Regulation of acetate and acetyl-CoA converting enzymes during growth on acetate and/or glucose in the halophilic archaeon Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui tworzyła octan podczas wzrostu aerobowego na glukozie i wykorzystywała octan jako substrat do wzrostu. Na mieszaninach glukoza/octan obserwowano wzrost diauksyczny z glukozą jako preferowanym substratem. Przeanalizowano regulację aktywności enzymów związanych z metabolizmem glukozy i octanu. Stwierdzono, że zarówno dehydrogenaza glukozy (GDH), jak i syntaza acetylo-CoA tworząca ADP (ACD) były podkręcone w okresie konsumpcji glukozy i tworzenia octanu, podczas gdy syntaza acetylo-CoA tworząca AMP (ACS) i syntaza jabłczanowa (MS) były podkręcone. Odwrotnie, wzrost ACS i MS oraz spadek ACD i GDH obserwowano w okresach konsumpcji octanu. MS była również podkręcona podczas wzrostu na peptydach przy braku octanu. Z danych tych wnioskujemy, że ACD indukowana glukozą katalizuje tworzenie octanu, podczas gdy aktywacja octanu jest katalizowana przez ACS indukowaną octanem; zarówno ACS jak i MS są najwyraźniej indukowane przez octan i represjonowane przez glukozę.

1 Wstęp

Różne halofilne archaea, w tym Haloarcula marismortui, rosną na glukozie, która jest degradowana przez zmodyfikowaną, półfosforylowaną ścieżkę Entnera-Doudoroffa (ED). Wykazano, że podczas wzrostu wykładniczego na glukozie powstają znaczne ilości octanu. Ostatnie badania wskazują, że tworzenie octanu z acetylo-CoA w halofilnych archaea jest katalizowane przez syntezę acetylo-CoA tworzącą ADP (ACD) (acetylo-CoA + ADP + Pi⇆ octan + ATP + CoA). Ta niezwykła syntaza została znaleziona we wszystkich archaizujących octanach, włączając w to beztlenowe hipertermofile, i reprezentuje nowy u prokariotów mechanizm tworzenia octanu i syntezy ATP. U beztlenowych hipertermofilnych archaików, np. Pyrococcus furiosus, ACD stanowi główną reakcję zachowującą energię podczas metabolizmu cukrów, pirogronianów i peptydów. W przeciwieństwie do archetypowego mechanizmu jednoenzymowego, wszystkie bakterie wykorzystują „klasyczny” mechanizm dwuenzymowy do konwersji acetylo-CoA do octanu, obejmujący acetylotransferazę fosforanową (PTA) i kinazę octanową (AK) .

Donoszono, że niektóre haloarchaea, w tym H. marismortui, Haloferax volcanii i Halorubrum saccharovorum rosną na octanie jako substracie. Metabolizm octanu jest inicjowany przez jego aktywację do acetylo-CoA. Ostatnio dostarczyliśmy pierwszych dowodów na to, że aktywacja octanu do acetylo-CoA w haloarchaea jest katalizowana przez acetylo-CoA syntezę tworzącą AMP (ACS) (octan + ATP + CoA → acetylo-CoA + AMP + PPi). ACS jest głównym enzymem aktywującym acetat u większości organizmów wykorzystujących acetat z wszystkich trzech dziedzin życia. Tylko nieliczne bakterie, np. Corynebacterium glutamicum, a także acetoklastyczny archeon metanogenny Methanosarcina ssp. aktywują octan do acetylo-CoA poprzez parę AK/PTA. Tak więc szlak AK/PTA może działać odwracalnie in vivo, tzn. zarówno w kierunku powstawania octanu, jak i w kierunku jego aktywacji. Z kolei pierwsze analizy sugerują, że w haloarchaea ACD, archetypowy odpowiednik pary AK/PTA, działa in vivo w kierunku tworzenia octanu, chociaż enzym ten katalizuje odwracalną reakcję in vitro.

W celu dalszego wyjaśnienia roli fizjologicznej i uzyskania pierwszego wglądu w zależną od substratu regulację enzymów konwertujących octan i acetylo-CoA w haloarchaea przeprowadziliśmy eksperymenty z przesunięciem substratu z H. marismortui i analizowaliśmy wzrost na glukozie, octanie, mieszaninie glukoza/octan i peptydach. Podczas wzrostu analizowano profile aktywności enzymów konwertujących octan i acetylo-CoA, ACD i ACS, a także dehydrogenazy glukozowej, pierwszego enzymu w degradacji glukozy zmodyfikowanym szlakiem ED. Ponadto, określono aktywność syntazy jabłczanowej, jednego z kluczowych enzymów cyklu glioksylanowego, którego działanie sugeruje się u haloarchaea.

2 Materiały i metody

2.1 Wzrost H. marismortui na glukozie, octanie, mieszaninie glukozy i octanu oraz na peptydach

Haloarcula marismortui była hodowana tlenowo w temperaturze 37 °C na podłożu złożonym zawierającym ekstrakt drożdżowy, kasaminokwasy i dodatkowo glukozę i/lub octan, jak opisano wcześniej. Do wzrostu na mieszaninie glukozy i octanu podłoże to uzupełniono 12,5 mM glukozy i 30 mM octanu. Wzrost na peptydach prowadzono na podłożu kompleksowym przy braku octanu i glukozy. Eksperymenty wzrostowe prowadzono w fermentorach o pojemności 2 l (fairmen tec, Niemcy) z prędkością mieszadła 500 rpm i przepustowością sprężonego powietrza 600 ml na minutę. Wzrost śledzono poprzez pomiar gęstości optycznej przy 578 nm (ΔOD578). Wartość ΔOD578 równa 1 odpowiadała zawartości białka 0,5-0,6 mg/ml. Glukozę i octan oznaczano enzymatycznie, jak opisano w .

2.2 Przygotowanie ekstraktów komórkowych

W różnych fazach wzrostu zbierano komórki H. marismortui (100-200 ml hodowli) i przygotowywano ekstrakty komórkowe, jak opisano w . Białko oznaczano metodą Bradforda przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej jako standardu.

2.3 Określanie aktywności enzymów

Wszystkie oznaczenia enzymów wykonywano w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C w kuwetach wypełnionych 1 ml mieszaniny testowej. Enzymy pomocnicze dodawano na ogół na krótko przed rozpoczęciem reakcji i upewniano się, że enzymy te nie ograniczają szybkości reakcji. Jedną jednostkę (1 U) aktywności enzymu definiuje się jako 1 μmol substratu zużytego lub utworzonego produktu na minutę.

• Synteza acetylo-CoA (tworząca ADP) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) została zmierzona w sposób opisany w .

• Synteza acetylo-CoA (tworząca AMP) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) monitorowano jako zależne od PPi i AMP uwalnianie HSCoA z acetylo-CoA zgodnie z Srere i wsp. z odczynnikiem tiolowym Ellmana, 5′5-ditiobis (kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB), mierząc tworzenie się anionu tiofenolanowego przy 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). Mieszanina testowa zawierała 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetylo-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi i ekstrakt.

• Syntaza jabłczanowa (E.C. 4.1.3.2.) była monitorowana w zmodyfikowanym teście wg Serrano i wsp. z DTNB. Mieszanina testowa zawierała 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetylo-CoA, 0,5 mM glioksylanu i ekstrakt.

• Dehydrogenaza glukozy (E.C. 1.1.1.47) była mierzona zgodnie z Johnsen i wsp. .

• Kinazę octanową (E.C. 2.7.2.1.) zmierzono zgodnie z opisem w .

• Fosfotransacetylazę (E.C. 2.3.1.8.) monitorowano jako zależne od Pi uwalnianie HSCoA z acetylo-CoA za pomocą DTNB . Mieszanina testowa zawierała 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetylo-CoA, 5 mM KH2PO4 i ekstrakt.

3 Wyniki

Aby zbadać fizjologiczną funkcję i regulację enzymów związanych z metabolizmem octanu i acetylo-CoA, komórki H. marismortui hodowane na różnych substratach przenoszono do podłoża zawierającego odpowiednio octan i/lub glukozę oraz peptydy, a następnie analizowano profile aktywności ACD, ACS, GDH i MS.

3.1 Wzrost komórek adaptowanych do octanu na glukozie

Po fazie lag komórki rosły wykładniczo i glukoza była całkowicie zużywana. Równolegle do zużycia glukozy powstawały znaczne ilości octanu. W tym okresie wzrosła aktywność GDH i ACD, natomiast aktywność ACS i MS, które były aktywne w komórkach zaadaptowanych do octanu, została całkowicie obniżona. W fazie stacjonarnej wydalany octan był całkowicie reabsorbowany, a aktywności ACS i MS wzrastały, podczas gdy aktywności GDH i ACD spadały (Rys. 1).

3.2 Wzrost komórek glukozo-adaptowanych na octanie

Komórki glukozo-adaptowane rosły na podłożu zawierającym octan początkowo (około 30 h) z czasem podwojenia 10 h aż do osiągnięcia gęstości optycznej (ΔOD578) równej 1. W tej fazie wzrostu nie obserwowano zużycia octanu, a komórki rosły na peptydach obecnych w podłożu. Po tym okresie komórki rosły ze zmniejszoną szybkością wzrostu do ΔOD578 równej 1,8, a octan był całkowicie zużywany. Podczas konsumpcji octanu aktywność ACD i GDH spadała, natomiast wzrastała aktywność ACS i MS, których nie wykryto w komórkach adaptowanych do glukozy. Wzrost aktywności MS rozpoczął się podczas wzrostu na peptydach, podczas gdy wzrost aktywności ACS był równoległy do zużycia octanu (Rys. 2).

3.3 Wzrost na mieszaninach glukoza/octan

Komórki H. marismortui zaadaptowane do ekstraktu drożdżowego i kasaminokwasów przeniesiono na pożywkę zawierającą zarówno glukozę, jak i octan. Komórki wykazywały wzrost diauksyczny z sekwencyjnym wykorzystywaniem najpierw glukozy, a następnie octanu. W pierwszej fazie wzrostu komórki rosły do ΔOD578 równej 4,0 i zużywały glukozę. Po zużyciu glukozy i krótkiej fazie lag komórki wchodziły w drugą fazę wzrostu, w której metabolizowany był octan, a komórki rosły do końcowej wartości ΔOD578 wynoszącej 5,2. W pierwszej fazie wzrostu równolegle do konsumpcji glukozy wzrastała aktywność ACD i GDH, podczas gdy aktywność ACS nie była wykrywalna, a aktywność MS była całkowicie wyregulowana. W drugiej fazie wzrostu równolegle do utylizacji octanu wzrastała aktywność ACS i MS, a spadała aktywność ACD i GDH (Rys. 3).

3.4 Komórki zaadaptowane do glukozy na peptydach

Komórki zaadaptowane do glukozy przeniesiono na pożywkę zawierającą 0,25% ekstraktu drożdżowego i 0,5% kasaminokwasów w nieobecności zarówno glukozy jak i octanu. Komórki rosły z czasem podwajania 13 h do wartości ΔOD578 równej 2,5. Tworzenie octanu nie było wykrywalne. Podczas wzrostu wykładniczego aktywność ACD (z 60 do 20 mU/mg) i GDH (z 80 do 40 mU/mg) spadła, a aktywność MS, której początkowo nie można było wykryć, wzrosła do 20 mU/mg. Aktywność ACS nie mogła być wykryta podczas fazy wzrostu wykładniczego, ale wzrosła podczas fazy stacjonarnej (13 mU/mg).

4 Dyskusja

W tej pracy przeanalizowaliśmy fizjologiczną rolę enzymów konwertujących octan i acetylo-CoA (ACD, ACS) u H. marismortui i przedstawiliśmy pierwsze dowody na specyficzną substratową regulację tych enzymów, jak również dla GDH i MS. Dane są dyskutowane w porównaniu ze znanymi systemami bakteryjnymi.

4.1 Tworzenie octanu w H. marismortui jest katalizowane przez ACD jako część metabolizmu „przelewowego”

Podczas wzrostu na glukozie i na mieszaninie glukoza/octan, zarówno aktywność ACD jak i GDH wzrastała równolegle do faz zużycia glukozy i tworzenia octanu (Rys. 1 i 3). I odwrotnie, obie aktywności spadały podczas wzrostu na octanie lub peptydach. Dane te oraz brak AK/PTA wskazują, że powstawanie octanu u Haloarcula jest katalizowane przez ACD. Fizjologiczna rola tworzenia octanu u H. marismortui i jego regulacja podczas tlenowego wzrostu na glukozie nie jest zrozumiała; tworzenie octanu może być częścią metabolizmu „przelewowego”, który był szczegółowo badany u różnych bakterii, np. Escherichia coli i Bacillus subtilis. Podobnie jak u H. marismortui, obie bakterie wydalają octan podczas wzrostu tlenowego na nadmiarze glukozy i ponownie go wykorzystują w fazie stacjonarnej. Spekuluje się, że wydalanie octanu zachodzi w warunkach, gdy tempo glikolizy przekracza tempo kolejnych szlaków, np. cyklu kwasu cytrynowego i oddychania wymaganego do całkowitego utlenienia glukozy. W tych warunkach acetylo-CoA jest przekształcany do octanu i wydalany. Zgodnie z tym poglądem, analizy transkrypcyjne zarówno E. coli jak i B. subtilis wskazują na specyficzną dla glukozy indukcję genów glikolitycznych i represję genów cyklu kwasu cytrynowego i oddychania. Podobna specyficzna dla glukozy regulacja transkrypcji, tj. wzrost regulacji genów glikolitycznych zmodyfikowanego szlaku Entnera-Doudoroffa oraz spadek regulacji niektórych genów cyklu kwasu cytrynowego i oddychania, została ostatnio opisana u halofilnego archeona H. volcanii. Tak więc u haloarchaea prawdopodobny jest specyficzny dla glukozy metabolizm przelewowy prowadzący do powstawania octanu. Tworzenie octanu u E. coli i B. subtilis odbywa się w bakteryjnym mechanizmie dwuenzymowym poprzez PTA i AK, podczas gdy u Haloarcula jest katalizowane przez ACD, archetypowy mechanizm jednoenzymowy. Zarówno u E. coli, jak i u B. subtilis glukoza indukuje kodowanie genów pta i ack, co wskazuje na koordynację regulacji glikolizy i tworzenia octanu. Dotychczas nie analizowano regulacji transkrypcyjnej octanotwórczego ACD u archeona H. marismortui. Jednakże skoordynowana regulacja aktywności GDH i ACD sugeruje podobną, specyficzną dla glukozy regulację transkrypcyjną zarówno glikolizy przez zmodyfikowaną ścieżkę Entnera-Doudoroffa, jak i tworzenia octanu przez ACD.

Podczas wzrostu tlenowego na peptydach H. marismortui nie tworzył octanu, a aktywność ACD była obniżona. Pod tym względem Haloarcula różni się od bakterii E. coli, która tworzy znaczne ilości octanu podczas tlenowego wzrostu na peptydach w trakcie metabolizmu „overflow”. H. marismortui różni się również od beztlenowego, hipertermofilnego archeona P. furiosus i innych beztlenowych, hipertermofilnych archaea, które tworzą duże ilości octanu za pomocą ACD podczas beztlenowego wzrostu zarówno na cukrach jak i peptydach. Podczas beztlenowej fermentacji peptydów i cukrów przez P. furiosus, tworzenie octanu przez ACD stanowi główne miejsce powstawania ATP poprzez fosforylację na poziomie substratu; w przeciwieństwie do tego, podczas tlenowej degradacji cukrów i peptydów przez H. marismortui większość energii jest zachowywana przez fosforylację transportu elektronów w łańcuchu oddechowym, a zatem tworzenie octanu przez ACD jest mniej ważne lub zbędne. Tak więc tworzenie octanu przez ACD u Haloarcula wydaje się być ograniczone do metabolizmu cukrów w przebiegu „nadmiaru” metabolizmu.

4.2 Aktywacja octanu do acetylo-CoA u H. marismortui jest katalizowana przez ACS

Wnioskowano to na podstawie wzrostu aktywności ACS równolegle do zużycia octanu (Rys. 1, 2, 3). Rola ACD w aktywacji octanu może być wykluczona, ponieważ ACD jest wyregulowana w okresach konsumpcji octanu. Tak więc, ACD w Haloarcula działa in vivo tylko w kierunku tworzenia octanu. ACS jest również najczęstszym mechanizmem aktywacji octanu u bakterii, gdzie jest on ściśle regulowany; np. u E. coli i B. subtilis gen acs jest indukowany przez octan i represjonowany przez glukozę. U Haloarcula, zwiększenie aktywności ACS przez octan i zmniejszenie przez glukozę sugeruje podobną regulację na poziomie transkrypcyjnym jak u bakterii. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do E. coli i B. subtilis, bakteria C. glutamicum aktywuje octan poprzez indukowaną octanem ścieżkę AK/PTA.

Aktywność MS, kluczowego enzymu cyklu glioksylanowego, była regulowana podczas okresów konsumpcji octanu w H. marismortui razem z ACS, co sugeruje specyficzną dla octanu koordynację regulacji ACS i anaplerotycznego cyklu glioksylanowego. Zarówno aktywność MS jak i ACS była regulowana w dół przez glukozę. Skoordynowana, specyficzna dla octanu indukcja genów enzymów aktywacji octanu (patrz wyżej) i szlaku glioksylanowego została opisana dla kilku bakterii, w tym E. coli i C. glutamicum. Ostatnio pierwsze dowody na indukcję genów syntazy jabłczanowej i liazy izocyjanianowej przez octan zostały przedstawione dla halofilnego archeonu H. volcanii.

Jednakże aktywność MS, a nie ACS, była również zwiększona podczas wzrostu wykładniczego na peptydach w nieobecności octanu, co wskazuje, że regulacja MS jest bardziej złożona i nie ogranicza się do octanu. Rola MS (i cyklu glioksylanowego) w metabolizmie peptydów może być wyjaśniona przez fakt, że wiele aminokwasów jest degradowanych do acetylo-CoA, co wymagałoby funkcjonalnego szlaku glioksylanowego dla anabolizmu. Wzrost aktywności ACS, obserwowany w fazie stacjonarnej podczas wzrostu na peptydach, nie może być wyjaśniony do tej pory, może to być spowodowane ogólną odpowiedzią stresową komórek fazy stacjonarnej .

4.3 Glukozowo specyficzna represja katabolitów w H. marismortui

Haloarcula marismortui wykazała wzrost diauxic na mieszaninach glukoza/octan z glukozą jako preferowanym substratem wskazującym na pewnego rodzaju kataboliczną represję wykorzystania octanu przez glukozę. Specyficzna dla glukozy represja katabolitów nie była do tej pory analizowana u archaików. U bakterii molekularne podstawy represji katabolitu węglowego przez glukozę zostały szczegółowo zbadane, np. u E. coli i B. subtilis. Podczas wzrostu C. glutamicum na mieszaninie glukoza/octan opisano wzrost monofazowy z jednoczesnym zużyciem octanu i glukozy, podczas gdy u Azotobacter vinelandii preferowanym substratem jest octan. Zasady regulacyjne stojące za tymi cechami są obecnie badane .

Dalsze badania są niezbędne do uzasadnienia proponowanej specyficznej dla substratu regulacji enzymów tworzących octan i aktywujących octan, ACD i ACS, w odniesieniu do metabolizmu octanu i glukozy na poziomie transkrypcyjnym. Badania te, wymagające oczyszczenia i identyfikacji genów kodujących ACD i ACS z H. marismortui są w toku.

Notatki o autorze

.