Rakenteelliset implikaatiot
Kysteiinipitoisen mutanttiproteiinin (K41C) modifioinnin tuloksena bromietyyliamiinilla on entsyymi, joka on melko läheistä sukua villityyppiselle RNaasi A:lle. Silti K41S-etyyliamino-kysteiini RNaasi A:n katalyysin kcat/Km-arvo on vain 8 % villiä tyypin entsyymin kcat/Km:sta. Näiden kahden proteiinin eron täytyy johtua tioeetteriryhmän ja metyleeniryhmän välisistä eroista. Vaikka C-S-C-sidosten kulmilla on taipumus olla terävämpiä kuin C-CH2-C-sidosten kulmilla, tätä eroa kompensoi C-S-sidosten suurempi pituus.3g,14 Molekyylimallinnus osoittaa, että S-etyyliaminokysteiinin ja lysiinin primaariset amiiniryhmät voidaan asettaa päällekkäin 0,1 Å:n tarkkuudella. Merkittävämpi ero S-etyyliaminokysteiinin ja lysiinin välillä on se, että ne valitsevat suhteellisesti pikemminkin kulmia, jotka ovat kärkeviä, kuin kulmia, jotka ovat vastakkaisia.15 CC-CC-sidosten anti-konformaatiota suositaan malliyhdisteissä noin 0,8 kcal/mol.16 Keskimääräinen K41-vääristymiskulma on (175 ± 3)° RNaasi A:n kompleksissa syklisen 2′,3′-uridiinivanadaatin (U>v), oletetun siirtymätilan analogin, kanssa (kuva 2). Toisin kuin CC-CC-sidokset, CS-CC-sidosten gauche-konformaatiota suositaan 0,05-0,20 kcal/mol.17 Molekyylimallinnus osoittaa, että S-etyyliaminokysteiinijäännöksen CS-CC-sidos positiossa 41 voi olla gauche-konformaatiossa ilman, että natiiviproteiinin rakenne häiriintyy. Näin ollen tioeetterisivuketjut asemassa 41 ovat todennäköisesti vähemmän jäykkiä ja pidennettyjä kuin alkyylisivuketjut. Siksi oletamme, että S-etyyliaminokysteiini-entsyymin katalyysi ei ole yhtä tehokasta kuin villityyppisen RNaasi A:n katalyysi, koska tioeetterin kiinnittyminen all anti-konformaatioon aiheuttaa entrooppisia kustannuksia.
Rakenne RNaasi A:n aktiivisesta keskuksesta, joka on sidottu uridiini-2′,3′-sykliseen vanadattiin. Rakenne on tarkennettu 2,0 Å:n tarkkuudella röntgen- ja neutronidiffraktiotiedoista, jotka on kerätty pH 5,3:ssa kasvatetuista kiteistä. Fenyylialaniini 120:n sivuketjua ja urasiilin emästä ei ole esitetty.
Katalyyttinen tehokkuus riippuu jäännöksen 41 sivuketjun pituudesta. RNaasi A:n variantit, joissa lysiiniä pidemmän sivuketjun päässä on aminoryhmä, ovat aktiivisempia katalyyttejä kuin modifioimaton K41C RNaasi A. Näin ollen aktiivisessa keskuksessa siedetään lisäpituutta. Silti entsyymit, joissa 41-asemassa oleva aminoryhmä on erotettu pääketjusta 4 atomilla, ovat aktiivisempia kuin 5 atomilla erotetut entsyymit. Tämä tulos voi johtua pidempien sivuketjujen ylimääräisestä konformaatioentropiasta tai epäedullisista vääntökulmista.
Merkittävää etua ei saavuteta, jos jäännös 41 voi luovuttaa toisen vetysidoksen. Guanidino- ja asetamidinoryhmät voivat olla vuorovaikutuksessa samanaikaisesti useamman kuin yhden fosforyyliryhmän hapen kanssa. Esimerkiksi HIV-1:n Tat-proteiini18 ja keinotekoiset reseptorit käyttävät guanidiiniryhmää fosforyyliryhmien sitomiseen.19 Lisäksi Stafylokokin nukleaasissa ja T1-perheeseen kuuluvissa ribonukleaaseissa arginiinilla näyttäisi olevan K41:n rooli RNaasi A:ssa.20 Olemme korvanneet K41:n arginiinijäännöksellä ja S-asetamidiinijäännöksellä, joka on arginiinin lyhyt analogi. Näiden entsyymien ΔΔG‡-arvot ovat pienempiä kuin vastaavilla entsyymeillä, joilla on vain primäärinen aminoryhmä 41-aseman sivuketjussa. Näin ollen yksi vetysidos näyttää riittävän tehokkaan katalyysin aikaansaamiseksi. Tämä tulos on yhdenmukainen RNaasi A:n ja U>v:n kiteisen kompleksin kanssa (kuva 2). U>v:n vanadyyliryhmä on likimääräinen trigonaalinen kaksoispyramidi, jossa on kaksi siltaamatonta ekvatoriaalista happigeeniä, O1V ja O3V. Happi O1V hyväksyy vetysidoksen glutamiinin 11 sivuketjusta, kun taas O3V hyväksyy vetysidoksen fenyylialaniinin 120 pääketjusta. Ainoastaan O1V on sellaisessa asemassa, että se voi hyväksyä vetysidoksen K41:stä.
Mekanistiset seuraukset. Katalyyttinen tehtävä, joka K41:lle yleisimmin annetaan, on vakauttaa ylimääräinen negatiivinen varaus, joka on muodostunut ei-hylkiviin fosforyylioksigeeneihin RNA:n pilkkoutumisen aikana (kuva 2). Varautuminen voi tapahtua pentakoordinaattisessa siirtymätilassa (tai fosforaanivälitilassa), kun 2′-hydroksyyliryhmä hyökkää fosforin kimppuun matkalla kohti 5′-nukleosidin syrjäyttämistä. On oletettu, että tämä stabiloituminen tapahtuu Coulombin vuorovaikutusten avulla.12c,21 Mutta äskettäin on myös ehdotettu, että stabiloituminen tapahtuu lyhyen, vahvan vetysidoksen avulla, johon liittyy protonin osittainen siirto K41:stä.22
Lysiinijäännöksen keskeisiä ominaisuuksia ovat sen positiivinen varaus ja kyky luovuttaa vetysidoksia. Kolmella viidestä puolisynteettisestä entsyymistä sekä K41R:llä on nämä ominaisuudet. Ei ole yksinkertaista tehdä eroa pelkästään Coulombin voimiin perustuvan vuorovaikutuksen ja kahden varautuneen lajin välisiin vetysidoksiin perustuvan vuorovaikutuksen välillä. Seuraavassa esitetään yksinkertaisin selitys, joka on sopusoinnussa taulukon 1 tietojen kanssa.
Vetysidosten ja Coulombin voimien välinen ero on ilmeisin missään muualla kuin verrattaessa S-etyylitrimetyyliaminokysteiini-entsyymiä, jolla on terminaalinen positiivinen varaus, mutta jolla ei ole kykyä luovuttaa vetysidoksia, ja S-asetamidokysteiini-entsyymiä, jolla on amidin N-H potentiaalista vetysidosten luovuttamista varten, mutta jolla ei ole positiivista varausta. S-etyylitrimetyyliaminokysteiini-entsyymin alhainen katalyyttinen aktiivisuus puhuu vahvasti Coulombin voimien tehokkuutta vastaan siirtymätilan stabiloinnissa. Varauksen ja varauksen välisen vuorovaikutuksen energia pienenee vain etäisyyden käänteislukuna. Metyyliryhmät aiheuttavat suuremman etäisyyden sivuketjun positiivisen varauksen ja fosforyylioksigeenien välille kuin S-etyyliaminokysteiini-entsyymissä. Tämä etäisyys ei kuitenkaan todennäköisesti ole niin suuri, että se aiheuttaisi havaitun >103-kertaisen vähennyksen kcat/Km:ssä, varsinkin kun kolme metyyliryhmää mahtuu helposti fosforyylioksigeenien läheisyyteen (kuva 2).
Vetysidoksen voimakkuuden odotetaan korreloivan käänteisesti luovutettavan protonin pKa:n kanssa, koska vetysidokseen liittyy jonkinasteinen protoninsiirto.23 Kuten taulukosta 1 käy ilmi, pKa:n nousu vastaa ΔΔG‡:n laskua puolisynteettisissä entsyymeissä, joiden sivuketjut ovat vertailukelpoisia. Niiden puolisynteettisten entsyymien osalta, joiden sivuketjujen pituudet ovat verrattavissa lysiiniin, korrelaatio on kuitenkin epälineaarinen. Tämä epälineaarisuus voi johtua siitä, että kunkin sivuketjun pKa riippuu sen erityisestä ympäristöstä natiivissa proteiinissa. Lys41:n pKa:n on nimittäin määritetty olevan 9,0,24 eikä 10,6, kuten taulukossa 1 on esitetty butyyliammoniumionille. Eri sivuketjujen vaikutus voi olla erilainen. Toinen, ehkä merkittävämpi epälineaarisuuden lähde on se, että varatut lajit osallistuvat yleensä voimakkaampiin vetysidoksiin kuin varauksettomat lajit. Tämä ilmiö on havaittu sekä proteiineilla25 että pienillä molekyyleillä, kuten amiineilla.26 Verrattaessa puolisynteettisiä entsyymejä, joiden sivuketjut ovat isosterisia mutta joiden muodollinen varaus eroaa toisistaan, pitäisi tällaisen suuntauksen paljastua. Esimerkiksi S-asetamidinokysteiini- ja S-asetamidokysteiini-entsyymien sivuketjut asemassa 41 ovat identtiset lukuun ottamatta toista kahdesta heteroatomista, jotka ovat kiinnittyneet päätehiileen. Ero näiden kahden isologisen sivuketjun kyvyssä sitoutua siirtymätilaan on kuitenkin suurempi kuin pelkän happamuuden perusteella odotetaan. Tässä tapauksessa varautuneen asetamidiinin luovuttama vetysidos on 4 kcal/mol vahvempi kuin varautumattoman amidin luovuttama vetysidos. Tämä arvo on yhdenmukainen muiden tietojen kanssa, jotka koskevat varattujen ja varauksettomien vetysidosten suhteellista voimakkuutta proteiini-ligandi-vuorovaikutuksissa.21 Lopuksi on huomionarvoista, että vaikka S-asetamidin sivuketjulla ei ole muodollista varausta ja sen pKa on suhteellisen korkea, se vaikuttaa silti (vaikkakin vaatimattomasti) katalyysiin. Tämä tulos on lisätodiste siitä, että jäännöksen 41 luovuttama vetysidos on tärkeä katalyysille.