Acetylocholina jest syntetyzowana z acetylo koenzymu A i choliny przez enzym acetylotransferazę choliny. W układzie nerwowym uważa się, że enzym ten występuje głównie w cytoplazmie terminala nerwowego. Koenzym A jest syntetyzowany w mitochondriach, a dostęp do acetylotransferazy cholinowej uzyskuje po przetransportowaniu przez błonę mitochondrialną do cytoplazmy. Oprócz syntezy w wątrobie, cholina wykorzystywana do produkcji acetylocholiny pochodzi ze źródeł pokarmowych. W komórkach śródbłonka naczyń włosowatych znajduje się system nośnikowy, który odpowiada za transport choliny w postaci wolnej i fosfolipidowej do mózgu. Hydroliza fosfolipidów zawierających cholinę może również uwalniać cholinę, która jest wykorzystywana w syntezie acetylocholiny. Ponieważ acetylotransferaza choliny nie jest nasycana przez stężenia acetylo-koenzymu A i choliny, które szacuje się, że są obecne w terminalu nerwowym, wydaje się, że szybkość syntezy acetylocholiny zależy od dostępności prekursorów. Aktywność enzymu jest również regulowana przez inhibicję produktu; poprzez wiązanie się w miejscu allosterycznym na acetylotransferazie choliny, acetylocholina hamuje jej aktywność. Ponadto działanie masowe i aktywność neuronów wpływają na szybkość powstawania acetylocholiny. Krótkotrwała regulacja aktywności enzymu odbywa się częściowo poprzez fosforylację indukowaną przez kinazy białkowe. Nie ma bardzo specyficznych i silnych inhibitorów tego enzymu i należy zauważyć, że farmakologiczna blokada tego etapu (np. za pomocą naftylowinylopirydyny) w cyklu życiowym acetylocholiny daje mniej głęboki efekt na transmiter niż hamowanie transportu choliny.
Specyficzny transporter acetylocholiny o niskim powinowactwie jest odpowiedzialny za wychwyt transmitera z cytoplazmy do pęcherzyków. Geny dla acetylotransferazy choliny i pęcherzykowego transportera acetylocholiny są zorganizowane w jednym locus genowym, a transkrypcja tych dwóch genów jest zwykle współregulowana. (±)-wezamikol jest selektywnym inhibitorem tego transportera, przy czym L-(-)-wezamikol jest silniejszy niż D-(+)-wezamikol. Po zapakowaniu do pęcherzyków acetylocholina podlega indukowanemu bodźcem uwalnianiu na drodze egzocytozy. Kilka silnych toksyn wpływa na uwalnianie acetylocholiny, zwłaszcza toksyna botulinowa, która hamuje jej uwalnianie.
Neuronalna acetylocholinoesteraza bardzo szybko inaktywuje większość acetylocholiny uwalnianej w mózgu, chociaż butyrylocholinoesteraza zawarta w komórkach glejowych może hydrolizować niewielką część acetylocholiny w synapsie. Na obwodzie acetylocholinoesteraza jest obecna w mięśniach unerwionych cholinergicznie, natomiast butyrylocholinoesteraza jest szerzej rozpowszechniona. Znanych jest szereg odwracalnych (np. fizostygmina, BW284C51) i nieodwracalnych (np. izo-OMPA) inhibitorów acetylocholinoesterazy, których efektem jest przedłużenie synaptycznego działania acetylocholiny. Odwracalne antycholinesterazy drugiej generacji, takie jak donepezil, rywastygmina (ENA 713), eptastygmina i galantamina (galantamina) są stosowane w leczeniu choroby Alzheimera. Niektóre cholinesterazy drugiej generacji zostały wycofane z użycia klinicznego ze względu na niedopuszczalne działania niepożądane (np. takryna, metrifonat). Nieodwracalne inhibitory acetylocholinoesterazy są stosowane jako środki owadobójcze i chemiczne środki bojowe. Cholina, która jest uwalniana z acetylocholiny przez acetylocholinoesterazę, jest pobierana z powrotem do zakończeń cholinergicznych przez transporter o wysokim powinowactwie i ponownie wykorzystywana w syntezie przekaźnika. Hemicholinium-3 silnie i odwracalnie hamuje transport choliny, a to powoduje głębokie zmniejszenie tworzenia acetylocholiny. W przeciwieństwie do hemicholiny-3, A-4 (bis 4-metylopiperydynowy analog HC-3) jest aktywny po podaniu obwodowym. Analogi choliny w postaci musztardy azotowej są silnymi, nieodwracalnymi inhibitorami wychwytu choliny o wysokim powinowactwie.