Analiza kluczowych cząsteczek układu endokannabinoidowego (EC) 2-arachidonoyloglicerolu (2AG) i arachidonoylotanolamidu (anandamidu, AEA) stanowi wyzwanie ze względu na kilka osobliwości. 2AG ulega spontanicznej izomeryzacji do biologicznie nieaktywnego analogu 1-arachidonoiloglicerolu (1AG) w wyniku migracji acylowej i jest odróżnialny od 1AG jedynie chromatograficznie. Efekty matrycy spowodowane głównie przez współekstrahowane fosfolipidy mogą dodatkowo utrudniać analizę. Ponadto, 2AG i 1AG są niestabilne w pewnych warunkach, takich jak odparowanie rozpuszczalnika lub rekonstytucja wysuszonych ekstraktów. Zbadaliśmy wpływ różnych rozpuszczalników organicznych i ich mieszanin, takich jak toluen, octan etylu i chloroform-metanol, na izomeryzację 2AG/1AG, stabilność 2AG/1AG oraz efekty matrycy w analizie UPLC-MS/MS 2AG i AEA w ludzkim osoczu. Toluen zapobiegał zarówno izomeryzacji 2AG do 1AG, jak i degradacji 2AG/1AG podczas odparowywania. Ekstrakty toluenowe zawierają tylko 2% fosfolipidów osocza powodujących efekt matrycy w porównaniu do ekstraktów z tradycyjnie stosowanej mieszaniny rozpuszczalników chloroform-metanol. Toluen i wszystkie inne testowane rozpuszczalniki organiczne zapewniają porównywalną wydajność ekstrakcji 2AG i AEA (60-80%). W oparciu o te korzystne właściwości toluenu, opracowaliśmy i zwalidowaliśmy metodę UPLC-MS/MS z dodatnią jonizacją elektrospray (ESI+), która pozwala na jednoczesny dokładny i precyzyjny pomiar 2AG i AEA w ludzkim osoczu. Metoda UPLC-MS/MS została zwalidowana krzyżowo z wcześniej opisaną w pełni zwalidowaną metodą GC-MS/MS dla AEA w ludzkim osoczu. Stwierdzono ścisłą korelację (r(2)=0,821) pomiędzy wynikami uzyskanymi metodami UPLC-MS/MS (y) i GC-MS/MS (x) (y=0,01+0,85x). Metoda UPLC-MS/MS jest odpowiednia do rutynowych pomiarów 2AG i AEA w próbkach ludzkiego osocza (1 mL) w warunkach klinicznych, co wykazano na podstawie próbek osocza z kontroli jakości, przetwarzanych przez okres 100 dni. Metoda UPLC-MS/MS została następnie rozszerzona na ludzki mocz. W moczu, AEA nie była wykrywalna, a 2AG wykryto tylko w 3 z 19 próbek od zdrowych osób przy 160, 180 i 212 pM odpowiadających odpowiednio 12.3, 14.5 i 9.9 pmol/mmol kreatyniny.