Synthesis and Inhibiting Activity of Some 4-Hydroxycoumarin Derivatives on HIV-1 Protease

Rysunek 5

Dodanie Michaela 4-hydroksykumaryny i 3-(4-hydroksy)fenylometyleno-2,4-pentanedionu (6).

2.2. Docking molekularny

Badano interakcję proteazy HIV-1 metodą dockingu molekularnego z niektórymi nowo zsyntetyzowanymi pochodnymi 4-hydroksykumaryny. Dane doświadczalne dotyczące aktywności niektórych 4-hydroksykumaryn zostały użyte do porównania.

Wstępne dokowanie molekularne przeprowadzono w oparciu o znane pochodne 4-hydroksykumaryny, które wykazują aktywność hamującą proteazę HIV-1 (Tabela 1) . Siatka została dobrana tak, aby przewymiarować ligand, który jest wcześniej związany z enzymem (w tym przypadku wybrano siatkę o rozmiarze 7 Å).

Wartości funkcji 𝐺-score i E-model zostały uzyskane tą metodą. Nazywa się je funkcjami scoringowymi i są one abstrakcyjnymi odpowiednikami funkcji Δ𝐺bind. Funkcje te uwzględniają energię swobodną wynikającą z wpływu rozpuszczalnika, zmian konformacyjnych w białku i ligandzie, oddziaływań pomiędzy białkiem i ligandem (wiązania wodorowe, oddziaływania jonowe, siły van der Waalsa), stratę energii swobodnej na zamrożenie wewnętrznej rotacji białka i liganda, stratę energii swobodnej na translację i rotację, spowodowaną asocjacją dwóch cząsteczek oraz energię swobodną wynikającą ze zmian trybu wibracyjnego (zwykle ignorowaną). Jeśli wartości te są bardziej ujemne dla jednego liganda, oznacza to, że zdolność wiązania tego liganda jest lepsza. Gdy ligand wykazuje zdolność wiązania w jednej ustalonej konformacji, program pokazuje to jako „dobrą pozycję”.

Ezym ten składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych i należy do rodziny proteaz aspartylowych z dwiema resztami asparaginianowymi leżącymi w dolnej części miejsca aktywnego. Wykorzystano strukturę krystalograficzną retrowirusowej proteazy HIV-1, związanej z peptydomimetycznym inhibitorem BEA369 z Protein Data Bank o kodzie pdb 1EBY.

Można stwierdzić, że ligand (1) ma najsilniejszą zdolność wiązania się z proteazą HIV-1. Wyniki dokowania molekularnego potwierdzają dane eksperymentalne dotyczące liganda (1).

W odniesieniu do ligandów (1)-(5), wartości 𝐺-score oraz E-model z dokowania molekularnego, dla grupy badanych związków, przedstawiono w tabeli 2.

Oddziaływania pomiędzy badanymi pochodnymi 4-hydroksykumaryny a miejscami aktywnymi enzymu proteazy HIV-1 realizowane są poprzez wiązanie wodorowe oraz oddziaływania van der Waalsa. Przykładowo, najbardziej aktywnym związkiem, o najlepszej aktywności wiązania, jest związek (10), według ligandów (1)-(4) (na podstawie wartości funkcji scoringowych). Fakt ten wynika prawdopodobnie z tworzenia się wiązań wodorowych pomiędzy atomem tlenu pyranu, tlenem karbonylowym laktonu oraz jedną z grup hydroksylowych (w metapozycji) przyłączoną do pierścienia aromatycznego od strony łańcucha bocznego. Siły przyciągania van der Waalsa również przyczyniają się do dobrego wiązania. Według liganda (5), najbardziej aktywny jest związek (7). Dla związku (7) występują dwa wiązania wodorowe z udziałem atomu tlenu pyranu, karbonylowego atomu tlenu z pierścienia laktonowego oraz jednego i odpowiadających im fragmentów białka. Istotne znaczenie dla wiązania mają przyciągające oddziaływania van der Waalsa, w których prawdopodobnie uczestniczy grupa m-nitrowa z jednym z jej atomów tlenu. Związek (7) wydaje się być bardziej aktywny niż ligandy eksperymentalne.

2.3. Aktywność biologiczna w hodowli komórkowej (MT-4 Cells)

Po wykazaniu aktywności niektórych pochodnych 4-hydroksykumaryny wobec wyizolowanego HIV-PR w eksperymentach dokowania molekularnego, interesujące byłoby dalsze testowanie ich na zakażonych HIV-1 komórkach MT-4. Ocenę efektu anty-HIV przeprowadzono za pomocą szybkiego i czułego testu mikrotitracyjnego in vitro, opartego na ilościowym oznaczaniu cytolizy przy użyciu barwnika witalnego (MTT) jako punktu końcowego infekcji. Dodatkowo, wpływ inhibitorów na aktywność endogennej odwrotnej transkryptazy (RT) supernatantów MT-4 zakażonych HIV-1 III B był uważany za marker zdolności do blokowania replikacji HIV-1. Komórki MT-4 zakażano i inkubowano z każdym inhibitorem przez 72-96 godzin, a następnie mierzono aktywność RT w supernatantach komórkowych zgodnie z wytycznymi w teście HS-Lenti Kit-RT assay (Cavidi, Szwecja). Przeprowadzono również badanie bezpośredniego wpływu nowo zsyntetyzowanych 4-hydroksykumaryn na egzogenną rekombinowaną RT (rRT). Ponadto, wszystkie związki testowano pod kątem aktywności anty-HIV-1 PR. Tabela 3 przedstawia wyniki oznaczeń infekcji mikrotitracyjnej z użyciem MTT i hamowania aktywności HIV-1 PR. Eksperymenty przeprowadzono w maksymalnym nietoksycznym stężeniu (MNC) dla każdego związku.

Po pierwsze, widać, że związki (8), (7) i (12) mają wyższe MNC, co oznacza, że są bardziej cytotoksyczne niż pozostałe trzy związki. Tylko dwa z nich (10) i (7) hamowały replikację wirusa w komórkach MT-4, przy czym inhibicja wywołana przez (7) była znacząca (78%). Stosując 10-krotne rozcieńczenia wirusów, ustalono, że IC50 wynosi 0,01 nM. Żaden związek nie wykazywał działania zarówno na endogenną, jak i egzogenną RT. Oznacza to, że RT nie była celem działania przeciwwirusowego. Zgodnie z przewidywaniami badań dokowania molekularnego, aktywność HIV-1 PR była hamowana w 24-25% przez (7) (wykonano 5 oddzielnych ocen). Niezgodność stwierdzona dla (7) pomiędzy danymi dotyczącymi hamowania infekcyjności (ok. 75%) i aktywności proteazowej (25%) może być wyjaśniona inną aktywnością, np. antyintegracyjną. Dobrze wiadomo, że niektóre pochodne 4-hydroksykumaryny są inhibitorami integrazy.

Doświadczenia opisane w tej pracy rozszerzają wcześniejsze doniesienia, że pochodne 4-hydroksykumaryny mogą służyć jako nowe niepeptydowe PI. Podobnie jak tipranawir i darunawir, mogą one być skuteczne u pacjentów z rozwiniętą opornością na peptydowe PI. Szczególnie, (7) może być dalej wykorzystany jako farmakofor do syntezy nowych, bardziej aktywnych pochodnych wobec proteazy HIV-1.

3. Wnioski

Sześć związków 4-hydroksykumarynowych zostało zsyntetyzowanych na drodze dwuetapowej syntezy. Pierwszy etap to reakcja Knoevenagela pomiędzy aldehydami aromatycznymi a acetooctanem etylu lub acetyloacetonem. Drugi etap to addycja Michaela otrzymanego arylometylenoβ-ketoestru lub arylometyleno-2,4-pentanedionu do 4-hydroksykumaryny. Produkty są identyfikowane i charakteryzowane za pomocą 1H NMR, EI-MS, FTIR i analizy pierwiastkowej.

Badanie ich aktywności wiązania z HIV-1 PR przeprowadzono metodą dokowania molekularnego. Wykorzystano kryształ HIV-1 PR związany z peptydomimetycznym inhibitorem BEA369. Najwyższą aktywność wiązania wykazuje związek (10), według ligandów doświadczalnych (1), (2), (3) i (4) oraz związek (7), według liganda 5. Fakt ten prawdopodobnie wynika z tworzenia się wiązań wodorowych pomiędzy atomem tlenu pyranu, tlenem karbonylowym laktonu oraz jedną z grup hydroksylowych (w metapozycji) przyłączoną do pierścienia aromatycznego od strony łańcucha bocznego. Siły przyciągania van der Waalsa również przyczyniają się do dobrego wiązania.

Wszystkie sześć związków testowano pod kątem aktywności anty-HIV-1 PR w komórkach MT4 zakażonych wirusem HIV-1. Przeżywalność komórek oceniano za pomocą testu MTT, a także mierzono % inhibicji HIV-1 PR. Największą inhibicję HIV-1 PR (25%) i największą przeżywalność komórek MT4 (78%) wykazał związek (7). Związek (7) może być dalej wykorzystany jako farmakofor do syntezy nowych, bardziej aktywnych pochodnych wobec HIV-1 PR.

4. Część doświadczalna

4.1. Synteza pochodnych 4-hydroksykumaryny

4.1.1. Materiały i metody

Wszystkie materiały wyjściowe zostały zakupione od firm Merck, Sigma-Aldrich i Fluka. Są one używane bez dalszego oczyszczania. Temperatury topnienia mierzono w otwartych rurkach kapilarnych na aparacie do pomiaru temperatury topnienia Büchi 535. Widma IR zostały zarejestrowane na spektrometrze Shimadzu FT-IR 8101 M w nujolu, a częstotliwości wyrażono w cm-1. Widma 1H NMR zarejestrowano w aparacie Brucker 250 MHz w DMSO-d6 lub acetonie z użyciem TMS jako wzorca wewnętrznego (przesunięcia chemiczne podano w jednostkach ppm, stałe sprzężenia (𝐽) w Hz). Skróty są następujące: s: singlet, d: dublet, dd: dublet, dq: kwartet podwójny, dqui: kwintet podwójny, t: tryplet, i m: multiplet.

Analizę masowo-spektralną przeprowadzono metodą jonizacji elektronowej na masspektrometrze Hewlett-Packard 5973 przy 70 eV.

4.1.2. Ogólna procedura otrzymywania arylometyleno-β-ketoestrów

Aromatyczny aldehyd i etylacetoacetat w równomolowych ilościach miesza się w kolbie okrągłodennej. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się również piperydynę (0,03 mol) i lodowaty kwas octowy (0,04 mol). Miesza się ją w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Po dodaniu 20 mL eteru i/lub 150 mL wody destylowanej do mieszaniny reakcyjnej, powstają kryształy o różnych kolorach. Kryształy te są filtrowane i przemywane. Następnie suszy się je w temperaturze pokojowej i rekrystalizuje w odpowiednich rozpuszczalnikach – głównie w alkoholach (etanol, propanol i 2-propanol) i w wodzie.

4.1.3. Procedura otrzymywania 3-(4-hydroksy)-fenylometyleno-2,4-pentandionu (6)

4-Hydroksybenzaldehyd (3.66 g, 0.03 mol) i acetyloaceton (5.14 mL, 0.05 mol) miesza się w kolbie okrągłodennej. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się również piperydynę (0,03 mol) i lodowaty kwas octowy (0,04 mol). Miesza się ją w temperaturze pokojowej przez 120 minut. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 150 mL wody destylowanej. Powstają kryształy o różnych kolorach. Kryształy te są odfiltrowywane i przemywane. Następnie suszy się je w temperaturze pokojowej i rekrystalizuje w chlorku metylenu.

4.1.4. Ogólna procedura otrzymywania produktów kondensacji z 4-hydroksykumaryną

Arylydene-β-ketoester, otrzymany w poprzedniej reakcji, i 4-hydroksykumarynę miesza się w równomolowych ilościach w 25-30 mL metanolu (użytego jako rozpuszczalnik). Do reagentów dodaje się również metotlenek sodu (0,003 mol) jako środek zasadowy. Mieszaninę reakcyjną gotuje się i miesza przez 60 godzin pod chłodnicą zwrotną. Reakcję kontroluje się metodą TLC (heksan : aceton = 2 : 1 lub heksan : aceton : chloroform : metanol = 5 : 3 : 2 : 1). Po wyczerpaniu ilości reagentów ogrzewanie przerwano. Pozostałość po mieszaninie reakcyjnej odfiltrowano i przemyto gorącą wodą w celu usunięcia 4-hydroksykumaryny, która nie uległa reakcji. Następnie, pozostałość suszy się w temperaturze pokojowej i rekrystalizuje w odpowiednim rozpuszczalniku (metanol, etanol lub 2-propanol).

4.1.5. Addycja Michaela pomiędzy 3-(4-Hydroksybenzylideno)-2,4-Pentanedionem (SS-23) i 4-Hydroksykumaryną

3-(4-Hydroksybenzylideno)-2,4-pentanedion (1.02 g, 0.005 mol) i 4-hydroksykumarynę (0.81 g, 0.005 mol) miesza się w niewielkim nadmiarze 4-hydroksykumaryny w 15-25 mL metanolu. Do reagentów dodaje się również piperydynę (0,003 mol) jako środek zasadowy. Mieszaninę reakcyjną gotuje się i miesza przez 60 godzin pod chłodnicą zwrotną. Przebieg reakcji kontroluje się metodą TLC (heksan : chloroform : kwas octowy = 10 : 10 : 4, heksan : chloroform : kwas octowy = 10 : 10 : 2, heksan : aceton = 2 : 1). Po wyczerpaniu ilości reagentów ogrzewanie przerwano. Pozostałość mieszaniny reakcyjnej odfiltrowano i przemyto gorącą wodą w celu usunięcia 4-hydroksykumaryny, która nie uległa reakcji. Następnie pozostałość suszono w temperaturze pokojowej i rekrystalizowano w acetonie.

4.2. Molecular Docking

Wszystkie obliczenia dokowania molekularnego wykonano w programach Maestro Macromodel Glide z pakietu Schrodinger . Wszystkie struktury (badane doświadczalnie i nowe) są minimalizowane programem Macromodel, przy użyciu pola siłowego OPLS2005 i 5000 iteracji. Struktura rentgenowska enzymu proteazy HIV-1, wraz z inhibitorem BEA369, pochodzi z Protein Data Bank o kodzie PDB 1EBY.

4.3. Linie komórkowe i wirusy

MT-4-a ludzka zawiesinowa linia komórkowa limfoblastoidalna, uprzejmie dostarczona przez Gianfranco Pancino- Institute Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Paryż, Francja) reprezentuje klasyczny model dla doświadczalnego produktywnego zakażenia szczepem HIV-1 III B i jest używana jako rutynowy cel do badania wpływu potencjalnych inhibitorów HIV w hodowli komórkowej.

Jako źródło HIV-1 wykorzystano supernatanty linii H9/HTLV III B – dar dr R. Gallo (NIH, USA). Supernatanty zebrano i odwirowano w celu usunięcia komórek, a następnie przygotowano zapasy wirusa o znanej zawartości antygenu p24 (460 pg/mL, test mAB Murex HIV Antigen), aktywności RT (565.3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Szwecja) i zakaźności (2 × 106 zakaźnych wirionów/mL, test zakażenia mikrotitracyjnego). Komórki MT-4 i H9/HTLV III B hodowano w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS (invitrogen).

4.4. Cytotoxicity Tests and Antiviral Assays in Cell Culture

Badane związki rozpuszczano najpierw w DMSO i dalej rozcieńczano w podłożu do wzrostu komórek bez surowicy płodowej. Wszystkie roztwory były przygotowywane ex tempore.

Badano następujące parametry: stężenie cytotoksyczne 50-CC50, tam gdzie było to możliwe (stężenie zapobiegające śmierci 50% komórek MT-2), maksymalne stężenie nietoksyczne-MNC oraz stężenie hamujące 50-IC50 (stężenie hamujące o 50% replikację wirusa). CC50 i MNC wykrywano za pomocą testu absorpcji MTT. IC50 badano na komórkach MT-4 za pomocą testu mikrotitracyjnego, badając ochronę komórek przed efektem cytopatycznym HIV mierzonym testem MTT. Eksperymenty w warunkach ostrej infekcji przeprowadzono w 96 dołkowych mikropłytkach z 6-8 równoległymi próbkami/eksperyment. Kontrole komórkowe (komórki MT-4 z samą pożywką) i wirusowe (komórki MT-4 zakażone wirusem) były przeprowadzane przy każdym eksperymencie. Dla testów antywirusowych, HIV był dodawany do każdej studzienki w celu uzyskania mnogości infekcji 0.1 z wyjątkiem kontroli komórkowych. Wirus był przyłączany przez godzinę w temperaturze 37°C/5% CO2. Płytki były inkubowane przez 72-96 godzin w temperaturze 37°C/5% CO2. Po tym czasie wykonano test MTT zgodnie z opisem i zmierzono absorbancję żywych komórek kolorymetrycznie przy długości fali A540 nm. Dla wszystkich eksperymentów obliczano średnią wartość z każdej kolumny (tylko wtedy, gdy wartości w A540 nie różniły się w ±10%). Dla oznaczeń przeciwwirusowych, średnie wartości rzędów doświadczalnych i kontrolnych zostały porównane, a procent komórek chronionych (przeżywalność komórek) w odpowiednim stężeniu substancji został wykreślony w stosunku do stężenia substancji w celu uzyskania IC50. Przeżywalność komórek (% ochrony komórek) obliczano według następującego wzoru: =%celprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) gdzie 𝑋 jest średnią wartością A540 komórek zakażonych HIV poddanych działaniu odpowiedniego stężenia badanego związku; kontrola HIV jest średnią wartością A540 komórek zakażonych HIV bez dodatku jakiegokolwiek związku; kontrola komórek jest średnią wartością A540 komórek niezakażonych i nietraktowanych inhibitorem.

Jako substancji odniesienia użyto ABC (Abacavir znany nukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy-NRTI) i pepstatynę.

4.4.1. Endogenna aktywność RT i bezpośredni wpływ związków na RT

Badano ją za pomocą HS-Lenti Kit-RT assay (Cavidi, Szwecja). Zestaw zawiera rekombinowany RT (rRT) jako standard, co umożliwia ilościowe oznaczenie RT. Do oznaczenia endogennej RT badano supernatanty komórek MT-4 zakażonych/niezakażonych HIV-1 po inkubacji z/bez związków, zgodnie z wytycznymi producenta. Poziom aktywności RT w supernatancie był obliczany (w pg/mL) na podstawie standardu rRT HIV-1 zawartego w każdym zestawie. Bezpośredni wpływ związków na aktywność rRT był mierzony za pomocą tego samego zestawu i miał na celu udowodnienie, że RT jest celem działania przeciwwirusowego. Odpowiednie stopniowe rozcieńczenia inhibitora przygotowywano w buforze kontrolnym i dodawano do mieszaniny reakcyjnej. Reakcję prowadzono przez 3 godziny w temperaturze 33°C.Aktywność RT standardowych rozcieńczeń porównywano z aktywnością, do której dodawano związki lub z kontrolą (gdzie dodawano tylko mieszaninę inkubacyjną bez związków).

4.4.2. Detection of Antiprotease Activity by Tests Using Native Viral PR

Metoda opisana wcześniej przez Broglia et al., 2006 , do wykrywania aktywności rekombinowanej proteazy została zmodyfikowana w celu użycia natywnej proteazy wirusowej . Jako źródło natywnej proteazy HIV-1 wykorzystano ponownie zawiesinę stężonego wywaru wirusowego (50x) z supernatantów komórek przewlekle zakażonych H9/HTLV IIIB. Lizę cząstek wirusowych i uwolnienie aktywnego enzymu (proteazy) przeprowadzono przy użyciu buforu rozbijającego (lizującego) zawierającego 2,5% Triton X-100 w buforze fosforanowym. Zagęszczenie płynu z hodowli tkankowych zawierającego wirusa wykonano przez ultrawirowanie w Biofuge Stratos, Heraeus, przez 1 godzinę, w temperaturze 4°C i 35000 obrotów/min. Osad zawieszano ponownie w celu uzyskania 50x koncentratu w buforze rozbijającym.

Dla każdego eksperymentu przygotowano następującą mieszaninę reakcyjną : 1000 𝜇L buforu fosforanowego (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L substratu proteazy HIV III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Szwajcaria) w DMSO, przygotowanego ex tempore; 20 μL enzymu (stock HIV) pobranego z roztworu zawierającego 25 𝜇L buforu rozbijającego (lysis) + 100 μL HIV-stock, inkubowanego 40 min w 37°C przed eksperymentem.

Aktywność HIV-1 PR mierzono stosując bezpośredni odczyt spektrofotometryczny utylizacji substratu reakcji enzymatycznej przy długości fali 300 nm, w temperaturze pokojowej i długości ścieżki 1 cm, przy użyciu spektrofotometru T80 + UV-Vis (PG instruments). Początkową prędkość reakcji (V0) regulowano na poziomie 0,0020-0,0030 ΔAbs/min, zmieniając aktywność enzymu (stężenie wirusów). Badany związek oraz inhibitor referencyjny (zastosowana pepstatyna) dodawano do mieszaniny reakcyjnej przed enzymem, w celu przeprowadzenia screeningu na efekt inhibicyjny. IC50 zdefiniowano jako takie stężenie badanego związku, które powoduje zmniejszenie szybkości reakcji o 50% szybkości początkowej bez związku badanego (referencyjnego).