Użycie polimeru polietylenoiminy w hodowli komórkowej jako czynnika mocującego i wzmacniacza lipofekcji

PEI promuje mocowanie słabo zakotwiczonych komórek i tkanek pierwotnych

KomórkiPC-12 są wykorzystywane jako model różnicowania neuronów w laboratorium, ponieważ traktowanie tych komórek czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) indukuje wydłużanie neurytów i ekspresję biochemicznych markerów fenotypu neuronów współczulnych. Rosną one jako komórki słabo zakotwiczone, a kolagen lub polimery polilizyny są często używane do wstępnego powlekania płytek do hodowli komórek PC-12. Komórki PC-12 były hodowane w laboratorium w studzienkach naiwnych lub w studzienkach wstępnie pokrytych różnymi czynnikami wiążącymi (multiwell-12 tissue culture dishes), w celu zaobserwowania wpływu na zakotwiczenie komórek do podłoża. Przy braku jakiegokolwiek czynnika powlekającego, komórki wykazywały charakterystyczną tendencję do tworzenia skupisk komórek, które gromadziły się w kierunku środka studzienki; komórki te są mocno przytwierdzone między sobą, ale bardzo słabo przytwierdzone do płytki do hodowli tkanek (Figura 1D). Powoduje to bardzo niejednorodne rozmieszczenie komórek (bardzo niewiele komórek pozostaje przy krawędzi dołków) i znaczną utratę komórek podczas procedur płukania lub zmiany medium. Wstępne traktowanie płytek PEI skutkowało znacznie bardziej jednorodnym rozmieszczeniem komórek w dołkach, z komórkami mocno przylegającymi do płytki, wykazującymi znacznie mniejszą tendencję do grupowania się (Rysunek 1A). Dla porównania, płytki poddano również wstępnej obróbce innymi powszechnie stosowanymi środkami powlekającymi, kolagenem (Figura 1B) i poli-D-lizyną (PDL; Figura 1C), co również skutkowało mocniejszym przyleganiem komórek do płytek i bardziej jednorodnym rozmieszczeniem komórek.

Aby dokładniej przetestować właściwość wzmacniającą zakotwiczenie obserwowaną przy wstępnym traktowaniu naczyń hodowlanych PEI, zastosowano drugi system. Eksplantaty siatkówki z ryb teleost były używane w badaniach nad regeneracją nerwów. Gdy nerw wzrokowy ryby zostanie uszkodzony, rozpoczyna się reakcja regeneracyjna i komórki zwojowe siatkówki (RGC) ponownie wydłużają swoje aksony w kierunku tkanki docelowej. Jeśli siatkówka z takiej „zalążkowej” ryby jest eksplantowana i hodowana, odpowiedź regeneracyjna jest obserwowana in vitro poprzez przyspieszone wydłużanie się długich neurytów. Zjawisko to wymaga jednak zastosowania macierzy zewnątrzkomórkowej lub czynników adhezyjnych (np. kolagenu lub powłoki PDL), ponieważ eksplantaty wykazują bardzo niskie powinowactwo do niepowlekanej powierzchni plastikowej. Przeprowadzono eksperymenty mające na celu zaobserwowanie, czy PEI może działać jako czynnik mocujący, sprzyjający wyrastaniu aksonów z eksplantatów siatkówki zebraka. Eksplantaty siatkówki z kontrolnych oczu zebrafish były w stanie przyłączyć się do płytek hodowlanych traktowanych PEI (Figura 1E). Co więcej, eksplantaty siatkówki z ryb, które otrzymały zmianę kondycjonującą, były w stanie energicznie wysuwać aksony, gdy były hodowane przy użyciu PEI jako czynnika mocującego (Figura 1F).

Wyniki z eksplantatów siatkówki sugerowały, że komórki neuronalne przyczepione do naczyń pokrytych PEI mogą się różnicować, generując neuryty, które dobrze przyczepiają się do podłoża. Aby sprawdzić tę hipotezę z pro-neuronalnymi komórkami PC-12, przeprowadzono eksperymenty różnicowania przez traktowanie NGF z komórkami przyczepionymi do naczyń pokrytych PEI. Komórki PC-12 traktowane NGF pozostawały mocno przytwierdzone do płytki przez kilka dni, generując sieci neurytów (Figura 2). Wyniki te wskazują, że PEI sprzyja procesowi różnicowania i przyczepianiu się neurytów do płytki. Zróżnicowane komórki pozostawały mocno zakotwiczone przez cały czas trwania eksperymentów immunocytochemicznych (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García i R. P. Ballestero, wyniki niepublikowane).

Siła zakotwiczenia komórek eukariotycznych do naczyń hodowlanych poprzedzonych PEI i innymi czynnikami przywiązania

Trzy różne linie komórkowe zostały wybrane do zbadania zdolności PEI do promowania silnego zakotwiczenia do plastikowych naczyń hodowlanych. Komórki PC-12 i HEK-293 zostały opisane powyżej jako słabo zakotwiczone. Z drugiej strony, komórki MYS są pierwotnymi fibroblastami, które silnie przylegają do plastikowych płytek hodowlanych, rosnąc tak, aby utworzyć monowarstwę komórek na powierzchni. W celu zbadania siły zakotwiczenia zróżnicowanych komórek do płytek wykonano protokół, w którym przeprowadzono 4 kolejne płukania buforem izotonicznym, a następnie zastosowano kolorymetryczny protokół zliczania komórek, które pozostały na płytce (oparty na barwniku żywotnym – czerwieni obojętnej). Płytki wstępnie traktowane różnymi czynnikami przylegania porównywano z płytkami, które nie były traktowane wstępnie (untreated). Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a następnie obliczono średnią ilość barwnika zatrzymanego na płytkach, które poddano każdej obróbce. Średnie te zostały znormalizowane do średniej uzyskanej przy wstępnej obróbce PEI, której przypisano arbitralną wartość 100,0% we wszystkich eksperymentach. Wyniki reprezentatywnych eksperymentów z 3 liniami komórkowymi przedstawiono na Rysunku 3 (dla każdej linii komórkowej przeprowadzono co najmniej trzy niezależne eksperymenty). Komórki PC-12 przylegały niemal równie dobrze do płytek pokrytych PEI, kolagenem lub PDL (względna liczba komórek wynosiła 100,0% ± 5,3%, 89,3% ± 5,0% i 96,3% ± 5,8%, odpowiednio dla PEI, kolagenu i PDL). Jednakże, znaczącą utratę komórek zaobserwowano porównując płytki nie poddane działaniu PEI z płytkami poddanymi działaniu PEI, z względną liczbą komórek wynoszącą 43,9% ± 5,8% (Rysunek 3A). W przypadku HEK-293, komórki przylegały silnie zarówno do studzienek traktowanych PEI jak i PDL. W reprezentatywnym eksperymencie pokazanym na Figurze 3B, względne liczby przy tych dwóch sposobach traktowania wynosiły odpowiednio 100,0% ± 0,4% i 96,8% ± 1,7%. Jednakże duża liczba komórek została utracona, gdy umieszczono je w studzienkach nietraktowanych (względna liczba 8,3% ± 0,6%) lub w studzienkach, które wstępnie potraktowano kolagenem (11,5% ± 1,2%), co sugeruje, że komórki te przylegają dość luźno do plastiku lub do studzienek pokrytych kolagenem. Wreszcie, kiedy wykorzystano komórki fibroblastów (komórki MYS), komórki te wydawały się dość dobrze przylegać do wszystkich czterech powierzchni, włączając w to studzienki nie poddane obróbce (Rysunek 3C). Rysunek 3C przedstawia reprezentatywny wykres, pokazujący względną liczbę komórek MYS wynoszącą 100,0% ± 2,2%, 85,9% ± 7,8%, 73,7% ± 6,6% i 77,1% ± 1,4%, odpowiednio w studzienkach wstępnie traktowanych PEI, kolagenem lub PDL, lub w studzienkach nietraktowanych. Ta linia komórkowa zatem dość dobrze przyczepia się do nieprzetworzonej plastikowej powierzchni w porównaniu z liniami komórkowymi PC-12 i HEK-293.

Aby zapewnić wskazanie zmienności między doświadczeniami, średnie ± odchylenia standardowe względnej liczby komórek uzyskane w niezależnych doświadczeniach obliczono dla każdej linii komórkowej i traktowania (należy zauważyć, że ponieważ we wszystkich doświadczeniach liczbę komórek w studzienkach traktowanych PEI ustalono na 100,0%, wartość dla średniej globalnej z tym środkiem powlekającym wynosi dokładnie 100,0% dla wszystkich linii komórkowych). Poniżej przedstawiono wyniki porównawcze dla pozostałych sposobów traktowania. W przypadku komórek PC-12, względna liczba komórek wynosiła 81,5% ± 8,8% dla studzienek poddanych działaniu kolagenu (n = 4), 93,9% ± 21,2% dla studzienek poddanych działaniu PDL (n = 4) i 52,1% ± 13,7% dla studzienek niepoddanych działaniu tego środka (n = 4). Dla komórek HEK-293, względna liczba komórek wynosiła 16,3% ± 12,7% dla studzienek traktowanych kolagenem (n = 3), 99,6% ± 2,5% dla studzienek traktowanych PDL (n = 3) i 9,0% ± 4,1% dla studzienek nietraktowanych (n = 3). W doświadczeniach z komórkami MYS, średnia względnych zliczeń w studzienkach traktowanych kolagenem wynosiła 92,7% ± 16,2% (n = 3), 71,1% ± 6,7% w studzienkach traktowanych PDL (n = 3) i 78,4% ± 11,5% w studzienkach nietraktowanych (n = 3). Analiza statystyczna wskazuje, że zwiększenie adhezji zarówno komórek PC-12 jak i HEK-293 do naczyń traktowanych PEI w porównaniu z plastikiem nie traktowanym jest istotne (odpowiednio p < 0,05 i p < 0,01, analiza t-test), natomiast nie jest istotne statystycznie dla komórek MYS (p > 0,05).

Aby dalej scharakteryzować właściwości PEI jako czynnika mocującego dla słabo zakotwiczonych komórek, przeprowadzono eksperymenty w celu przeanalizowania dawki PEI, która może zapewnić optymalne zakotwiczenie komórek, zakresu liczby komórek, które mogą odnieść korzyść z obecności PEI, oraz stabilności PEI jako czynnika mocującego. Rysunek 4A przedstawia wyniki reprezentatywnego eksperymentu badającego siłę mocowania komórek HEK-293 do naczyń pokrytych różnymi dawkami PEI. Liczbę komórek znormalizowano do wartości uzyskanej dla traktowania z 25 μg/ml PEI, którą ustalono na 100,0%. Wyniki wskazują, że stężenia PEI wynoszące 2,5 μg/ml lub wyższe powodowały maksymalne wzmocnienie przyłączania, co sugeruje, że powierzchnia plastikowej szalki jest w pełni pokryta polimerem przy tych stężeniach. Wyższe stężenia polimeru nie wydawały się mieć toksycznego wpływu na komórki, jeśli nadmiar PEI pozostający w roztworze został dokładnie usunięty (lekkie efekty toksyczne obserwowano przy stężeniu 250 μg/ml, jeśli roztwór nie został całkowicie usunięty po zabiegu). Przedstawione doświadczenie jest reprezentatywne dla 4 niezależnych eksperymentów. Rysunek 4B przedstawia wyniki uzyskane z różnymi liczbami komórek PC-12 i HEK-293. Rysunek przedstawia względne liczby komórek, gdzie arbitralna wartość 100,0% została przypisana do średniej liczby uzyskanej z dołków poddanych działaniu PEI z największą liczbą każdej linii komórkowej (3,2 × 105 komórek HEK-293 i 1,5 × 106 komórek PC-12). Wyniki wskazują, że PEI działał dobrze jako czynnik mocujący w szerokim zakresie liczby komórek zarówno dla komórek PC-12 jak i HEK-293. Mniejsza liczba komórek nie mogła być wiarygodnie zbadana, ponieważ była bliska granicy czułości testu czerwieni obojętnej. Przedstawione wyniki są reprezentatywne dla co najmniej 4 niezależnych eksperymentów przeprowadzonych z każdą linią komórkową. Rysunek 4C przedstawia wyniki doświadczenia przeprowadzonego w celu zbadania stabilności PEI jako czynnika przyłączającego. W tym eksperymencie zestaw płytek potraktowano PEI, a następnie przechowywano w PBS w temperaturze 4°C przez 10 dni. W drugim teście, płytki potraktowano PEI i trzymano (z pożywką) w inkubatorze CO2 w 37°C przez 3 dni, z wymianą pożywki co 24 h. Wydajność PEI na tych płytkach porównano następnie z płytkami potraktowanymi PEI przy użyciu standardowego protokołu opisanego dla poprzednich eksperymentów. Wyniki przedstawiają względną liczbę komórek znormalizowaną do średniej absorbancji uzyskanej z płytek traktowanych standardowo PEI, której nadano arbitralną wartość 100,0%. Wyniki wskazują, że powłoka PEI pozostaje stabilna na powierzchni plastikowej szalki przez co najmniej 10 dni przechowywania w lodówce, i że nie jest usuwana przez inkubację w 37°C w pożywce, a nawet przez wielokrotne zmiany pożywki. Wyniki są reprezentatywne dla 4 niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech egzemplarzach.

Traktowanie wstępne PEI zwiększa lipofekcję słabo zakotwiczonych komórek

Transfekcja komórek eukariotycznych za pomocą lipofekcji obejmuje kilka etapów, dodawanie i wymianę mediów, co może zbierać żniwo w słabo zakotwiczonych komórkach. Nawet przy zachowaniu ostrożności w celu uniknięcia utraty komórek, słabo zakotwiczone komórki mogą być mniej wydajne w pobieraniu kompleksów transfekcyjnych. Ponieważ wstępna obróbka naczyń do hodowli komórkowych PEI zwiększyła siłę przylegania komórek do takich powierzchni, wysunięto hipotezę, że czynnik przylegania może mieć pozytywny wpływ na wydajność transfekcji uzyskanej metodą lipofekcji. Trzy opisane powyżej linie komórkowe zostały użyte do przetestowania tej hipotezy z wykorzystaniem wcześniej badanych czynników powlekających. Transfekcje przeprowadzono za pomocą plazmidu kodującego enzym reporterowy β-galaktozydazę. Wydajność transfekcji była monitorowana przez oznaczanie aktywności enzymu reporterowego w lizatach z transfekowanych komórek. Przynajmniej dwie niezależne analizy w trzech powtórzeniach przeprowadzono z każdą linią komórkową. Reprezentatywne wykresy przedstawiono na Rysunku 5. Wydajność (aktywność β-galaktozydazy) znormalizowano do aktywności uzyskanej przy wstępnym pokryciu PEI, którą ustalono jako referencyjną na poziomie 100,0%. Generalnie zaobserwowano, że wydajność transfekcji była lepsza w komórkach słabo zakotwiczonych przez wstępne powlekanie środkami promującymi przyleganie komórek do płytki. W przypadku komórek PC-12, wstępne pokrycie studzienek PEI, kolagenem lub PDL spowodowało 2- do 3-krotne zwiększenie wydajności transfekcji w stosunku do studzienek nietraktowanych: względna wydajność 100,0% ± 1,4% dla PEI, 87,0% ± 8,7% dla kolagenu i 100,1% ± 2,4% dla PDL, w porównaniu z 42,9% ± 2,2% dla studzienek nietraktowanych (Rysunek 5A). Poprawa wydajności transfekcji przez wstępną obróbkę PEI była bardziej wyraźna dla komórek HEK-293. Eksperyment na Figurze 5B pokazuje względną aktywność 21,1% ± 3,4% dla komórek w studzienkach nietraktowanych, w porównaniu do 100,0% ± 8,4% dla studzienek traktowanych PEI (około 5-krotny wzrost). Wstępne traktowanie kolagenem lub PDL spowodowało bardziej umiarkowane indukcje (około 2- do 3-krotne na Figurze 5B). Najmniejszą poprawę zaobserwowano w przypadku kolagenu, podobnie jak w przypadku mniejszego zwiększenia przyczepności komórek HEK-293, które zaobserwowano wcześniej na Figurze 3B. Wreszcie, w przypadku silnie przylegających fibroblastów MYS, nie zaobserwowano znaczącego pozytywnego efektu stosowania czynników przylegania w procedurze transfekcji. Zmienność była zwykle mniejsza niż 20% dla wszystkich warunków doświadczalnych. Reprezentatywny eksperyment pokazany na Figurze 5C w rzeczywistości wykazuje nieco wyższą wydajność transfekcji dla studzienek bez obróbki niż dla płytek poddanych obróbce PEI (względna aktywność 117,7% ± 3,2% dla studzienek bez obróbki w porównaniu do 100,0% ± 4.8% dla dołków poddanych działaniu PEI, lub około 1,2-krotnie wyższa wydajność transfekcji w kontroli).

Podsumowując wyniki wszystkich przeprowadzonych eksperymentów, średnia krotna redukcja (± odchylenie standardowe) obserwowana w wydajności transfekcji komórek PC-12 zakotwiczonych do PEI w porównaniu z komórkami na nietraktowanych studzienkach wynosiła 2.4-krotne (± 0,1-krotne; n = 3), podczas gdy wzmocnienie w przypadku komórek HEK-293 było 6,3-krotne (± 0,5-krotne; n = 2). Analiza statystyczna t-testem wskazuje, że oba wzrosty są znaczące (p < 0,05). W doświadczeniach z komórkami MYS nie zaobserwowano znaczącego wzmocnienia transfekcji, ze średnią zmianą 1,0-krotną (± 0,3-krotną; n = 2) przez wstępne traktowanie PEI (w zasadzie identyczna z wydajnością bez traktowania).