PEI edistää heikosti ankkuroituvien solujen kiinnittymistä ja primaaristen kudosten kiinnittymistä
PC-12-soluja käytetään laboratoriossa hermosolujen erilaistumisen mallina, koska näiden solujen käsittely hermokasvutekijällä (NGF) indusoi neuriitin laajenemista ja sympaattisen neuronin fenotyypin biokemiallisten merkkiaineiden ilmentymistä. Ne kasvavat heikosti ankkuroituvina soluina, ja kollageeni- tai polylysiinipolymeerejä käytetään usein levyjen esipäällystämiseen PC-12-soluviljelmiä varten . PC-12-soluja kasvatettiin laboratoriossa naiiveissa kuopissa tai kuopissa, jotka oli esipäällystetty erilaisilla kiinnittymistekijöillä (multiwell-12-kudosviljelymaljat), jotta voitiin tarkkailla niiden vaikutusta solujen kiinnittymiseen alustaan. Ilman päällystysainetta soluilla oli tyypillinen taipumus muodostaa soluryhmiä, jotka kerääntyvät kuopan keskelle; nämä solut ovat lujasti kiinnittyneet toisiinsa, mutta hyvin heikosti kudosviljelymaljaan (kuva 1D). Tämä johtaa solujen hyvin heterogeeniseen jakautumiseen (hyvin vähän soluja jää kuoppien reunoille) ja solujen merkittävään häviämiseen pesujen tai väliaineen vaihtamisen aikana. Levyjen esikäsittely PEI:llä johti huomattavasti homogeenisempaan solujen jakautumiseen kuoppiin, solut kiinnittyivät lujasti levyyn ja niillä oli paljon vähemmän taipumusta klusteroitumiseen (kuva 1A). Vertailun vuoksi levyt esikäsiteltiin myös muilla yleisesti käytetyillä pinnoitusaineilla, kollageenilla (kuva 1B) ja poly-D-Lysiinillä (PDL; kuva 1C), jolloin myös solujen kiinnittyminen levyihin oli kiinteämpää ja solujen jakautuminen homogeenisempaa.
PC-12-solujen ja neuronaalisten solunsalpaajalevyjen kiinnittyminen kasvatusmaljoihin. PC-12-solut kiinnittyivät paremmin muovipintoihin, jotka oli esikäsitelty ankkuroitumista edistävillä tekijöillä, kuten PEI:llä (paneeli A), kollageenilla (paneeli B) tai PDL:llä (paneeli C), verrattuna käsittelemättömän muovipinnan kontrolliin (paneeli D), jossa solut olivat rykelminä ja hyvin löyhästi kiinnittyneinä alustaan (kuvat otettiin levyn keskikohdan ja reunan puolivälissä). PEI-päällystys johti lautasen alustaan kiinteästi kiinnittyneiden solujen homogeeniseen jakautumiseen (paneeli A). PEI edistää seeprakaloista saatujen verkkokalvorakkuloiden kiinnittymistä kasvatusmaljoille (paneeli E). Tämä kiinnittymistekijä edisti neuriittien laajenemista verkkokalvon näytteissä, jotka oli alustettu aksonikasvulle näköhermon esikäsittelyvauriolla (paneeli F). Valokuvissa oleva palkki vastaa 25 μm paneeleissa A-D, 50 μm paneelissa E ja 100 μm paneelissa F.
Testaamaan tarkemmin viljelymaljojen PEI-esikäsittelyllä havaittua ankkuroitumista parantavaa ominaisuutta hyödynnettiin toista järjestelmää. Teleostikaloista saatuja verkkokalvorakkuloita on käytetty hermojen regeneraation tutkimiseen . Kun kalan näköhermoon kohdistetaan vaurio, käynnistyy regeneraatiovaste, ja verkkokalvon gangliosolut (RGC-solut) ulottavat aksoninsa uudelleen kohti tektaalista kohdekudosta. Jos tällaisesta ”pohjustetusta” kalasta peräisin oleva verkkokalvo eksplanteroidaan ja viljellään, regeneraatiovaste havaitaan in vitro pitkien neuriittien kiihtyneenä pidentymisenä. Tämä ilmiö edellyttää kuitenkin solunulkoisen matriisin tai kiinnitystekijöiden (esimerkiksi kollageenin tai PDL-päällysteen) käyttöä, koska kasvustojen affiniteetti pinnoittamattomaan muovipintaan on hyvin alhainen. Kokeissa tarkasteltiin, voisiko PEI toimia kiinnitystekijänä, joka edistäisi aksonien kasvua seeprakalojen verkkokalvorakkuloista. Verkkokalvon eksplantaatit kontrolloiduista seeprakalan silmistä pystyivät kiinnittymään PEI:llä esikäsiteltyihin kasvatusmaljoihin (kuva 1E). Lisäksi ilmastointivaurion saaneista kaloista saadut verkkokalvorakkulat pystyivät pidentämään aksoneita voimakkaasti, kun niitä viljeltiin käyttäen PEI:tä kiinnitystekijänä (kuva 1F).
Verkkokalvorakkuloilla saadut tulokset viittasivat siihen, että PEI:llä päällystettyihin astioihin kiinnittyneet hermosolut voivat erilaistua ja synnyttää neuriitteja, jotka kiinnittyvät hyvin substraattiin. Tämän hypoteesin testaamiseksi proneuronaalisilla PC-12-soluilla tehtiin NGF-käsittelyllä erilaistumiskokeita soluilla, jotka oli kiinnitetty PEI:llä päällystettyihin astioihin. NGF:llä käsitellyt PC-12-solut pysyivät lujasti kiinni lautasella useiden päivien ajan ja tuottivat neuriittiverkostoja (kuva 2). Tulokset osoittavat, että PEI sallii erilaistumisprosessin ja neuriittien kiinnittymisen lautaselle. Erilaistuneet solut pysyivät tukevasti ankkuroituneina koko immunosytokemian kokeiden ajan (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García ja R. P. Ballestero, julkaisemattomat tulokset).
PEEI:llä päällystettyihin kasvatusmaljoihin kiinnittyneiden PC-12-solujen erilaistuminen. PEI:llä päällystettyihin maljoihin kiinnitetyt PC-12-solut pysyivät lujasti ankkuroituneina levyyn ja laajensivat neuriitteja NGF:llä käsiteltäessä. Kuvissa näkyy käsiteltyjen solujen erilaistumisen eteneminen ajan kuluessa: 0 h (paneeli A), 24 h (paneeli B), 48 h (paneeli C) ja 96 h (paneeli D) 100 ng/ml NGF:llä tehdyn käsittelyn aloittamisen jälkeen. Valokuvissa palkki vastaa 25 μm.
Eukaryoottisolujen ankkuroitumisen vahvuus PEI:llä ja muilla kiinnittymistekijöillä esikäsiteltyihin viljelymaljoihin
Kolme erilaista solulinjaa valittiin testaamaan PEI:n kykyä edistää voimakasta ankkuroitumista muovisiin viljelymaljoihin. PC-12- ja HEK-293-solut on edellä kuvattu heikosti ankkuroituviksi. Toisaalta MYS-solut ovat primaarisia fibroblasteja, jotka kiinnittyvät voimakkaasti muoviviljelyastioihin ja kasvavat muodostaen pinnalle monokerroksen soluja. Erilaisten solujen ankkuroitumisen voimakkuutta levyihin testattiin protokollalla, jossa tehtiin neljä peräkkäistä pesua isotonisella puskurilla ja sen jälkeen käytettiin kolorimetristä protokollaa levyyn jääneiden solujen laskemiseksi (neutraalipunaisen elintärkeän väriaineen perusteella). Eri kiinnittymistekijöillä esikäsiteltyjä levyjä verrattiin levyihin, joita ei esikäsitelty (käsittelemättömät). Kokeet tehtiin kolmena kappaleena, ja kullekin käsittelylle altistuneisiin levyihin jääneen väriaineen keskiarvot laskettiin. Nämä keskiarvot normalisoitiin PEI-esikäsittelyllä saatuun keskiarvoon, jolle annettiin kaikissa kokeissa mielivaltainen arvo 100,0 %. Tulokset edustavista kokeista kolmella solulinjalla on esitetty kuvassa 3 (jokaisella solulinjalla tehtiin vähintään kolme riippumatonta koetta). PC-12-solut kiinnittyivät lähes yhtä hyvin PEI:llä, kollageenilla tai PDL:llä päällystettyihin levyihin (suhteelliset solumäärät 100,0 % ± 5,3 %, 89,3 % ± 5,0 % ja 96,3 % ± 5,8 % PEI:llä, kollageenilla ja PDL:llä). Merkittävää solukatoa havaittiin kuitenkin verrattaessa käsittelemättömiä levyjä PEI:llä esikäsiteltyihin levyihin, jolloin suhteellinen solumäärä oli 43,9 % ± 5,8 % (kuva 3A). HEK-293:n tapauksessa solut kiinnittyivät voimakkaasti sekä PEI:llä että PDL:llä esikäsiteltyihin kuoppiin. Kuvassa 3B esitetyssä edustavassa kokeessa suhteellinen soluluku näillä kahdella käsittelyllä oli 100,0 % ± 0,4 % ja 96,8 % ± 1,7 %. Suuri määrä soluja kuitenkin hävisi, kun ne sijoitettiin käsittelemättömiin kuoppiin (suhteellinen määrä 8,3 % ± 0,6 %) tai kuoppiin, jotka oli esikäsitelty kollageenilla (11,5 % ± 1,2 %), mikä viittaa siihen, että nämä solut kiinnittyvät melko löysästi muoviin tai kollageenipinnoitettuihin kuoppiin. Lopuksi, kun käytettiin fibroblastisoluja (MYS-solut), solut näyttivät kiinnittyvän melko hyvin kaikkiin neljään pintaan, myös käsittelemättömiin kuoppiin (kuva 3C). Kuvassa 3C esitetään edustava kaavio, jossa suhteelliset MYS-solujen lukumäärät ovat 100,0 % ± 2,2 %, 85,9 % ± 7,8 %, 73,7 % ± 6,6 % ja 77,1 % ± 1,4 % PEI:llä, kollageenilla tai PDL:llä esikäsitellyillä kaivoilla tai vastaavasti käsittelemättömillä kaivoilla. Tämä solulinja kiinnittyy siis melko hyvin käsittelemättömään muovipintaan verrattuna PC-12- ja HEK-293-solulinjoihin.
PEI-päällyste edistää heikosti ankkuroituvien solujen kiinteää kiinnittymistä alustaan. Useita pesukertoja sisältävän protokollan aiheuttama solujen häviäminen mitattiin, jotta voitiin arvioida solujen kiinnittymisen lujuutta viljelymaljoihin, jotka oli päällystetty solujen ankkuroitumista edistävillä tekijöillä. PEI:tä verrattiin muihin kiinnittymistekijöihin (kollageeni, PDL) ja käsittelemättömiin kontrollimaljoihin. Suhteelliset solumäärät normalisoitiin antamalla PEI:llä esikäsitellyille astioille mielivaltainen arvo 100,0 %. PEI-pinnoite lisäsi merkittävästi ankkurointivahvuutta PC-12-soluissa (kaavio A) ja HEK-293-soluissa (kaavio B), ja se oli parempi kuin muut yleisesti käytetyt kiinnitystekijät. Vahvasti ankkuroituvan solulinjan (MYS-solut, kuvaaja C) kiinnittymisessä ei havaittu etuja. Pylväät osoittavat keskiarvon ± keskihajonnan kolminkertaisista määrityksistä, jotka edustavat vähintään kolmea eri suoritettua koetta (* merkitsevästi korkeampi kuin käsittelemätön kontrolli, p < 0,01; ** merkitsevästi korkeampi kuin käsittelemätön kontrolli esitetyssä kokeessa, p < 0,01, mutta merkitsevyys ei säilynyt itsenäisissä kokeissa).
Jotta saataisiin viitteitä kokeiden välisestä vaihtelusta, riippumattomissa kokeissa saatujen suhteellisten solulukujen keskiarvot ± keskihajonnat laskettiin kullekin solulinjalle ja käsittelylle (huomaa, että koska PEI:llä esikäsiteltyjen kuoppien lukumääräksi asetettiin kaikissa kokeissa 100,0 %, kokonaiskeskiarvon arvo tällä pinnoitusaineella on täsmälleen 100,0 % kaikkien solulinjojen osalta). Muiden käsittelyjen vertailutulokset esitetään jäljempänä. PC-12-solujen suhteelliset lukumäärät olivat 81,5 % ± 8,8 % kollageenilla esikäsitellyissä kuopissa (n = 4), 93,9 % ± 21,2 % PDL:llä esikäsitellyissä kuopissa (n = 4) ja 52,1 % ± 13,7 % käsittelemättömissä kuopissa (n = 4). HEK-293-solujen suhteelliset lukumäärät olivat 16,3 % ± 12,7 % kollageenilla esikäsitellyissä kaivoissa (n = 3), 99,6 % ± 2,5 % PDL:llä esikäsitellyissä kaivoissa (n = 3) ja 9,0 % ± 4,1 % käsittelemättömissä kaivoissa (n = 3). MYS-soluilla tehdyissä kokeissa suhteellisten lukumäärien keskiarvo kollageenilla esikäsitellyillä kaivoilla oli 92,7 % ± 16,2 % (n = 3), 71,1 % ± 6,7 % PDL:llä esikäsitellyillä kaivoilla (n = 3) ja 78,4 % ± 11,5 % käsittelemättömillä kaivoilla (n = 3). Tilastollinen analyysi osoittaa, että sekä PC-12- että HEK-293-solujen adheesion paraneminen PEI-käsiteltyihin astioihin verrattuna käsittelemättömään muoviin on merkittävää (p < 0.05 ja p < 0.01 vastaavasti, t-testianalyysi), kun taas se ei ole tilastollisesti merkitsevä MYS-solujen osalta (p > 0.05).
Jotta PEI:n ominaisuuksia heikosti ankkuroituvien solujen kiinnitystekijänä voitaisiin luonnehtia tarkemmin, tehtiin kokeita, joissa analysoitiin PEI:n annostusta, joka voi tarjota optimaalisen solujen ankkuroitumisen, sellaisten solujen lukumäärän vaihteluväliä, jotka voivat hyötyä PEI:n läsnäolosta, ja PEI:n vakautta kiinnitystekijänä. Kuvassa 4A esitetään tulokset edustavasta kokeesta, jossa testattiin HEK-293-solujen kiinnittymisen voimakkuutta PEI:n eri annoksilla päällystettyihin astioihin. Solujen lukumäärät normalisoitiin arvoon, joka saatiin 25 μg/ml PEI:tä sisältävällä käsittelyllä, jonka arvoksi asetettiin 100,0 %. Tulokset osoittavat, että PEI:n pitoisuudet 2,5 μg/ml tai suuremmat pitoisuudet johtivat maksimaaliseen kiinnittymisen tehostumiseen, mikä viittaa siihen, että muovimaljan pinta on täysin päällystetty polymeerillä näillä pitoisuuksilla. Suuremmilla polymeeripitoisuuksilla ei näyttänyt olevan myrkyllisiä vaikutuksia soluihin, jos liuokseen jäänyt ylimääräinen PEI poistettiin perusteellisesti (lieviä myrkyllisiä vaikutuksia havaittiin 250 μg/ml:n pitoisuudella, jos liuosta ei poistettu kokonaan käsittelyn jälkeen). Kuvassa oleva koe edustaa neljää riippumatonta koetta. Kuvassa 4B esitetään PC-12- ja HEK-293-solujen eri määrillä saadut tulokset. Kuvassa esitetään suhteelliset soluluvut, joissa mielivaltainen arvo 100,0 % määritettiin keskimääräiselle lukumäärälle, joka saatiin PEI:llä käsitellyistä kuopista, joissa oli suurin määrä kutakin solulinjaa (3,2 × 105 HEK-293-solua ja 1,5 × 106 PC-12-solua). Tulokset osoittavat, että PEI toimi hyvin kiinnittymistekijänä laajalla solumäärän vaihteluvälillä sekä PC-12- että HEK-293-solujen osalta. Pienempiä solumääriä ei voitu testata luotettavasti, koska ne olivat lähellä neutraalipunamäärityksen herkkyysrajaa. Esitetyt tulokset edustavat vähintään neljää riippumatonta koetta, jotka on tehty kullakin solulinjalla. Kuvassa 4C esitetään tulokset kokeesta, jolla testattiin PEI:n pysyvyyttä kiinnittymistekijänä. Tässä kokeessa sarja levyjä käsiteltiin PEI:llä ja pidettiin sitten PBS:ssä 4 °C:ssa 10 päivän ajan. Toisessa kokeessa levyt käsiteltiin PEI:llä ja niitä pidettiin (väliaineen kanssa) 37 °C:n CO2-inkubaattorissa 3 päivän ajan siten, että väliaine vaihdettiin 24 tunnin välein. PEI:n suorituskykyä näillä levyillä verrattiin sitten PEI:llä käsiteltyihin levyihin edellisissä kokeissa kuvatun standardiprotokollan mukaisesti. Tulokset osoittavat suhteelliset solumäärät, jotka on normalisoitu PEI:llä käsitellyillä standardilevyillä saatujen absorbanssien keskiarvoon, jolle annettiin mielivaltainen arvo 100,0 %. Tulokset osoittavat, että PEI-päällyste pysyy vakaana muovilautasen pinnalla vähintään 10 päivän ajan jäähdytyksen jälkeen ja että se ei poistu inkuboimalla 37 °C:n lämpötilassa elatusaineessa tai edes toistuvilla elatusaineen vaihdoilla. Tulokset ovat edustavia neljästä riippumattomasta kokeesta, jotka tehtiin kolmena kappaleena.
PEI:n ominaisuuksien karakterisointi kiinnittymistekijänä. Kaavio A: PEI:n kasvavia annoksia testattiin optimaalisen pinnoituksen mahdollistavan pitoisuusalueen määrittämiseksi. PEI osoitti täydellistä kiinnittymisen tehostumista pitoisuuksilla 2,5 μg/ml ja suuremmilla pitoisuuksilla. Kaavio B: PEI edisti sekä PC-12- että HEK-293-solujen kiinnittymistä laajalla solumäärän vaihteluvälillä (testatut solumäärät on merkitty X-akselille). Kuvaaja C: PEI-pinnoite pysyi vakaana kasvatusmaljan pinnalla pitkien inkubaatiojaksojen ja väliaineen vaihtojen aikana (10d-PBS: PEI:llä käsitelty astia inkuboitiin 10 päivää PBS:ssä 4 °C:ssa; 96 h-3MC: PEI:llä käsitelty astia inkuboitiin 96 tuntia, jolloin väliaine vaihdettiin 3 kertaa 37 °C:ssa). Kaikissa kuvaajissa pylväät osoittavat vähintään 3:n riippumattoman kokeen edustavien kolmoismääritysten keskiarvon ± keskihajonnan (* merkittävästi korkeampi kuin käsittelemätön kontrolli, p < 0,01).
PEI-esikäsittely tehostaa heikosti ankkuroituvien solujen lipofektiota
Eukaryoottisolujen transfektio lipofektiolla sisältää useita vaiheita, väliaineen lisäyksiä ja vaihtoja, jotka voivat vaatia veronsa heikosti ankkuroituvissa soluissa. Vaikka solukatoa vältetäänkin, heikosti ankkuroituneet solut saattavat ottaa transfektiokompleksit huonommin vastaan. Koska soluviljelymaljojen PEI-esikäsittely lisäsi solujen kiinnittymislujuutta tällaisiin pintoihin, oletettiin, että kiinnittymistekijällä voi olla myönteinen vaikutus lipofektiolla saatuihin transfektiotuloksiin. Tätä hypoteesia testattiin edellä kuvatuilla kolmella solulinjalla käyttäen aiemmin tutkittuja pinnoitusaineita. Transfektiot suoritettiin plasmidilla, joka koodaa reportterientsyymiä β-galaktosidaasia. Transfektion tuottoa seurattiin määrittämällä toimittajaentsyymin aktiivisuus transfektoitujen solujen lyseaatista. Kullekin solulinjalle tehtiin vähintään kaksi riippumatonta määritystä kolmena kappaleena. Edustavat kuvaajat on esitetty kuvassa 5. Saannot (β-galaktosidaasiaktiivisuus) normalisoitiin PEI-esipäällystyksellä saatuun aktiivisuuteen, joka asetettiin vertailuksi 100,0 prosenttiin. Yleisesti havaittiin, että transfektiotuotos parani heikosti ankkuroituvissa soluissa esipinnoittamalla ne aineilla, jotka edistävät solujen kiinnittymistä levyyn. PC-12-solujen tapauksessa kuoppien esipäällystäminen PEI:llä, kollageenilla tai PDL:llä paransi transfektiotuotosta 2-3-kertaisesti käsittelemättömiin kuoppiin verrattuna: suhteellinen tuotto oli 100,0 % ± 1,4 % PEI:llä, 87,0 % ± 8,7 % kollageenilla ja 100,1 % ± 2,4 % PDL:llä, kun taas käsittelemättömien kuoppien suhteellinen tuotto oli 42,9 % ± 2,2 % (kuva 5A). Transfektiotuoton paraneminen PEI-esikäsittelyn avulla oli selvempää HEK-293-soluissa. Kuvassa 5B esitetyssä kokeessa suhteellinen aktiivisuus oli 21,1 % ± 3,4 % käsittelemättömissä kuopissa oleville soluille verrattuna 100,0 % ± 8,4 %:iin PEI-esikäsitellyissä kuopissa (noin 5-kertainen lisäys). Esikäsittely kollageenilla tai PDL:llä johti vaatimattomampiin induktioihin (noin 2- tai 3-kertainen kuvassa 5B). Pienin parannus havaittiin kollageenilla, samoin kuin aiemmin kuvassa 3B havaittu HEK-293-solujen kiinnittymisen vähäisempi tehostuminen. Vahvasti kiinnittyvien MYS-fibroblastien osalta ei myöskään havaittu merkittävää positiivista vaikutusta käyttämällä kiinnittymistekijöitä transfektiomenetelmässä. Vaihtelut olivat yleensä alle 20 % kaikissa koeolosuhteissa. Kuvassa 5C esitetty edustava koe osoittaa itse asiassa hieman suuremman transfektiotuoton käsittelemättömien kuoppien kuin PEI:llä esikäsiteltyjen levyjen osalta (suhteellinen aktiivisuus 117,7 % ± 3,2 % käsittelemättömien kuoppien osalta verrattuna 100,0 % ± 4,0 %.8 % PEI:llä esikäsiteltyjen kuoppien osalta eli noin 1,2-kertainen transfektiotuotto kontrolliin verrattuna).
PEI tehostaa heikosti ankkuroituvien solujen transfektiota. Transfektiotuotokset määritettiin β-galaktosidaasimäärityksillä ja normalisoitiin tuottoihin, jotka saatiin, kun viljelymalja oli päällystetty PEI:llä (jolle annettiin mielivaltainen arvo 100,0 %). PEI ja muut kiinnitystekijät tehostivat löyhästi kiinnittyvien solulinjojen, kuten PC-12-solujen (kaavio A) ja HEK-293-solujen (kaavio B), transfektiota. Tiiviisti kiinnittyvillä soluilla, kuten MYS-fibroblasteilla, ei havaittu merkittävää vaikutusta (kuvaaja C). Pylväät kuvaavat vähintään kahta riippumatonta koetta edustavien kolmoismääritysten keskiarvoa ± keskihajontaa (* merkitsevästi korkeampi kuin käsittelemätön kontrolli, p < 0,01).
Kokoamalla kaikkien suoritettujen kokeiden tulokset yhteen, PEI:hen ankkuroitujen PC-12-solujen transfektiotuotoksessa havaittu keskimääräinen moninkertaistuminen (± keskihajonta) verrattuna käsittelemättömillä kuopilla oleviin soluihin oli 2.4-kertainen (± 0,1-kertainen; n = 3), kun taas parannus HEK-293-soluilla oli 6,3-kertainen (± 0,5-kertainen; n = 2). t-testin tilastollinen analyysi osoittaa, että molemmat lisäykset ovat merkitseviä (p < 0,05). MYS-soluilla tehdyissä kokeissa ei havaittu merkittävää transfektion tehostumista, ja PEI:llä esikäsiteltyjen solujen keskimääräinen muutos oli 1,0-kertainen (± 0,3-kertainen; n = 2) (periaatteessa identtinen saannon kanssa ilman käsittelyä).