniia
| Test | Resultb for: | ||
|---|---|---|---|
| A. ursingii | A. junii | A. johnsonii | |
| Wzrost w 37°C w bulionie BHI | + | + | – |
| Wzrost w 41°C w bulionie BHI | – | + | – |
| Oksydacja glutaranu | + | – | – |
| Oksydacja l-asparaginianu | + | – | V |
Gatunki Acinetobacter są powszechnie izolowane ze środowiska i mogą być również izolowane od ludzi (skóra i błony śluzowe) (10). W ciągu ostatnich 2 dekad pojawiły się jako patogeny szpitalne. U osłabionych pacjentów mogą być odpowiedzialne za ciężkie i śmiertelne infekcje dróg oddechowych, dróg moczowych i ran (w tym miejsc po cewnikach). Czynniki ryzyka zakażenia obejmują poważną chorobę podstawową, taką jak nowotwór, cewnikowanie wewnątrznaczyniowe lub wewnątrzpęcherzowe, leczenie antybiotykami o szerokim spektrum działania lub kortykosteroidami, przedłużony pobyt w szpitalu oraz pobyt na oddziałach intensywnej terapii. Ze względu na przedłużone przeżycie w środowisku, gatunki Acinetobacter mogą rozprzestrzeniać się wśród pacjentów i być przyczyną szpitalnych ognisk epidemicznych (4, 11). W omawianym przypadku gruczolakorak płuc i podawanie kortykosteroidów były dwoma głównymi czynnikami ryzyka rozprzestrzeniania się A. ursingii we krwi. Chociaż A. ursingii został wyizolowany wyłącznie od ludzi, jego naturalne środowisko nie jest znane. Zakładamy, że izolat ten skolonizował skórę pacjenta i że cewnikowanie wewnątrznaczyniowe spowodowało jego rozprzestrzenienie się do krwiobiegu. Dokładna identyfikacja gatunków Acinetobacter jest ważna ze względów epidemiologicznych i terapeutycznych. Doskonalenie taksonomii i metod identyfikacji musi być brane pod uwagę przy analizie wcześniejszych badań, w których często używano nazw lub metod już nieaktualnych. Gatunki Acinetobacter biorące udział w zakażeniach u ludzi oraz ich wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe pozostają częściowo nieokreślone. A. ursingii nie był opisywany w procesach zakaźnych, poza jego niedawnym opisem jako nowego gatunku (8). Jednakże, gatunek ten może mieć takie samo znaczenie medyczne jak nasz izolat. Istotnie, spośród 29 szczepów opisanych w literaturze, 13 zostało wyizolowanych z krwi pacjentów cierpiących na ciężką chorobę podstawową. Ponadto, szczepy A. ursingii mogą potencjalnie rozprzestrzeniać się na innych pacjentów, jak wykazano w typowaniu molekularnym (7). Z tych powodów mikrobiolodzy kliniczni muszą być świadomi oportunistycznej patogenności tego nowo opisanego gatunku, który zasługuje na dalsze badania w celu określenia jego rozpowszechnienia u ludzi.