- Abstract
- 1. Wprowadzenie
- 2. Doświadczalna
- 2.1. Chemicals and Reagents
- 2.2. Instrumentacja HPTLC
- 2.3. Preparation of Stock Standard
- 2.4. Badanie liniowości
- 2.5. Przygotowanie roztworu próbki
- 2.6. Walidacja metody
- 2.6.1. Precyzja
- 2.6.2. Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ)
- 2.6.3. Specyficzność
- 2.6.4. Odporność
- 2.6.5. Dokładność
- 2.6.6. Solidność
- 2.7. Wymuszona degradacja tiokolchickozydu
- 2.7.1. Hydroliza kwasowo-zasadowa
- 2.7.2. Degradacja oksydacyjna
- 2.7.3. Degradacja w suchym cieple
- 2.7.4. Degradacja fotograficzna
- 3. Wyniki i dyskusja
- 3.1. Development of Optimum Mobile Phase
- 3.2. Krzywa kalibracji
- 3.3. Walidacja metody
- 3.4. Analiza preparatu wprowadzonego do obrotu
- 3.5. Stabilność – właściwości wskazujące
- 3.5.1. Degradacja kwasowa
- 3.5.2. Degradacja zasadowa
- 3.5.3. Degradacja oksydacyjna
- 4. Wnioski
- Konflikt interesów
- Podziękowania
Abstract
A new stability-indicating reversed-phase high-performance thin-layer chromatographic (RP-HPTLC) method for densitometric analysis of thiocolchicoside was developed and validated. Chromatogramy opracowano przy użyciu płytek aluminiowych wstępnie pokrytych żelem krzemionkowym 60 RP-18 F254S jako fazą stacjonarną i metanolem : wodą (70 : 30 ) jako fazą ruchomą. Zwarte pasmo dla tiokolchikozydu zaobserwowano przy wartości długości fali absorpcji 377 nm. Stwierdzono liniową regresję danych dla działek kalibracyjnych () w odniesieniu do powierzchni piku w zakresie stężeń 100-600 ng na pasmo. Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) wynosiły odpowiednio 9,77 ng i 29,63 ng. Lek poddawano kwaśnej i zasadowej hydrolizie, utlenianiu, fotodegradacji i działaniu suchego ciepła. Piki produktów degradacji były dobrze rozdzielone od pików leku standardowego i różniły się istotnie. Analiza statystyczna wykazała, że opracowana metoda RP-HPTLC jest powtarzalna, selektywna i dokładna do oznaczania tiokolchicydu w preparatach. Metoda może skutecznie oddzielić lek od produktów jego degradacji i może być uważana za oznaczenie wskazujące na stabilność.
1. Wprowadzenie
Tiokolchicozyd jest chemicznie 2-demetoksy-2-glukozydoksytykolchicyną (Rysunek 1) . Tiokolchicozyd jest półsyntetyczną pochodną siarki kolchicydu, naturalnie występującego glukozydu obecnego w roślinie Gloriosa superba. Klinicznie, tiokolchicozyd jest stosowany jako środek rozluźniający mięśnie, przeciwzapalny i przeciwbólowy. Niewiele metod LC-MS-MS zostało ustalonych dla oceny biorównoważności tiokolchicozydu jako pojedynczego składnika i w tabletce kombinowanej o stałej dawce z lornoksykamem .
Niektóre metody analityczne, takie jak LC-ESI-MS RP-HPLC i UV-Spektrofotometryczne, zostały ustanowione w celu oznaczenia samego tiokolchicydu w preparatach masowych i farmaceutycznych.
Tiokolchicozyd jest dostępny w połączeniu z wieloma innymi lekami; dlatego kilka metod, takich jak UV-Spektrofotometryczna, RP-HPLC i HPTLC zostało zbadanych w celu oznaczenia tiokolchicozydu w połączonych formach dawkowania.
Wytyczne Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji (ICH) zatytułowane „Badania stabilności nowych substancji i produktów leczniczych” wymagają, aby badania wytrzymałościowe mogły być przeprowadzone w celu wyjaśnienia właściwości stabilności substancji czynnej. Idealna metoda wskazująca stabilność to taka, która pozwala na rozdzielenie leku standardowego, jak również produktów jego degradacji. W związku z tym należy opracować wiarygodną i szybką metodę oznaczania, która mogłaby być również wykorzystana do uzyskania optymalnego oddzielenia składników degradacji od związku macierzystego. Jednakże, zgodnie z naszą wiedzą, w literaturze nie pojawił się żaden artykuł dotyczący oznaczania tiokolchickozydu metodą RP-HPTLC wskazującą na jego stabilność. Celem pracy opisanej w niniejszym artykule jest ustalenie warunków identyfikacji i analizy ilościowej tiokolchicydu w obecności produktów jego degradacji dla oceny czystości leku luzem i stabilności jego postaci dawkowych. Przydatność metody RP-HPTLC wskazującej stabilność do ilościowego oznaczania tiokolchickozydu została potwierdzona walidacją zgodnie z wymaganiami wytycznych ICH .
2. Doświadczalna
2.1. Chemicals and Reagents
Thiocolchicoside was obtained as a gift sample from Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, Indie. HPLC grade methanol, HCl, NaOH, and H2O2 were purchased from Merck Chemicals, India.
2.2. Instrumentacja HPTLC
Standard leku i próbki były nakrapiane w postaci pasm o szerokości 6 mm za pomocą mikrostrzykawki CAMAG Linomat (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Szwajcaria) przy użyciu aplikatora CAMAG Linomat 5 próbek (CAMAG Muttenz, Szwajcaria) ze stałą szybkością nakładania, 150 nL na sekundę. Przed chromatografią płytki były wstępnie przemywane metanolem i aktywowane w temperaturze 100°C przez 10 min. Chromatografię przeprowadzono na płytkach aluminiowych wstępnie pokrytych żelem krzemionkowym 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Niemcy). Wzrastający liniowo rozwój przy użyciu metanolu: wody (70 : 30 v/v) jako fazy ruchomej przeprowadzono w szklanej komorze o wymiarach 20 × 10 cm z podwójnym korytkiem (CAMAG Muttenz, Szwajcaria). Zoptymalizowany czas nasycania komory fazą ruchomą wynosił 30 min w temperaturze pokojowej (28 ± 2°C). Długość przebiegu chromatogramu wynosiła około 80 mm. Czas wywoływania płytki wynosił 25 min. Po rozwinięciu płytki były suszone w strumieniu powietrza za pomocą suszarki powietrznej. Następnie przeprowadzono detekcję plamek przy długości fali 377 nm za pomocą skanera CAMAG TLC Scanner 3 w trybie absorbancji obsługiwanego przez oprogramowanie winCATS w wersji 1.3.0. Źródłem promieniowania była lampa deuterowa. Wymiary szczeliny wynosiły 6 mm × 0,45 mm, a prędkość skanowania 20 mm na sekundę.
2.3. Preparation of Stock Standard
Stock standard solution of 1 mg/mL of thiocolchicoside in methanol.
2.4. Badanie liniowości
Statystyczny roztwór wzorcowy w zakresie od 0,2 do 1,2 mL przeniesiono do sześciu oddzielnych kolb miarowych o pojemności 10 mL, a objętość uzupełniono metanolem. Z każdego z powyższych roztworów nanoszono po 5 μL na płytki RP-HPTLC w celu uzyskania stężenia w zakresie od 100 do 600 ng na pasmo. Wykres kalibracyjny dla metody został skonstruowany jako powierzchnia piku w stosunku do stężenia leku.
2.5. Przygotowanie roztworu próbki
Aby określić zawartość tiokolchicydu w kapsułce, zważono dwadzieścia kapsułek (MYORIL, informacja na etykiecie: 8 mg tiokolchicydu w kapsułce); usunięto zawartość kapsułek i określono średnią masę. Ilość odpowiadającą 8 mg tiokolchikozydu przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 100 mL zawierającej 50 mL metanolu i poddawano sonikacji przez 10 min; objętość dostosowano do znaku i przefiltrowano przy użyciu bibuły filtracyjnej Whatmann nr 41. Objętość 5 mL rozcieńczano metanolem do 10 mL; otrzymany roztwór w ilości 5 μL nanoszono na płytkę RP-HPTLC w celu oznaczenia tiokolchicydu. Płytki wywoływano i skanowano w sposób opisany powyżej.
2.6. Walidacja metody
Metoda została zwalidowana pod względem następujących parametrów zgodnie z wytycznymi ICH.
2.6.1. Precyzja
Powtarzalność nanoszenia próbki i pomiar powierzchni piku przeprowadzono przy użyciu sześciu powtórzeń stężenia badanego (400 ng tiokolchicydu na pasmo). Zmienność wewnątrz- i międzydobowa dla oszacowania tiokolchickozydu została przeprowadzona przy użyciu trzech replik na trzech różnych poziomach stężenia (200, 300 i 500 ng na pasmo).
2.6.2. Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ)
W celu określenia granicy wykrywalności i oznaczalności zastosowano stężenia tiokolchikozydu w dolnej części zakresu liniowego krzywej kalibracyjnej. Z podstawowego roztworu wzorcowego tiokolchicozyd w ilościach 100, 120, 140, 160, 180 i 200 ng na pasmo nanoszono w trzech powtórzeniach na płytkę RP-HPTLC i obliczano LOD i LOQ, stosując następujące równania: gdzie „” jest odchyleniem standardowym powierzchni pików leków (), przyjmowanym jako miara szumu, a „” jest nachyleniem odpowiedniej krzywej kalibracyjnej.
2.6.3. Specyficzność
Specyficzność metody sprawdzono poprzez analizę wzorca leku i próbki. Pasmo dla tiokolchikozydu w próbce zostało potwierdzone przez porównanie wartości i widm pasma z wartościami i widmami wzorca leku. Czystość szczytowa tiokolchikozydu została potwierdzona przez porównanie widm na trzech różnych poziomach, to znaczy, na pozycjach peak-start (), peak-apex () i peak-end () pasma.
2.6.4. Odporność
Odporność metody została przeprowadzona przez analizę 400 ng tiokolchikozydu przez dwóch różnych analityków przy zachowaniu tych samych warunków doświadczalnych i środowiskowych.
2.6.5. Dokładność
Na płytkę naniesiono dziewięć pasm roztworu próbki tiokolchickozydu (200 ng na pasmo), a następnie naniesiono znaną ilość tiokolchickozydu w trzech egzemplarzach w stężeniu 80, 100 i 120% (160, 200 i 240 ng na pasmo) stężenia próbki (200 ng na pasmo) i ponownie zanalizowano proponowaną metodą. Przeprowadzono to w celu oceny badania odzysku leku na różnych poziomach w preparatach.
2.6.6. Solidność
Poprzez wprowadzenie niewielkich modyfikacji składu fazy ruchomej, ilości fazy ruchomej, czasu od nałożenia do rozwinięcia i czasu od rozwinięcia do skanowania zbadano wpływ na wyniki. Wypróbowano fazy ruchome o różnych składach metanol: woda (72 : 28 v/v) i metanol: woda (68 : 32 v/v) i wykonano chromatogramy. Przed chromatografią płytki przemywano metanolem i aktywowano w temperaturze 80 ± 5°C przez 2, 5 i 8 minut. Odporność metody oceniano stosując sześć powtórzeń tej samej plamki (400 ng tiokolchikozydu na pasmo).
2.7. Wymuszona degradacja tiokolchickozydu
2.7.1. Hydroliza kwasowo-zasadowa
Dokładnie odważoną ilość 10 mg tiokolchicydu rozpuszczono oddzielnie w 10 mL metanolowego roztworu odpowiednio 1,0 M HCl i 0,5 M NaOH i skraplano przez 30 min w 60°C w ciemności, aby uniknąć prawdopodobnego degradującego działania światła. Z powyższych roztworów pobierano oddzielnie po 1,0 mL, neutralizowano i rozcieńczano metanolem do 10 mL. Otrzymane roztwory nanoszono na płytki RP-HPTLC w trzech powtórzeniach (po 5 μL każdy, tj. 500 ng na pasmo). Chromatogramy wywoływano i skanowano w sposób opisany powyżej.
2.7.2. Degradacja oksydacyjna
Do degradacji oksydacyjnej, dokładnie odważoną ilość 10 mg tioklochicozydu rozpuszczono oddzielnie w 10 mL metanolowego roztworu 1% v/v H2O2 i 3% v/v H2O2, odpowiednio, i trzymano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min. Po 30 min pobierano po 1,0 mL z każdego z powyższych roztworów i rozcieńczano metanolem do 10 mL. Otrzymane roztwory nanoszono na płytki RP-HPTLC w trzech egzemplarzach (po 5 μL, tj. 500 ng na pasmo). Chromatogramy wywoływano i skanowano w sposób opisany powyżej.
2.7.3. Degradacja w suchym cieple
Dokładnie zważoną ilość 10 mg tiokolchicydu przechowywano w temperaturze 70°C przez 8 godzin w piecu. Przeniesiono ją do kolby miarowej o pojemności 10 mL zawierającej metanol i uzupełniono objętość do kreski. Pobrano 1.0 mL powyższego roztworu i rozcieńczono metanolem do 10 mL. Otrzymany roztwór nanoszono na płytkę RP-HPTLC w trzech egzemplarzach (po 5 μL każdy, tj. 500 ng na pasmo). Chromatogram rozwijano i skanowano w sposób opisany powyżej.
2.7.4. Degradacja fotograficzna
Dokładnie odważoną ilość 10 mg tiokolchickozydu rozpuszczono w 10 mL metanolu i roztwory przechowywano przez okres 24 h na świetle. Odpowiednia objętość 1.0 mL powyższego roztworu została pobrana i rozcieńczona do 10 mL metanolem. Otrzymany roztwór nanoszono na płytkę RP-HPTLC w trzech egzemplarzach (po 5 μL każdy, tj. 500 ng na pasmo). Chromatogram opracowano i zeskanowano w sposób opisany powyżej.
3. Wyniki i dyskusja
3.1. Development of Optimum Mobile Phase
Aby wybrać odpowiednią fazę ruchomą do rozdzielania tiokolchicydu, wykonano kilka przebiegów z zastosowaniem faz ruchomych zawierających rozpuszczalniki o różnej polarności, przy różnych poziomach stężenia. Spośród różnych zastosowanych kombinacji faz ruchomych, faza ruchoma składająca się z metanolu: wody (70 : 30 v/v) dała ostry i dobrze określony pik o wartości 0,60 ± 0,02 (rysunek 2). Dobrze wyraźne pasma występowały, gdy komora była nasycona fazą ruchomą przez 30 min w temperaturze pokojowej.
3.2. Krzywa kalibracji
Dane regresji liniowej dla krzywych kalibracji () wykazały dobrą liniową zależność w zakresie stężeń 100-600 ng na pasmo. Stwierdzono, że równanie regresji liniowej wynosi , = 0,9984 (rysunek 3).
3.3. Walidacja metody
Opracowana metoda została zwalidowana zgodnie z wytycznymi ICH. . Badania odzysku przeprowadzono przy 80%, 100% i 120% stężenia badanego, zgodnie z wytycznymi ICH. Stwierdzono, że % odzysk tiokolchickozydu na wszystkich trzech poziomach mieści się w zakresie 99,92-100,04%. Ilości dodanego i oznaczonego leku oraz % odzysku przedstawiono w (Tabela 2). Czystość szczytową tiokolchikozydu potwierdzono, oceniając badania widm w pozycjach: szczyt-początek, szczyt-apex i szczyt-koniec pasma, czyli (, ) = 0,9995 i (, ) = 0,9986, co świadczy o specyficzności metody (rysunek 4). Uzyskano dobrą korelację ( = 0,9989) pomiędzy wzorcem leku a lekiem wyekstrahowanym z preparatu kapsułkowego. Wytrzymałość metody badano eksperymentalnie, dokonując celowych zmian w warunkach chromatograficznych i obserwując wpływ na chromatogram. Odchylenie standardowe powierzchni pików obliczono dla każdego parametru i stwierdzono, że % RSD jest mniejszy niż 2%. Niskie wartości % RSD wskazują na odporność metody; wyniki przedstawiono w (Tabela 3). Odporność metody została zweryfikowana przez różnych analityków i stwierdzono, że %RSD wynosi 0,57 i 0,58, co wskazuje, że metoda jest odporna. Tiokolchicozyd wyekstrahowany z preparatu w kapsułkach wykazał pojedynczą plamkę o wartości = 0,60 ± 0,02 w chromatogramie. Średnia % zawartość leku wynosiła 100,27% wartości podanej na etykiecie przy 0,88% RSD. Wymuszona degradacja tiokolchickozydu w 1,0 M HCl (60°C przez 30 min) okazała się niestabilna i wykazała dwa dodatkowe piki przy wartościach 0,33 i 0,71 (Rysunek 5(a)). Plamy produktów degradacji były dobrze oddzielone od plam tiokolchicydu. . Tiokolchicozyd okazał się niestabilny podczas hydrolizy zasadowej w 0,5 M NaOH w 60°C przez 30 min. Lek wykazał jeden dodatkowy pik o wartości 0,72, podczas gdy tiokolchicozyd pozostał na poziomie 0,60 (Rysunek 5(b)). Plamki produktów rozkładu były dobrze oddzielone od plamek leku. Tiokolchicozyd posiada atom siarki, który jest bardziej podatny na utlenianie przez H2O2. Po poddaniu tiokolchickozydu działaniu 1% v/v H2O2 zaobserwowano trzy dodatkowe piki o wartościach 0,38, 0,46 i 0,70, przy czym tiokolchickozyd pozostał na poziomie 0,60 (rysunek 5(c)). W degradacji oksydacyjnej przy użyciu 3% v/v H2O2 tiokolchicozyd uległ całkowitej degradacji, w wyniku czego powstały dwa główne piki o wartościach odpowiednio 0,58 i 0,64 oraz jeden pik o wartości 0,70 (rysunek 5(d)). Widma szczytowo-czystości tiokolchickozydu odzyskanego po degradacji w 1 M HCl, 0,5 M NaOH i 1% v/v H2O2 oraz wzorca tiokolchickozydu zeskanowanego w pozycjach szczyt-początek, szczyt-apex i szczyt-koniec plamki są przedstawione na (rysunek 6). Wyniki badań w warunkach skrajnych wykazały, że metoda była wysoce specyficzna dla tiokolchickozydu. Produkty degradacji były całkowicie zauważalne w porównaniu ze związkiem macierzystym. Nie zidentyfikowano rozkładu przy ekspozycji roztworu leku na światło słoneczne podczas fotodegradacji i degradacji termicznej, co wskazuje na stabilność leku w obu warunkach. Wyniki badań wymuszonej degradacji tiokolchikozydu zestawiono w tabeli 4. W niniejszym badaniu przeprowadzono wymuszoną degradację tiokolchickozydu w celu wyjaśnienia jego nieodłącznej stabilności chemicznej. W tym celu opracowano metodę RP-HPTLC. Opracowana metoda okazała się prosta, szybka, selektywna, czuła i odpowiednia do oznaczania tiokolchickozydu w materiale sypkim i preparatach kapsułkowych. Podczas badań stwierdzono, że tiokolchicozyd jest podatny na hydrolizę kwasową i zasadową oraz utlenianie. Ponieważ metoda ta jest metodą stabilną, może być stosowana do określania czystości leku dostępnego z różnych źródeł poprzez wykrywanie związanych z nim zanieczyszczeń. Poza tym, można stwierdzić, że zanieczyszczenia obecne w leku mogą być spowodowane hydrolizą lub utlenianiem podczas przetwarzania i przechowywania leku. Autorzy nie deklarują konfliktu interesów. Autorzy są wdzięczni R. C. Patel Institute of Pharmaceutical Education and Research, Shirpur (M.S.), Indie, za zapewnienie wymaganych udogodnień do przeprowadzenia tej pracy badawczej. .
Parametry
Stężenie (ng na pasmo)
% Ilość znaleziona
% RSD
Repeatability ()
400
99.39
0,61
Intraday ()
200
100,73
0,64
300
99.83
0.78
500
99.18
0.32
Środek dnia ()
200
100,80
1,43
300
99,65
0.70
500
99,91
0,50
: liczba oznaczeń.
Lek
Ilość początkowa (ng na pasmo)
Ilość dodanego wzorca leku (%)
% Lek odzyskany ()
% R.S.D. ()
Tiokolchicozyd
200
80
99,92
0,74
100
100,04
0.88
120
99,97
0,46
: liczba oznaczeń.
Parametr
± S.D. powierzchni piku ()
% R.S.D. ()
Skład fazy ruchomej (±2 mL)
32.38
0.73
Liczba fazy ruchomej (±5%)
37,31
0,84
Czas od nałożenia do rozwinięcia (±10 min)
24.72
0.55
Czas od opracowania do skanowania (±10 min)
36.77
0.82
Aktywacja płytek TLC
34,40
0,77
: liczba oznaczeń.
3.4. Analiza preparatu wprowadzonego do obrotu
3.5. Stabilność – właściwości wskazujące
3.5.1. Degradacja kwasowa
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)(d)
(d) 3.5.2. Degradacja zasadowa
3.5.3. Degradacja oksydacyjna
Warunki stresu
Temperatura
% Odzysk ()
Tiokolchicozyd
szczyt-.1
szczyt-2
szczyt-3
1.0 M HCl
60°C
78,00 (0,60)
8,22 (0,33)
13,78 (0,71)
0,5 M NaOH
60°C
85 (0.60)
15 (0.72)
–
–
1% v/v H2O2
RT
67.50 (0.60)
2.18 (0.38)
10.20 (0.46)
20.12 (0.70)
Fotodegradacja światło dzienne (8 h/dzień)
RT
92.94 (0,60)
–
–
Suche ciepło
70°C
98.12 (0,60)
–
–
–
RT: Room Temperature.
4. Wnioski
Konflikt interesów
Podziękowania