Uudet mikro-organismien eristystekniikat painottaen lasertulostusta | CDhistory

Uudet eristysmenetelmät

Tänä päivänä käytetään monenlaisia menetelmiä uusien, aiemmin viljelemättömien mikro-organismien paljastamiseksi. Erityisesti käytetään uusia ravintoalustoja, jotka sisältävät tiettyjä aineita; viljely suoritetaan erilaisissa ympäristön fysikaalisissa ja kemiallisissa olosuhteissa, kuten ilmakehän koostumuksessa, lämpötilassa ja pH:ssa. Lisäksi on tutkittu laimennettujen ravintoalustojen käyttöä yhdessä pitkien inkubaatioaikojen kanssa sekä eri lajeihin kuuluvien mikro-organismien yhteistä viljelyä. Viime vuosina on kehitetty joitakin täysin uusia viljelymenetelmiä, jotka perustuvat mikro-organismien sijoittamiseen luonnolliseen ympäristöön ilman ravintoainetta. Tällaisissa menetelmissä käytetään diffuusiokammioita ja polymeeripinnoitteita, joihin mikrobisolut sijoitetaan. Tällöin mikro-organismit saavat kaikki tarvittavat ravinteet luonnollisesta ympäristöstä ja pysyvät siitä eristettyinä. Uuden antibioottituottajan (teiksobaktiini) osoittamista tällaisilla menetelmillä pidetään tärkeänä saavutuksena. Toinen lähestymistapa käsittää kymmenien ja satojen tuhansien bakteerimikrokolonioiden samanaikaisen viljelyn ja seulonnan huokoisilla polymeeri- tai keraamisilla eristyslastuilla. Viljelemättömien mikro-organismien viljelyyn voidaan käyttää myös menetelmiä, jotka mahdollistavat yksittäisten solujen eristämisen luonnollisesta ympäristöstä. Näistä menetelmistä suosituimmat perustuvat mikro-organismisuspension laimentamiseen, virtaussytometriaan ja solujen lajitteluun, lasermikrodissektioon, lokerointiin ja mikromanipulaattoreiden käyttöön. Aiemmin viljelemättömien mikro-organismilajien viljelyn lisäksi yksittäisten mikrobisolujen eristäminen on välttämätöntä solujen fysiologian ja solujen välisten vuorovaikutusten tutkimiseksi sekä uusien aineenvaihduntatuotteiden, kuten antibioottien ja entsyymien, etsimiseksi.

Nykyaikainen tieteellinen ja teknologinen kehitys tarjoaa monia mahdollisuuksia kehittää uusia menetelmiä yksittäisten bakteerisolujen ja niiden konsortioiden viljelyyn, eristämiseen, manipulointiin ja tutkimiseen. Uudet lähestymistavat voivat nopeuttaa merkittävästi mikro-organismien kanssa työskentelyä ja mahdollistaa niiden täydellisempien ja kattavampien tutkimusten tekemisen. On huomattava, että toistaiseksi on ehdotettu hyvin vähän menetelmiä bakteeriryhmien mikrometrin tarkkuudella tapahtuvaan paikannukseen. Akselrodin ym. tutkimuksessa muodostettiin hydrogeelissä elävien solujen kolmiulotteisia (3D) verkostoja ilman, että solujen elinkelpoisuus heikkeni, käyttämällä multipleksoitujen holografisten optisten ansojen (pinsettien) rivejä ennennäkemättömällä tarkkuudella (<400 nm). Optisten ansojen muodostamiseen käytettiin kahta laseria: Ar+ -laseria (20 W, 514 nm:n aallonpituus) ja jatkuva-aaltoista Ti: Sapphire -laseria, joka on viritettävissä λ = 850-900 nm:n alueella, sekä kahden diffraktioelementin yhdistelmää, joka on yhdistetty eri linsseihin käänteisessä optisessa mikroskoopissa. Muodostui 3T3-fibroblastien verkostoja, joita ympäröi bakteerirengas. Kyky manipuloida satoja Pseudomonas aeruginosa -bakteereja samanaikaisesti kaksiulotteisissa (2D) ja kolmiulotteisissa (3D) malleissa osoitettiin myös. Holografisen optisen vangitsemisen menetelmä on erittäin tarkka, mutta teknisesti vaikea toteuttaa.

Rowan ym. tutkimuksessa ehdotetaan pintojen heterogeenisen funktionalisoinnin menetelmää, joka on nelivaiheinen litografinen prosessi, joka perustuu orgaanisten monokerrosten mikrokontaktipainatukseen, hyperhaaroitetun polymeerin implantaatioon ja sen edelleen funktionalisointiin. Tämän tuloksena saadaan rakenteita, joihin suoritetaan bakteerisolujen ohjattu inokulaatio. Solujen selviytymistä koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että solut pysyvät elinkelpoisina saaduilla strukturoiduilla pinnoilla. Saatiin suuria bakteeri-isolaatteja, jotka sisälsivät 18 ± 5 bakteeria, ja pieniä isolaatteja, jotka sisälsivät 2 ± 1 bakteeria. Tämän artikkelin mukaan esiteltyä menetelmää voidaan käyttää korkean läpimenon seulontaan ja biosensointiin. Pintojen heterogeenista funktionalisointia tällä menetelmällä on kuitenkin vaikea yhdistää rutiininomaiseen biologiseen tutkimukseen ja mikro-organismien viljelyolosuhteisiin (lämpötila, pH, ravinteet jne.). On tarpeen huomata, että eräissä julkaisuissa on ratkaistu tehtävä löytää yksinkertaisia tapoja tarjota elävien bakteerimassojen korkea resoluutio ja mahdollisuus erilaisiin biologisiin tutkimuksiin. Näissä teoksissa ehdotetut lähestymistavat ovat itse asiassa 3D-tulostuksen edelläkävijöitä.

Weibelin ym. tutkimuksessa ehdotettiin tekniikkaa, jossa elävät bakteerit leimataan agaroosilevyille. Bakteerirakenteita tulostettiin (yhden bakteeripisteen koko >200 µm) jopa 50 cm2 :n alueelle. Polydimetyylisiloksaanileimat (PDMS) valmistettiin fotolitografiatekniikalla. Tulosteen ulokkeen saavutettu vähimmäiskoko oli 190 µm 140 µm:n korkeudella, mikä on kuitenkin kaukana bakteerien erottamiseen tarvittavasta koosta. Menetelmä on nopea, toistettavissa ja kätevä, ja sitä voidaan käyttää eri bakteerien pesäkkeiden kuvion, välyksen ja suuntauksen hallintaan. Xun ym. tutkimuksessa agaroosialustalle tulostettiin eläviä bakteerirakenteita, joilla oli soluresoluutio, käyttämällä elastomeerisiä (PDMS) leimoja, joilla oli suuri kuvasuhde ja jotka saatiin aikaan käänteisellä in situ -litografiamenetelmällä (reverse in situ lithography, RISL). Kuvassa 1 esitetään RISL-menetelmän edut tavanomaiseen ultraviolettifotolitografiaan verrattuna. RISL-tekniikan ainoa rajoitus on ulokkeen halkaisija, joka tuskin voi olla <1 µm optisen diffraktiorajan vuoksi.

Bakteerirakenteiden mikrokontaktipainatusmenetelmä toimii seuraavasti: Escherichia coli -bakteeripisara kasvatusalustassa LB asetetaan agaroosigeelille (3 paino-% LB:ssä) ja agaroosialustalle muodostuu bakteerien monokerros (agaroosigeeli imee nesteen). Tämän jälkeen PDMS-leima koskettaa agaroosigeeliä peittävää bakteerien monokerrosta. Leima poistetaan, ja bakteerien osa jää sen päälle. Kun leima koskettaa agaroosigeelikerrosta (4 painoprosenttia LB:ssä, paksuus 200 µm), bakteerit siirtyvät agaroosikerrokseen. Näin voidaan muutamassa sekunnissa tulostaa E. coli -bakteeriryhmiä suoraan agaroosialustalle mikronin tarkkuudella, jopa yksittäisiä bakteereita, suurelle alueelle (cm2). Osoitettiin, että kuvion tulostamisen jälkeen bakteerit jatkavat kasvuaan ja jakautumistaan, kuten massaviljelyolosuhteissa, eli bakteerit säilyttävät normaalin fysiologisen käyttäytymisensä tulostamisen jälkeen. Lisäksi osoitettiin, että agaroosin pitoisuus on ratkaisevan tärkeä hyvän tulostustuloksen kannalta. Liian pieni pitoisuus johtaa tulostetun kuvion vääristymiseen, kun taas liian suuri pitoisuus ei sovellu bakteerien viljelyyn. Yksittäisten bakteerien muodostamien ruudukkojen saamiseksi tutkittiin, miten alkuperäisen bakteerikonsentraation pienentäminen pisarassa LB-viljelyalustaa vaikuttaa. Kun alkupitoisuudet olivat 109 ja 108 solua/ml, bakteerien keskimääräiseksi määräksi pilkkua kohti mitattiin 12,1 ja 1,4. Pienellä bakteeripitoisuudella saatiin hyvin kapea jakauma: Paikoista 44,6 prosentissa oli vain yksi E. coli -solu ja 40,1 prosentissa paikoista oli 0 tai 2 solua. Nämä tulokset osoittivat, että mikrokontaktipainatus mahdollistaa yksittäisten bakteerien säännöllisten ryhmien tuottamisen. Lisäksi osoitettiin, että tämä lähestymistapa bakteeriryhmien erotteluun mahdollistaa yksittäisten bakteeririvien kasvunopeuksien analysoinnin. Tämä menetelmä tarjoaa yksinkertaisen tavan saada aikaan mikä tahansa haluttu bakteerien alueellinen 2D-jakauma, ja sitä voidaan käyttää sekä seulontaan että bakteerien fenotyyppisen vaihtelun, populaatiodynamiikan ja ekosysteemien evoluution tutkimiseen.

Nopeasti kehittyvällä alalla – sosiomikrobiologiassa – on tunnistettu mekanismeja, joiden avulla bakteerit osallistuvat yhteistyö- ja kilpailusuhteisiin vaikuttamalla läheisiin naapureihin fyysisen kosketuksen ja yhteisen mikroympäristön kemiallisen koostumuksen muokkaamisen kautta. Pienten mikrobiaggregaattien käyttäytymisen tutkimiseksi on kehitetty erilaisia mikroprosessointitekniikoita, jotka rajoittavat bakteerien esiintymistä mikrofluidisissa laitteissa, mikroresonaattoreissa ja erittäin pienen tilavuuden nestepisaroissa. Kyky integroida analyyttiset järjestelmät mikrofluidiikkaan on tehnyt näistä eristysalustoista houkuttelevia antibioottiresistenssin korkean suorituskyvyn seulontaan ja entsymaattisen aktiivisuuden analysointiin. Esimerkiksi Eun et al. kuvaavat agaroosimikropartikkeleihin kapseloitujen bakteerisolujen korkean suorituskyvyn analyysia ja eristämistä fluoresenssiaktivoidun solulajittelun (FACS) avulla. Virtausta tarkentavia mikrofluidisia järjestelmiä käytettiin luomaan monodispersiivisiä mikropartikkeleita, joiden halkaisija on ≈30 µm. Näiden hiukkasten koko teki niistä yhteensopivia virtaussytometrian ja FACS:n kanssa, ja näiden menetelmien herkkyys vähensi solujen monistamiseen tarvittavaa inkubaatioaikaa ennen analyysien suorittamista. Mikrohiukkasten pieni tilavuus (≈1-50 pikolitraa ) minimoi bakteeritutkimuksissa tarvittavien reagenssien määrän. Tämä alusta mahdollisti bakteerien tehokkaan jakamisen ja eristämisen sekä menetelmien yhdistelmän käytön biologisesti aktiivisten pienten molekyylien kohteiden nopeaan tunnistamiseen. Menetelmän kokeellisena demonstraationa E. coli -solut kapseloitiin agaroosimikropartikkeleihin, inkuboitiin eri rifampisiinipitoisuuksien läsnäollessa ja analysoitiin FACS:n avulla. Rifampisiinin pienin inhiboiva pitoisuus määritettiin, ja spontaanit mutantit, joilla oli antibioottiresistenssi, eristettiin FACS:n avulla ja karakterisoitiin DNA-sekvensoinnilla. Tämän lähestymistavan avulla mutanttien eristämiseen tarvittava aika lyheni 8 kertaa ja antibioottien määrä 150 kertaa verrattuna perinteisiin mikrobiologisiin menetelmiin, joissa käytetään ravintoagarilevyjä. Näin ollen tämä menetelmä on tärkeä kemiallisen biologian, luonnontuotteiden kemian sekä biologisesti aktiivisten sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden löytämisen ja karakterisoinnin kannalta.

Edellä mainitut lähestymistavat ovat olleet käyttökelpoisia koon, muodon ja fysikaalisten ominaisuuksien (mikrohabitaatin) rajaamisessa; mikään niistä ei kuitenkaan ole tarjonnut mahdollisuutta määritellä bakteeriaggregaattien kolmiulotteista geometriaa tai useiden populaatioiden suuntautumista mielivaltaisesti. Lisäksi solujen kapselointiprosessi erittäin pienen tilavuuden onteloihin rajoittaa usein massan kuljetusta, mikä johtaa olosuhteisiin, jotka eivät ole yhteensopivia kasvun ja fyysisesti eristettyjen populaatioiden välisen signaloinnin kanssa. Yhä useammat todisteet korostavat mikrokolonioiden merkitystä bakteerien lisääntymisessä; kuitenkin havaitaan, että tällaisissa yhteisöissä ei ole välineitä solujen käyttäytymisen järjestelmälliseen arviointiin. Uusilla strategioilla 3D-kulttuuriympäristön luomiseksi mikroskooppisessa mittakaavassa voi olla ratkaiseva merkitys sen selvittämisessä, miten bakteerit hallitsevat antibioottiresistenssiä ja muuta sosiaalista käyttäytymistä pienissä tiheissä aggregaateissa.

Connell et al. ja Connell et al. kuvailevat menetelmää, jolla laserilla muodostetaan mikroskooppisia 3D-kammioita monifotonilitografian (multiphoton lithography, MPL) perusteella. MPL-menetelmällä on suuri läpimenokyky ja kyky tuottaa mielivaltaisia kuvioita. Se tarjoaa mahdollisuuksia 3D-mikrolaitteiden, kuten mikrooptisten komponenttien, kudostekniikan telineiden ja mikrofluidisten sirujen teolliseen tuotantoon. Connellin ja muiden tutkimuksessa naudan seerumin albumiinia (BSA), hyvin liukenevaa proteiinia, joka voidaan ristisilloittaa huokoisiksi, kestäviksi ja bioyhteensopiviksi hydrogeeleiksi, käytettiin mikroskooppisten 3D-bakteerikammioiden luomiseen. Joitakin erillisiä bakteereja suljettiin BSA-kammioihin, joiden tilavuus oli 1 pl, ja niitä kasvatettiin sitten kloonipopulaatioina. Biologisesti merkittävien molekyylien ja antibioottien diffuusion BSA:n seinämien läpi sekä kvorum-sensitiivisten signaalien vaihdon vuoksi bakteeriyhteisöjen sosiaalista käyttäytymistä tutkittiin suhteessa populaation kokoon ja tiheyteen, säiliön muotoon ja ympäristön virtausnopeuteen.

Ihmiskehossa bakteerit esiintyvät yleensä rakenteellisina 3D-yhteisöinä, jotka koostuvat useista bakteerilajeista. Jotta saataisiin yksityiskohtaista tietoa geometrian vaikutuksesta patogeenisyyteen, Connell et al. kuvaavat bakteeriyhteisöille 3D-tulostusstrategian, jossa fyysisesti erilliset mutta kemiallisesti vuorovaikutteiset populaatiot, joilla on tietty koko, muoto ja tiheys, voidaan järjestää olennaisesti mihin tahansa muotoon (kuva 2). Tätä lähestymistapaa käyttäen osoitettiin, että yhden patogeenisen bakteerilajin vakaus antibiootille saattaa lisätä toisen lajin resistenssiä niiden 3D-suhteiden vuoksi. Laserlitografiatekniikan avulla geelatiiniin suspendoitujen valittujen bakteerien ympärille muodostettiin mikroskooppisia säiliöitä, joiden tilavuus oli enintään 1 pl ja säiliön seinämän paksuus enintään 2 µm, muodostamalla polypeptidimolekyylien ristisilloittuminen polttopistealueella, mikä johtui lasersäteilyn epälineaarisesta absorptiosta valonherkistemolekyylien toimesta. Tämän multifotoniabsorption tuloksena muodostuu singlettihappea, joka stimuloi BSA:n ja gelatiinin välisiä intramolekulaarisia ja intermolekulaarisia kovalenttisia ristisilloitusreaktioita. Gelatiinin ainutlaatuiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ovat herättäneet kiinnostusta sen käyttöön erilaisissa sovelluksissa, kuten säilytyksessä, immobilisoinnissa ja bakteerien 3D-viljelyssä. Ylimääräisen reagenssin poistamisen jälkeen bakteerit paikallistetaan suljettuihin onteloihin, jotka on muodostettu ristisilloitetusta gelatiinista, joka on erittäin huokoinen materiaali ja tukee täysin suljettujen solupopulaatioiden nopeaa kasvua. Se on helposti läpäisevä polypeptideille, antibiooteille sekä fysikaalisille ja kemiallisille signaaleille, joiden avulla bakteerien välinen vuorovaikutus tapahtuu. Solujen eristäminen mikrokontteihin tarjoaa mahdollisuuksia erityyppisten/tiheydeltään erilaisten konttien upottamiseen toisiinsa sekä dynaamisiin muutoksiin koko bakteeripopulaatioiden suuntautumisessa yhteisön sisällä.

Tekijät ovat osoittaneet, että grampositiivisen Staphylococcus aureus -bakteerin ja gramnegatiivisen P. aeruginosa -bakteerin (kaksi ihmisen taudinaiheuttajaa, jotka usein muodostavat pysyviä samanaikaisia infektioita haavoissa, katetreissa ja limakalvotulehduspotilaiden keuhkoissa) spatiaalisesti lokalisoidut vuorovaikutussuhteet voivat lisätä stafylokokin eloonjäämistä β-laktaamiantibioottien hoidossa.

Mikro-3D-solujen tulostaminen laajentaa perustavanlaatuisesti mahdollisuuksia antibioottiresistenssin luotaamiseen, kun yksittäinen bakteerien mikroryhmä voi vaikuttaa viereisten ympäröivien tai upotettujen populaatioiden antibioottiherkkyyteen – asia, jolla on erityistä merkitystä in vivo -infektioissa (esim, haavat, suuontelo ja keuhkojen kystinen fibroosi), joissa kudoksia kolonisoi usein useita bakteerilajeja samanaikaisesti. Kolmiulotteisen solutulostuksen todellinen voima piilee kyvyssä järjestää mikrobiyhteisöt rajattomaan geometriaan. Mikro-3D-solutulostus voi olla myös arvokas väline ympäristöolosuhteisiin sopeutuvien reaktioiden mekanismien ja dynamiikan tutkimiseen.