Recombinant pharmaceuticals from microbial cells: a 2015 update

Cell factories

Od wczesnych czasów rekombinacji DNA, coraz lepsze zrozumienie fizjologii komórek i stresu oraz czynników związanych z heterologiczną ekspresją genów i produkcją białek umożliwiło wykorzystanie różnych żywych fabryk, a mianowicie komórek prokariotycznych i eukariotycznych, roślin lub zwierząt. Dzięki zastosowaniu tych systemów, produkcja rekombinowana rozwiązuje problemy z dostępnością źródła, jest uważana za bio-bezpieczny i ekologiczny proces oraz daje możliwość modyfikacji sekwencji aminokwasów, a tym samym funkcji białka, w celu lepszego dostosowania produktu do pożądanej funkcji. Istnieje szerokie i rosnące spektrum systemów ekspresji, które stają się dostępne do produkcji białek rekombinowanych . Escherichia coli była dominującą platformą, gdy sektor biofarmaceutyczny pojawił się w latach 80-tych, a następnie wprowadzono drożdże Saccharomyces cerevisiae. Oba systemy i związane z nimi metodologie genetyczne wykazują niezwykle wysoką uniwersalność, dzięki czemu można je dostosować do różnych wymagań produkcyjnych. Pomimo eksploracji komórek owadzich jako początkowo udanego systemu, szczególnie dla białek szczepionkowych, linie komórkowe ssaków (przede wszystkim komórki CHO) są obecnie dominującym systemem komórkowym pochodzenia zwierzęcego ze względu na ich przydatność do produkcji białek o dogodnej glikozylacji (Rys. 1). Zdolność do przeprowadzania modyfikacji posttranslacyjnych kontrastuje ze złożonymi wymaganiami żywieniowymi, powolnym wzrostem i kruchością oraz stosunkowo wysokim czasem i kosztami produkcji. Tak więc, spośród wielu konwencjonalnych i powstających systemów komórkowych do produkcji białek, bakterie, drożdże i linie komórkowe ssaków są najbardziej rozpowszechnione w biofarmie, a zarówno systemy prokariotyczne jak i eukariotyczne stale ewoluują i konkurują w celu poprawy ich właściwości i intensyfikacji jako platformy z wyboru do produkcji leków białkowych. Chociaż bakterie straciły swoją wczesną wiodącą rolę w tej dziedzinie, około 30% sprzedawanych biofarmaceutyków jest nadal produkowanych w tym systemie, co jest poparte niezwykłą fizjologiczną i genetyczną zdolnością manipulowania komórkami prokariotycznymi .

W rzeczywistości, głównym celem w rozwoju nowych platform produkcji białek jest zwiększenie funkcjonalności leku poprzez osiągnięcie udanego składania białka i modyfikacji potranslacyjnych, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej złożoności i wysokiej elastyczności związanej z hodowlą komórek prokariotycznych. W tym kontekście bakterie Gram-dodatnie, takie jak Bacillus megaterium i Lactococcus lactis, umożliwiają wydajne wydzielanie białek przy braku endotoksycznych składników ściany komórkowej, podczas gdy grzyby filamentujące (takie jak Trichoderma reesei, ), mech (Physcomitrella patens, ) i pierwotniaki (Leishmania tarentolae, ) promują wzory glikozylacji podobne do tych w białkach ssaków, ale nadal są hodowane za pomocą prostszych metod niż te wymagane przez komórki ssaków. Obszerne opisy powstających (bakteryjnych i niebakteryjnych) platform przeznaczonych specjalnie do produkcji wysokiej jakości leków białkowych można znaleźć w innym miejscu. Niedawny rozwój wolnego od endotoksyn szczepu E. coli i jego zastosowanie do wytwarzania białek i materiałów białkowych otwiera drogę do efektywnej kosztowo i wszechstronnej produkcji białek przeznaczonych do zastosowań biomedycznych poprzez pominięcie etapów usuwania endotoksyn, co zwiększa bezpieczeństwo biologiczne i obniża koszty produkcji. Miejmy nadzieję, że wszystkie te nowe systemy wkrótce zaoferują ulepszone produkty w nadal prostych i w pełni kontrolowanych metodach biofabrykacji.

Trendy w biofarmaceutykach białkowych

Prawie 400 produktów opartych na rekombinowanych białkach zostało pomyślnie wytworzonych i zatwierdzonych jako biofarmaceutyki, termin ten odnosi się do produktów terapeutycznych wytworzonych za pomocą technologii obejmujących żywe organizmy. Trwają prace nad kolejnymi 1300 kandydatami na białka, z czego około 50 % znajduje się w fazie badań przedklinicznych, a pozostałe 33 % w fazie badań klinicznych (rys. 2). W tym kontekście można przewidzieć wzrost liczby zatwierdzeń w najbliższych latach. Humulin, rekombinowana insulina ludzka wytwarzana w bakterii E. coli, opracowana przez firmę Eli Lilly & Co w latach 70-tych, była pierwszym biofarmaceutykiem zatwierdzonym (przez FDA) w 1982 roku. Inne naturalne białka, takie jak hormony, cytokiny i przeciwciała (Orthoclone OKT3) znalazły się wśród dziewięciu pojedynczych produktów zatwierdzonych w latach 80-tych (Tabela 1). Obecnie obszarami terapeutycznymi, które w większym stopniu korzystają z biofarmaceutyków rekombinowanych, są zaburzenia metaboliczne (np. cukrzyca typu 1, typu 2, otyłość lub hipoglikemia), zaburzenia hematologiczne (np. niedokrwistość nerkopochodna, hemofilia A, zaburzenia krwawienia lub krzepnięcia) oraz onkologia (np. czerniak, rak piersi lub jelita grubego), z odpowiednio 24, 18 i 15% zatwierdzeń (ryc. 3). Pod tym względem onkologia jest wyraźnie rozwijającym się rynkiem. W latach 2010-2014 9 z 54 zatwierdzonych biofarmaceutyków było lekami przeciwnowotworowymi, a nowotwory stanowiły najczęstsze wskazanie w tym okresie. Zagłębiając się w molekularne podstawy biofarmaceutyków, można zauważyć wyraźny trend w kierunku produktów opartych na przeciwciałach. W tym samym okresie (2010-2014) 17 z 54 zatwierdzonych leków białkowych stanowiły przeciwciała monoklonalne (31,5%), w porównaniu z 11% w latach 1980-1989 . Ponadto, wśród dziesięciu najlepiej sprzedających się biofarmaceutyków białkowych na świecie w 2014 roku (tabela 2), sześć to przeciwciała lub białka pochodne od przeciwciał (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Poprzednio, biofarmaceutyki były rekombinowanymi wersjami białek naturalnych, o takiej samej sekwencji aminokwasowej jak odpowiednie wersje natywne (z niewielkimi tylko modyfikacjami, często wynikającymi ze strategii klonowania). Od lat 90-tych znaczący odsetek zatwierdzeń opiera się na wysoce zmodyfikowanych formach białek rekombinowanych. Ta nowa alternatywa, oparta na fuzji białek lub domen oraz na wersjach skróconych, oferuje szerokie spektrum możliwych kombinacji w celu uzyskania nowych biofarmaceutyków o różnych połączonych aktywnościach, które nie występują razem w naturze.

Leki białkowe w leczeniu nowotworów

Onkologia jest jednym ze wskazań terapeutycznych, które zdominowały rynek biofarmaceutyczny, ponieważ nowotwory są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Chirurgia i radioterapia są skuteczne w leczeniu raka we wczesnych stadiach choroby, jednak nie są w stanie wyeliminować choroby przerzutowej. Obecność mikroprzerzutów lub klinicznie widocznych przerzutów w momencie diagnozy wymaga ich stosowania w połączeniu z chemioterapią genotoksyczną w celu zwiększenia wskaźników wyleczalności. Niemniej jednak, sukces chemioterapii był utrudniony z powodu jej braku selektywności i specyficzności, tak że toksyczność dla normalnych tkanek ogranicza dawki, które mogłyby być podawane pacjentom. Rozwój biofarmaceutyków zdolnych do hamowania specyficznych celów molekularnych napędzających nowotwory (na przykład przeciwciała monoklonalne anty-Her2-Trastuzumab- lub anty-VEGF-Bevacizumab-) idzie w tym kierunku .

Wśród wprowadzonych na rynek biofarmaceutyków białkowych, prawie 24 % (94 produkty) jest wykorzystywanych w terapiach przeciwnowotworowych. Większość z tych produktów jest stosowana w celach wspomagających, mających na celu zminimalizowanie skutków ubocznych chemioterapii, zwykle neutropenii lub anemii (kilka reprezentatywnych przykładów przedstawiono w tabeli 3). Dziewiętnaście z tych 94 produktów to prawdziwe leki przeciwnowotworowe, z których 69% jest wytwarzanych w E. coli (ryc. 4) i opiera się na zmodyfikowanych sekwencjach aminokwasowych, fuzjach białkowych i pojedynczych domenach białkowych (tab. 4).

Wyraźnie, zmodyfikowane wersje białek są najliczniejsze w terapiach przeciwnowotworowych w porównaniu z naturalnymi polipeptydami. Jako istotne przykłady, aflibercept Ziv jest rekombinowanym białkiem fuzyjnym wytwarzanym w komórkach CHO stosowanym przeciwko rakowi jelita grubego. Składa się ono z fragmentów każdego z receptorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR1 i VEGFR2) połączonych z frakcją stałą (Fc) ludzkiej immunoglobuliny IgG1 (ryc. 5). Konstrukt ten działa jak przynęta, wiążąc się z VEGF-A, VEGF-B i łożyskowym czynnikiem wzrostu (PlGF), które aktywują VEGFR. Pułapka ta utrudnia interakcję pomiędzy czynnikami wzrostu a receptorami, hamując szlak VEGF, który jest zaangażowany w proces angiogenny. Denileukin diftitox jest rekombinowanym białkiem składającym się z dwóch fragmentów toksyny błoniczej (A i B) oraz ludzkiej interleukiny-2 (ryc. 5). Toksyna błonicza jest silnie działającą egzotoksyną wydzielaną przez Corynebacterium diphteriae. Dzięki swoistej budowie cały kompleks, produkowany w E. coli, jest zdolny do dostarczania czynnika cytotoksycznego bezpośrednio do określonego celu. Istnieją dwa główne bloki aktywne, których funkcją jest po pierwsze selektywne dostarczanie biofarmaceutyku (IL-2), a po drugie wywoływanie cytotoksyczności (toksyny A i B). Białko fuzyjne wiąże się z receptorem IL-2, który ulega ekspresji w komórkach nowotworowych (skórny chłoniak T-komórkowy). Po internalizacji cząsteczki toksyny, domena katalityczna promuje śmierć komórki poprzez hamowanie syntezy białek .

Ponieważ celowane dostarczanie leków przeciwnowotworowych jest najnowszym i rozwijającym się obszarem badań, inne nierekombinowane biofarmaceutyki oparte na białkach są również silnie reprezentowane. Obejmują one głównie koniugaty przeciwciało-lek (ADC), takie jak Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine lub koniugaty nanocząsteczka-lek, takie jak nab-paclitaxel. W tych przypadkach, odpowiednik białkowy działa jako ukierunkowany nośnik dla konwencjonalnych leków chemicznych. Ponownie, podejście to dąży do selektywnego dostarczania leków do określonych komórek docelowych, w celu zwiększenia aktywności przeciwnowotworowej przy jednoczesnym zmniejszeniu toksyczności na normalne komórki i związanych z tym skutków ubocznych.

Produkty przeciw nowotworom, które zapewniły najwyższe przychody w 2013 r., są reprezentowane na ryc. 6. Sześćdziesiąt procent tych produktów to białka rekombinowane, wspierając ideę, że produkcja białek rekombinowanych jest nadal rosnącą i obiecującą platformą, oferującą przestrzeń dla ważnych postępów w sektorze biofarmaceutycznym.

.